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Validación mét. cuanti semic-cuali lab. clínico 21-07-2012

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Validación mét. cuanti semic-cuali lab. clínico 21-07-2012

  1. 1. Validación Métodos Analíticos Cuantitativos, Cualitativos y Semicuantitativos en el Lab. ClínicoRigoberto Marcelo Yáñez Vera Julio 2012
  2. 2. Norma NCh2547.Of2008 (ISO 15189)• 5.5 Procedimientos Analíticos.• 5.5.2 El laboratorio debe usar sólo procedimientos validados. VALIDAR VERIFICAR
  3. 3. Validación “Confirmación mediante el examen y la obtención de evidencias objetivas que aseguran el cumplimiento de una serie de requerimientos particularmente definidos para aplicaciones concretas”(ISO 8402-1994 o NCh2000 – ISO 8402).
  4. 4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS CUANTITATIVOSParámetros de calidad (desempeño analítico):- LINEALIDAD- EXACTITUD: -PRECISIÓN: *Repetibilidad *Reproducibilidad -VERACIDAD, Trazabilidad- INCERTIDUMBRE-SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD/INTERFERENCIAS- SENSIBILIDAD- LÍMITE DE DETECCIÓN- LÍMITE CUANTIFICACIÓN- ROBUSTEZ
  5. 5. ANÁLISIS CUANTITATIVO LLRespuesta del instrumento LC LD Intervalo LL = L. de linealidad LC = L. de Cuantificación lineal LD = L. de Detección Concentración
  6. 6. ANÁLISIS CUANTITATIVO-LINEALIDADCapacidad del método analítico de obtenerresultados linealmente proporcionales entre laconcentración del analito y su respuesta. Análisis estadístico: *Curva regresión y = a + b x *Coeficiente de determinación r2 *Análisis de varianza (regresión) con Si p>0,05 es significativo y por Estimación falta de ajuste ende los datos Error residual puro.tienden a ser lineales.
  7. 7. ETAPAS DE LA REGRESIÓN1 Selección del modelo: Normalmente una línea recta y=a +bx (donde a es la pendiente de la recta y b la ordenada al origen)2 Establecimiento del diseño experimental:  dominio experimental: rango de concentraciones  distribución de las medidas  número de medidas3 Estimación de los parámetros del modelo. Regresión por mínimos cuadrados.4 Validación del modelo: ANOVA
  8. 8. Linealidad: Curva de Calibración IgG INMUNONEFELOMETRÍA Concentración (mg/dL) Medición 1 Medición 2 X log(X) Y log(Y) Y log(Y) 11,675 1,067 1263 3,101 948 2,977 5,8375 0,766 935 2,971 672 2,827 2,9188 0,465 665 2,823 408 2,611 1,4594 0,164 408 2,611 215 2,332 0,7297 -0,137 207 2,316 103 2,013 0,3648 -0,438 120 2,079 35 1,544Medición instrumental (señal): intensidad de la luz dispersadapor los complejos antígenos-anticuerpos.
  9. 9. CURVA CALIBRACION IgG 1200 1000 800LECTURA 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACION mg/dL
  10. 10. CURVA CALIBRACION IgG INMUNONEFELOMETRÍA 3.4 3.2 3log lectura 2.8 2.6 2.4 2.2 2 -0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1 log conc.
  11. 11. ExactitudGrado de concordancia entre el resultadode una medición y el valor de referenciaaceptado o verdadero.* Nota: El término “exactitud” cuando se aplica a unconjunto de resultados de mediciones implica lacombinación de los componentes aleatorios y de unerror sistemático común o de un componente de sesgo(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)
  12. 12. Exactitud (Norma ISO 3534-1)-Precisión: grado de concordancia entreresultados de mediciones obtenidasindependientes bajo condiciones establecidas(repetibilidad y reproducibilidad).-Veracidad: grado de concordancia entre el valormedio obtenido a partir de una serie deresultados y un valor de referencia aceptado. Exactitud = Precisión + Veracidad
  13. 13. PrecisiónLa precisión depende sólo de la distribución de erroresaleatorios y no tiene ninguna relación con el valorverdadero o el valor especificado. -Repetibilidad -Precisión intermedia o reproducibilidadintralaboratorio -Reproducibilidad(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)
  14. 14. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓNPRECISIÓN:Grado de concordancia entre resultados demediciones obtenidas de una serie repetida deanálisis, sobre una muestra homogénea, bajocondiciones establecidas (Norma ISO 3534). REPETIBILIDAD: Es la medida de la precisión de un método efectuado en las mismas condiciones, sobre el mismo analito, con el mismo método, con el mismo operador, utilizando el mismo instrumento de medida y durante un corto intervalo de tiempo.
  15. 15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA PRECISIÓN Media• Desviación estándar• Coeficiente de variación• Análisis de varianza F (comparación de la desviación estándar) Estudio homogeneidad muestra: • Análisis de varianza (F) • Prueba de “t”de Student.
  16. 16. REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA LA DETERMINACIÓN IgG (Homogeneidad Muestra) Muestra Contramuestra n 6 6 Media 1557.50 1554.67 s 52.129 82.199 CV 3.347 % 5.287 %“t” calculado = 0.0713 < “t” tabla 5;0.025 = 2.571No existe diferencia estadística significativa y por lo tanto lasmuestras son iguales y homogéneas.
  17. 17. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓNPRECISIÓN REPRODUCIBILIDAD: Es la medida de la precisión de los resultados de un método analítico efectuado sobre el mismo analito, pero en condiciones diferentes (diferentes equipos utilizados, el operador, el período de tiempo, etc.)
  18. 18. REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA DETERMINACIÓN DE IgG IgG mg/dL DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 1556 1568 1564 1568 1543 1606 1624 1556 1585 1481 1598 1556 1598 1602 1535 1518 1413 1568
  19. 19. REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA DETERMINACIÓN DE IgG n 18 (en tres dìas diferentes) media 1557.72 Si F < P no existe DE 12.27 diferencia estadística CV 0.8 % significativa en las mediciones Precisión 99.2 % de los grupos. Análisis de Varianza--------------------------------------------------------------------------------------Fuente var. SC gl CM F P--------------------------------------------------------------------------------------Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626Intra grupos 40682,8 15 2712,19--------------------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 42179,6 17
  20. 20. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓNVERACIDAD:Grado de concordancia entre el valor medioobtenido de una serie de resultados y el valorde referencia aceptado (certificado). Norma ISO3534 Análisis estadístico Media experimental Desviación estándar experimental Prueba de “t” de Student
  21. 21. VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA PARA DETERMINACIÓN DE IgGMRC DB Lote 084705IgG mg/dLn = 10 931,8 942,3 951.8 924,8 Media experimental 930.9 918,6 Media certificada 925.0 927.1 920,5 938,4 935,2 918,8
  22. 22. VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA PARA DETERMINACIÓN DE IgG Valor exp. MRCmedia 930,9 925s (DE) 11,0545“t” calculado = 1,6963 <“t” (tabla) 9;0.025 = 2,262 p = 0,124 ( Χ − μ) × n t = n - 1, α/2 sSe acepta la hipótesis de nulidad Ho. Existe trazabilidad
  23. 23. IncertidumbreMagnitud asociada con el resultado demedición que caracteriza la dispersión de losvalores que razonablemente podrían serasignados al mesurando.
  24. 24. Incertidumbre-Incertidumbre estándar:Incertidumbre de un resultado de medición expresadacomo desviación estándar.-Incertidumbre estándar combinada:Incertidumbre estándar como resultado de unaestimación mediante la propagación de errores conbase en las incertidumbres individuales.-Incertidumbre expandidaIncertidumbre estándar que se expresa como unintervalo de confianza.
  25. 25. CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE EXPANDIDA sU ( x ) = ±t α/2; n - 1 × n  gl = n - 1 (grado libertad)  nivel α = 0,05U MRC IgG exp. = ± 7,9 mg/dL
  26. 26. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓNSELECTIVIDAD / ESPECIFICIDADCapacidad del método analítico para medir enforma exacta un analito particular dentro de unamezcla compleja, sin interferencia de otrassustancias o analitos. Magnitud influyente, magnitud que no es el mesurando pero afecta al resultado de la medición (interferencia).
  27. 27. Interferencia de la SeñalAlgunos compuestos presentes en la muestrapor un artefacto aumentan o disminuyen lamagnitud del mecanismo de detección.Ejemplos:Fluoresceína, EDTA , Azida de Sodio, Lípidos,Complemento, Fibrinógeno, Albúmina
  28. 28. Detección y Control de Interferencias• Son difíciles de detectar pues se desconoce el resultado verdadero. Se obtienen de los datos del fabricante o de literatura. El laboratorio debe establecer requisitos de ausencia de interferencia para valores definidos de las magnitudes.• Verificar resultados de pacientes con condiciones clínicas asociadas con interferencias (enfermedades hepáticas, fallas renales, embarazo, incongruencias con cuadro clínico).• Inspeccionar las muestras visualmente buscando hemólisis, ictericia, lipemia o evaluarlas usando indicadores séricos.
  29. 29. ESTUDIO DE INTERFERENCIAS1 Prueba de dilución lineal (las interferencias no se comportan linealmente con la dilución).2 Analizar la muestra por otro método (comparación de métodos).3 Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir sustancias potencialmente interferentes.4 Análisis de muestras enriquecidas con el interferente.
  30. 30. ANÁLISIS CUANTITATIVO LLRespuesta del instrumento LC LD Intervalo LL = L. de linealidad LC = L. de Cuantificación lineal LD = L. de Detección Concentración
  31. 31. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓNSENSIBILIDAD Es la capacidad de un método analítico de registrar ligeras variaciones de la concentración. b γ= γ = Sensibilidad b = Pendiente obtenida desde la regresión lineal. sm Sm = desviación estándar de la muestra.
  32. 32. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓNLÍMITE DE DETECCIÓN (LD)Menor concentración o cantidad de analitodetectable con razonable certeza por unprocedimiento analítico dado. Concentración queproporciona una señal en el instrumentosignificativamente diferente de una muestra blanco. Ybl = señal promedio del blanco. y + 3 * s bl Sbl = desviación estándar del blanco.LD = bl b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del analito. b
  33. 33. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓNLÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC)Es la menor concentración de analito que puededeterminarse con precisión y exactitud razonablesen las condiciones establecidas y se expresa enunidades de concentración. Ybl = señal promedio del blanco. ybl + 10 * s bl Sbl = desviación estándar del blanco.LC = b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del analito. b
  34. 34. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓNROBUSTEZ: Grado de concordancia de los resultados al efectuar cambios en las condiciones operativas y ambientales normalizadas del método.
  35. 35. ROBUSTEZ Capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee información de su comportamiento en la rutina. Parámetros estudiar: - Efectos del congelado-descongelado - Tiempos de incubación - Cambio pH tampones - Temperaturas de incubación - Longevidad de los reactivos - Preparación de la muestra - Conservación de la muestra.
  36. 36. NORMA NCh 2446.Of1999– Guía para lavalidación de métodos de ensayo – Principios y conceptosgenerales5 Procedimiento de validación5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos deacreditación deben contar con procedimientos y directricespara planificar y controlar el proceso de validación demétodos de ensayo. Sin embargo, la discusión anterior haindicado claramente que no puede desarrollarse unprocedimiento único. En consecuencia, tiene quedesarrollarse una gama de diferentes alternativas de técnicasde validación. Cuán detallada deba ser la validación, dependede las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades,riesgos, etc.).
  37. 37. DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de Bioq. Clín. y Patología MolecularSOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIAOBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS:El Laboratorio Clínico debería establecer requisitos y verificar, almenos las siguientes características metrológicas:1.-Error sistemático (sesgo). El fabricante del calibrador deberáproporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado.Deberá proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados.Sin embargo, el Laboratorio debería obtener sus evidencias que elproceso proporciona resultados satisfactorios.2.-Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deberáproporcionar la información de las interferencias.
  38. 38. DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de Bioq. Clín. y Patología MolecularSOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIAOBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS:3.-Imprecisión interdiaria (reproducibilidad). ResponsabilidadLaboratorio.4.-Límite de detección. El fabricante deberá propocionarespecificaciones de imprecisión, sensibilidad y límite de detección.El Laboratorio debería estudiar el límite de detección cuandoobserva diferencia.5.-Contaminación6.-Verificar dilución
  39. 39. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos (JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)Recomendación de validación de métodos de acuerdoa la complejidad de la prueba o determinación:-Pruebas de mínima complejidad (waived tests). Nohay recomendación para la validación de método.Seguir directrices del fabricante.
  40. 40. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos (JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobadospor el FDA los estudios de validación de métodos deberian seguir lassiguientes recomendaciones: -Verificar los parámetros de calidad o especificaciones de desempeño(demostrar resultados comparables a los establecidos por el fabricante): -Exactitud -Precisión -Rango de los resultados analíticos reportado por el método -Verificar que los intervalos de referencia del fabricante sonapropiados para la población de pacientes del laboratorio.
  41. 41. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos (JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobadospor el FDA Actividades a realizar por el laboratorio: -Comparación de métodos para estimar la inexactitud o sesgo. -Replicar muestra o control para estimar la imprecisión -Hacer estudio de linealidad para estimar el rango de la determinación reportado por el fabricante -Obtener valores de referencia para verificar intervalo de referencia indicado por el fabricante
  42. 42. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos (JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados odesarrollados en el laboratorio, la validación de los métodos requiere: -Exactitud -Precisión -Sensibilidad analítica -Especificidad analítica, incluyendo el estudio de sustanciasinterferentes -Rango de los resultados analíticos reportado por el método -Intervalo de referencia (valores normales) -Cualquier otro parámetro requerido para el desempeño del método
  43. 43. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos (JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)-Pruebas moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados odesarrollados en el laboratorioActividades a realizar por el laboratorio: -Comparación de métodos para estimar la inexactitud o sesgo. -Replicar muestra o control para estimar la imprecisión -Hacer estudio de linealidad para estimar el rango a reportar -Límite de detección para estimar interferencias permanentes -Experimentos de recuperación para estimar proporción deinterferencias -Obtener valores de referencia para estimar el intervalo de referencia
  44. 44. Métodos Cualitativos y/o Semicuantitativos• En los laboratorios de análisis se generan cada vez más mediciones que dan respuesta rápidas de tipo cualitativo.• Respuesta de tipo binario: Si / No . • Presencia o ausencia de determinado analito. • Presencia o ausencia de un determinado nivel del analito.• Se denominan sistemas de “screening”.
  45. 45. Sistemas de Screening• Muchas veces se utilizan como una etapa previa para luego realizar un análisis cuantitativo y confirmatorio.• Evita análisis cuantitativos a muestras que dan negativo.• A nivel microbiológico generalmente en identificación bacteriana son diagnósticos y no presuntivos.
  46. 46. Análisis Cualitativo Método Confirmatorio Sistema de Análisis tamizaje cuantitativo SI (screening) Presencia del analito> 2 ng/mL Ausencia del analito< 2 ng/mL •Menor experimentación. NO •Decisión rápida. •De fácil manejo, portátiles, etc. •Sin necesidad de equipos. No se •Ahorro. analiza
  47. 47. Sistemas de Medida Cualitativos Análisis cualitativo clásico o sensorial:  Color: cambio, aparición.  Olor.  Turbidez.  ELISA.  Crecimiento bacteriano. Detección instrumental:  UV: fluorescencia, potenciometría.  Sensores: químicos, bioquímicos, etc.  ELISA.
  48. 48. Análisis Cualitativo Clásico o Sensorial• La respuesta binaria SI / NO se obtiene directamente.• En general la presencia del analito se determina por comparación con un blanco. • Pruebas baterías bioquímicas• Se encuentran también las pruebas de Kits. • Son dispositivos comerciales para pruebas concretas. • Contienen todos los reactivos necesarios. • Pueden contener algún instrumento sencillo.
  49. 49. Análisis Cualitativo Clásico o Sensorial• Pruebas de kits: • Látex para serotipificar Streptococcus. • Tiras de orina. • Pruebas rápidas para meningitis bacterianas. • API. • Método de CIM por microdilución en microplacas. • Coaglutinación. • Método ELISA rápido para detección C. difficile
  50. 50. Análisis Cualitativo Sensorial• La determinación se hace mediante una medida instrumental: • Colorimetría. • Fluorescencia.• La presencia o no de un determinado analito puede ser el nivel límite de detección o a un nivel superior.
  51. 51. Análisis Cualitativo Sensorial• La respuesta instrumental que se obtiene se transforma en respuesta binaria SI/NO e implica un tratamiento de datos.• Primero hay que establecer la respuesta instrumental: • Valor de absorbancia para la concentración correspondiente. • Si el valor es superior la respuesta es Si. • Ej. Métodos automatizados para Hemocultivos. • Ej. Métodos automatizados para CIM. • Ej. Estandarización automatizada a 0,5 MF.
  52. 52. Método de ELISA• Método Semicuantitativo.• Se basan en una reacción inmunológica.• La detección puede ser sensorial o instrumental.• Ej. Bacterias: C. difficile, E. coli .• Ej. Virus: Hepatitis, SIDA, Sarampión, etc.• Ej. Parásitos: Chagas• Autoinmunidad: ENA, AAN, DNA, etc.
  53. 53. Validación Métodos Cualitativos• Métodos cualitativos también deben validarse.• Validar consiste en verificar y documentar su validez a requisitos específicos.• La validación implica como etapa previa la definición de los requisitos analíticos o de calidad.• Luego entonces la determinación de estos requisitos.• Los resultados se expresan diferente a los métodos cuantitativos.
  54. 54. Expresión de Resultados Métodos Cualitativos Análisis Cualitativo / screening SI / NO Con probabilidad de error También tiene dos valores el primero binario y el segundo es la probabilidad de error asociada a la decisión tomada. Se expresan en términos probabilísticos.
  55. 55. Requisitos de Calidad Método Cuantitativo Método Cualitativo• Linealidad. • Especificidad. - Homogeneidad. • Sensibilidad.• Precisión: • Valor predictivo positivo (VPP). - Repetibilidad. • Valor predictivo negativo (VPN). - Reproducibilidad. • Exactitud diagnóstica. - Robustez. • Límite de corte (cut-off).• Veracidad (exactitud). • Incertidumbre o región de error.• Incertidumbre. • Límite de detección.• Limite de detección. • Robustez.• Límite de cuantificación.• Rango de cuantificación• Selectividad e Interferentes.
  56. 56. Especificidad• Se define como la capacidad o habilidad del sistema de detectar en forma exacta un analito en una matriz.• Proporción de muestras negativas (no reactivas) que son correctamente identificadas.• Generalmente se expresa como probabilidad.
  57. 57. Especificidad (E) Analito Analito presente ausente Método Verdaderos Falsos positivo positivos (VP) positivos (FP) Método Falsos Verdaderos negativo negativos (FN) negativos (VN)Proporción de muestras sin el analito, cuyo método esnegativo: E = VN / (VN + FP)
  58. 58. Sensibilidad• Es la capacidad o habilidad del sistema de detectar muestras positivas cuando realmente lo son.• Proporción de muestras positivas o reactivas correctamente identificadas por la prueba.• Generalmente se expresa como probabilidad.• Concentración de un analito necesaria para producir una unidad de cambio de lectura instrumental.
  59. 59. Sensibilidad (S) Analito Analito presente ausente Método Verdaderos Falsos positivo positivos (VP) positivos (FP) Método Falsos Verdaderos negativo negativos (FN) negativos (VN)Proporción de muestras que contiene el analito cuyométodo es positivo: S = VP / (VP+FN).
  60. 60. Falsos Negativos (FN)• Desviación negativa.• El método a validar da un resultado negativo y el método de referencia da positivo.• Probabilidad de que la muestra conocida como positiva, dé como negativa por el método.• Corresponden a muestras que contienen uno o más analitos por encima del valor límite permitido y que en prueba de screening dan respuesta negativa.• Se concluye con este resultado previo que la muestra no contiene el analito en los niveles fijados cuando si lo contiene.
  61. 61. Falsos Positivos (FP)• Desviación positiva.• Probabilidad de que la muestra clasificada como negativa, dé como positiva por el método.• Corresponden a aquellas muestras que realmente no contienen el analito en el nivel definido y que por Ej. la prueba de screening lo detecta.• Se produce cuando el método a validar proporciona un resultado positivo sin confirmación y el método de referencia da un resultado negativo.
  62. 62. Exactitud Diagnóstica• Proporción de resultados correctos (verdaderos positivos + verdaderos negativos).• Capacidad para detectar correctamente los positivos y los negativos.• Es el grado de concordancia entre el resultado obtenido en un ensayo y el valor de referencia que debiera obtenerse.
  63. 63. Exactitud Diagnóstica (ED) Analito Analito presente ausente Método Verdaderos Falsos positivo positivos (VP) positivos(FP) Método Falsos Verdaderos negativo negativos(FN) negativos (VN)Proporción de resultados correctos : ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN)
  64. 64. Criterio de Exactitud DiagnósticaEl mejor criterio actual para establecer lapresencia o ausencia de la condición(enfermedad), evento o característica deinterés usando un método simple o unacombinación de métodos de laboratorios queincluyan, pruebas de imagen, patológicos,información clínica, ensayos o paneles dereferencia.
  65. 65. Límite de Corte o Cut-off• Limite de cuantificación??• Número mínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que pueden determinarse bajo las condiciones experimentales del método evaluado.• Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos.• Relacionado a la sensibilidad, corresponde al nivel de concentración donde la sensibilidad es un 95% y la probabilidad de error tipo β es de un 5%.
  66. 66. Límite de Corte (cut-off)Pacientes “negativos” Pacientes “positivos” Resultados métodos
  67. 67. Definiciones de Requisitos de Calidad• Valor del Límite de Corte (cut-off). Valor de corte del método, dado principalmente por el fabricante, sobre el cut-off resultados positivos y bajo cut-off, resultados negativos. Se basa en una dicotomía (presencia/ausencia, si/no, etc.). C= 2ng/mL
  68. 68. Definiciones de Requisitos de Calidad• Región de Incertidumbre. Corresponde a la imprecisión del método, es un rango donde encontramos error Tipo I o α (Falsos positivos) y Tipo II o β (falsos negativos) del método. α C= 2ng/mL β
  69. 69. Definiciones de Requisitos de Calidad• Región de Incertidumbre (*CLSI: EP12-A2): • C50: Concentración del analito donde se produce un 50% de resultados positivos y un 50% de resultados negativos. • Intervalo C5 – C95: Rango de concentraciones requeridas del analito donde a concentraciones < de C5, son resultados concretamente negativos y > C95 son concretos positivos. Verdaderamente Negativas. C50 Verdaderamente Positivas.
  70. 70. Límite de Detección• Cantidad mínima de analito que puede ser detectado en una muestra pero que no puede ser estimado con precisión o sea que no necesariamente es cuantificado en las condiciones del ensayo.• Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos.• Los resultados se expresan como detectado / no detectado.
  71. 71. Robustez Efecto Matriz:  Capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee información de su comportamiento en la rutina.  Identificar variables que pueden tener efectos significativos en la respuesta del método.  Analizar cada set en condiciones experimentadas dadas y determinar el efecto de cada cambio.  Efectos congelado/descongelado, tiempos y temperaturas de incubación, cambios pH, preparación y conservación de la muestra y reactivos.
  72. 72. Resumen: Definiciones Requisitos de Calidad• Especificidad. Proporción de muestras negativas (no reactivas) que son correctamente identificadas.• Sensibilidad. Proporción de muestras positivas o reactivas correctamente identificadas por la prueba.• Falso Positivo. Probabilidad de que la muestra clasificada como negativa, dé positiva por el método.• Falso Negativo. Probabilidad de que la muestra conocida como positiva, dé negativa por el método.• Valor Predictivo Positivo. Probabilidad que tiene una muestra de ser realmente positiva, cuando el resultado de la prueba resulta reactivo.• Valor Predictivo Negativo. Probabilidad que tiene una muestra de ser negativo, cuando el resultado de la prueba es no reactivo.• Exactitud diagnóstica analítica. Capacidad del método para detectar correctamente los positivos y los negativos.
  73. 73. Observaciones• Hay pruebas en las que tiene un impacto a nivel de Salud Pública además de individual al dar un resultado Falso (+) o Falso (-) • Ej. VIH, HEP. B• En resistencia antibiótica es de mayor impacto los falsos negativos, o sea informar como sensible cuando es resistente.• De mayor trascendencia también en Falsos (-): • Hemocultivos, meningitis, resistencia antibiótica, VIH, etc.
  74. 74. Método ideal ‘Normal’ EnfermoNr de individuos No falsos positivos o negativos Valores método
  75. 75. Realidad Métodos Normal, sin el analito Enfermo, con el analitoNr de individuos +2SD Valores Falsos Falsos Método Negativos Positivos
  76. 76. Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos” Verdaderos PositivosSin enfermedad Resultados métodosCon enfermedad
  77. 77. Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Patientes “positivos” Resultados método FalsosSin enfermedad PositivosCon enfermedad
  78. 78. Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”Verdaderosnegativos Resultados métodosSin enfermedadCon enfermedad
  79. 79. Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos” Falsos negativos Resultados métodoSin enfermedadCon enfermedad
  80. 80. Evaluador de los requisitos de Calidad• Tablas de Contingencia. Diferencian las muestras en dos categorías, (+)/(-) según el método, y establecen una tabla de comparación respecto del resultado obtenido mediante el criterio de exactitud diagnóstica analítica. Criterio de exactitud diagnóstica Prueba a Evaluar POSITIVOS NEGATIVOS Total POSITIVOS VP FP VP + FP NEGATIVOS FN VN FN + VN Total VP + FN FP + VN VP + FP +FN +VN *CLSI: EP12-A2
  81. 81. Tablas de Contingencia• Las mas simples son las que diferencian las muestras en dos categorías : positivo o negativo.• Luego se establece una tabla de comparación respecto al resultado obtenido con resultado de método de referencia .• A partir de la tabla se calculan los cuatro parámetros básicos, además de otros: falsos(+), falsos(-), sensibilidad y especificidad.
  82. 82. Tablas de ContingenciaVentajas:o Son de fácil aplicación en la mayoría de los bioensayos.Desventajas:o Dan una medida global de la capacidad del método.o Se estima que la muestra se comportará estadísticamente de forma similar a las ya analizadas.o No se calcula una probabilidad de error en cada muestra en particular.o La capacidad de la tabla depende del número de muestras analizadas.
  83. 83. Evaluador de los requisitos de Calidad• Teorema de Bayes. Calcula la probabilidad de dar verdadero (positivo o negativo) un resultado cuando en realidad lo es, vale decir, probabilidad que ocurra el evento A dado el evento B. P(VPP) = P(p/a)* P(a) /P(p/a)*P(a)+P(p/b)*P(b) P(VPN) = P(n/a)*P(a)/P(n/a)*P(a)+P(n/b)+P(b) P(a): prob. de obtener un resultado positivo P(b): prob. de obtener un resultado negativo P(p/a): prob. de obtener un resultado (+) cuando esta presente la enfermedad. P(p/b): prob. de obtener un resultado (+) cuando no esta presente la enfermedad.
  84. 84. Evaluador de los requisitos de Calidad• Curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Curvas de Operatividad Relativa). Se generan al evaluar las modificaciones en la sensibilidad y especificidad que son resultantes de la modificación que se haga en los niveles de corte, de acuerdo al proceso de decisión clínica para un analito determinado. * A. Pulido, I. Ruisánchez, R. Boqué , F.X. Rius
  85. 85. Sensibilidad vs. Especificidad. (Fracción verdaderos positivos) 100(Fracción verdaderos positivos) 100 80 SENSIBILIDAD 80 SENSIBILIDAD 60 60 40 40 20 20 0 0 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 ESPECIFICIDAD (Fracción verdaderos 1-ESPECIFICIDAD (Fracción falsos negativos) positivos, FFP) Sensibilidad vs. 1- Especificidad.
  86. 86. Lectura de las Curvas ROC* http://ludwig-sun2.unil.ch/~darlene/module4/
  87. 87. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO-Identificación-Titulo-Protocolo redactado por-Protocolo aprobado por-Objetivo -Alcance-Factores críticos-Selección y tratamiento muestra y MRC-Identificación equipo: certificado calibración-Método analítico:-Variables a determinar : análisis estadístico-Personal que desarrollará la validación-Criterio de aceptación para cada parámetro de desempeño-Conclusiones-Registros-Referencias
  88. 88. INFORME DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO-Identificación-Titulo-Informe redactado por-Informe aprobado por-Objetivo -alcance-Responsabilidad-Equipo, materiales, documentos-Procedimiento-Cálculos y análisis estadísticos-Criterio de aceptación vs Resultados-Informe de desviaciones-Informe resultados y conclusiones de validación del método
  89. 89. Cuándo Verificar y cuándo Validar???VALIDAR VERIFICAR

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