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Charla CERES, 13 06 22.pdf

  1. Microbiología del compostaje de “alperujo“ Dr. Germán Tortosa Muñoz Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos Estación Experimental del Zaidín (EEZ-CSIC) http://www.compostandociencia.com Email: compostandociencia@gmail.com
  2. ¿Qué es el compostaje? - Proceso biológico de transformación de los residuos orgánicos en compost - Degradación aeróbica de la MO -Actividad metabólica de una gran diversidad de microorganismos presentes en los propios residuos: bacterias y hongos. -Liberación de energía: Incremento temperatura y fases del compostaje: mesófila, termófila, enfriamiento y maduración
  3. Foto: https://www.interempresas.net/Grandes-cultivos/Articulos/240818-Panorama-erosion-olivar-Jaen-procesos- metodologias-significacion-economica-ambiental.html
  4. La importancia de la materia orgánica Mejora las propiedades físicas, químicas, y biológicas Dos tipos: La biológicamente no activa (humus) y la biológicamente activa (microorganismos)
  5. Foto: https://www.pnas.org/content/114/52/13587
  6. Experimento Nº1: Cantidad de nitrógeno equivalente (orgánico vs. inorgánico) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso seco parte aérea (78 días) C DN DN+C Tratamiento PSPA (g) 0 5 10 15 20 25 Peso seco parte aérea (104 días) C DN DN+C Tratamiento PSPA (g)
  7. Experimento Nº2: Dosis compost creciente con igual nitrógeno inorgánico Control C1 C2 C3 0 4 8 12 16 20 Desarrollo vegetal 1º corte (98 días) PSPA (g) PSR (g) Tratamientos Peso (g) Control C1 C2 C3 0 4 8 12 16 20 Desarrollo vegetal 2º corte (127 días) PSPA (g) PSR (g) Peso (g) Control C1 C2 C3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Producción de frutos 2º corte (127 días) Peso fresco (g)
  8. 0 50 100 150 200 250 300 Contenido en ascorbato (Vitamina C) en frutos Control C1 C2 C3 Tratamiento mg/ 100 g peso fresco
  9. Microbiología del compostaje Sigue siendo uno de los grandes retos científicos 1) Técnicas dependientes de cultivo. 2) Técnicas independientes de cultivo - Material genético microbiano (DNA y RNA) y genes marcadores: 16S rRNA (bacterias), y 18S rRNA o ITS (hongos) - Técnicas -ómicas: Metagenómica, metatranscriptómica, proteómica, metabolómica, etc - PCR cuantitativa (qPCR) - Secuenciación masiva (NGS): Illumina MiSeq
  10. DNA vs RNA - Idea central de la biología molecular: DNA se transcribe a RNA mensajero y éste se traduce una proteína - Estudios de compostaje basados en DNA: Composición microbiana y su abundancia relativa durante el proceso - Estudios de compostaje basados en RNA: Información sobre las poblaciones “metabólicamente activas“
  11. Materiales y métodos experimentales Proceso de compostaje Compostaje de AL como modelo de estudio (Tortosa y col., 2012): - Pilas de 10.000 kg, AL y estiércol de oveja (1:1, v/v) - Estudio de dos pilas como réplicas biológicas - Pilas estáticas y volteos mecánicos (7 volteos, más frecuentes durante la fase bioxidativa) - Humedad entorno a 40-60%
  12. Esquema experimental PowerSoil® DNA Isolation kit - Secuenciación NGS bacterias (Tortosa et al., 2017) 2 pilas (réplicas biológicas) Fases mesófila, termófila y de maduración DNA
  13. Esquema experimental PowerSoil® DNA Isolation kit - Secuenciación NGS bacterias (Tortosa et al., 2017) - Secuenciación NGS hongos y qPCR (Tortosa et al., 2020). 2 pilas (réplicas biológicas) Fases mesófila, termófila y de maduración DNA
  14. DNA vs RNA - Idea central de la biología molecular: DNA se transcribe a RNA mensajero y éste se traduce una proteína - Estudios de compostaje basados en DNA: Composición microbiana y su abundancia relativa durante el proceso - Estudios de compostaje basados en RNA: Información sobre las poblaciones “metabólicamente activas“
  15. - Compostaje de “alperujo“ (AL) como sistema modelo: Estudio del proceso (Tortosa et al., 2012) Descenso degradación MO (Hemi., Toc, Fat y WSCH) Incremento de la humificación (Lig., HR, HD, PAH) Evolución bacterias mediante NGS (Tortosa et al., 2017) Evolución de hongos mediante NGS y qPCR (Tortosa et al., 2020) - No hay estudios de las comunidades “metabólicamente activas“ en el compostaje de AL - Muy poco estudios de diversidad analizando RNA durante el compostaje: Wang et al., (2019); Ding et al., (2020); Meng et al., (2020) Objetivos del trabajo: - Estudio de la diversidad, abundancia y actividad de las bacterias metabólicamente activas durante el compostaje de AL - Evaluar su implicación en los procesos de transformación de la materia orgánica (humificación y maduración)
  16. Esquema experimental PowerSoil® DNA Isolation kit RNA PowerSoil® Total RNA isolation kit - Secuenciación NGS bacterias (Tortosa et al., 2017) - Secuenciación NGS hongos y qPCR (Tortosa et al., 2020). - qPCR (Tortosa et al. 2021) - Secuenciación NGS bacterias y qPCR (Tortosa et al., 2021) PrimeScript TM RT reagent Kit 2 pilas (réplicas biológicas) Fases mesófila, termófila y de maduración cDNA RNA DNA
  17. 3) Análisis: qPCR (DNA y cDNA): - Amplificación de la región V3 del gen 16S rRNA - 341F y 534R - iTaq Universal SYBR Green Supermix - Patrón: plásmido de Pseudomonas putida NCB 957 - Número copias 16S rRNA CDW-1 Secuenciación masiva (NGS). Illumina MiSeq (cDNA): - Amplificación y secuenciación de la región V3-V4 del gen 16S rRNA - Análisis Bioinformático: - FastQC, FASTX-Toolkit, fastq-join - Q20, >20 pb, 15 % overlapping - SEED2 software (<300 pb), <Q30 - Quimeras y OTUs (SILVA y MOTHUR) - Ribosomal Database project (RDP-II)
  18. 4) Análisis estadístico - Curvas de rarefacción - Diversidad alfa: Observed and Chao1 richness; Shannon and InvSimpson - Diversidad beta: Non-metric MultiDimensional Scaling Analysis (NMDS) based on Bray-Curtis dissimilarities - Statistical Analysis of Taxonomical and Functional Profiles (STAMP) open- source software v2.1.3 release - One-way ANOVA, Tukey-Kramer post-hoc test (p < 0.05), Storey’s FDR, y eta- squared corrections - Correlación de Pearson entre géneros y prop. Físico-químicas - Functional Annotation of Prokaryotic Taxa (FAPROTAX) bioinformatic tool (v.1.2.2 release) Stilianos Louca Lab (Universidad de Oregón) https://pages.uoregon.edu/slouca/LoucaLab/lib/ php/index.php
  19. Resultados qPCR (abundancia): DNA (a) y cDNA (b) - DNA: Incremento durante el proceso; termófila>maduración>mesófila - cDNA: Termófila como fase más activa del proceso
  20. Resultados Índices de diversidad Alfa (α) Beta (β) - Incremento de la diversidad alfa durante el compostaje - Similitud en diversidad beta con el avance del proceso
  21. Diversidad bacteriana durante el proceso - Phyla predominantes: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes y Actinobacteria (>84 % secuencias identificadas)
  22. Diversidad bacteriana durante el proceso - Descenso durante el proceso: Stenotrophomonas, Halotea, Pseudomonas, Acinetobacter, ...
  23. Diversidad bacteriana durante el proceso - Incremento sólo en la fase termófila: Carnobacterium, Olivibacter, Flavobacterium, Rhodococcus, ...
  24. Diversidad bacteriana durante el proceso - Incremento sólo en la maduración: Luteinomonas, Parapedobacter, Truepera, Planomicrobium, ...
  25. Correlación con la transformación físico-química de la materia orgánica - Descenso degradación MO (Hemi., Toc, Fat y WSCH) e incremento de la humificación (Lig., HR, HD, PAH) - Stenotrophomonas, Halotalea, Pseudomonas y Cohnella (degradación de la MO) - Luteinomonas, Truepera y Planomicrobium (humificaión)
  26. 5- Asignación funcional de los taxones (FAPROTAX)
  27. 5- Asignación funcional de los taxones (FAPROTAX) - Funciones metabólicas características del compostaje relacionadas con la degradación de la materia orgánica y reducción de patógenos
  28. Conclusiones: - Transcriptómica (RNA) es una aproximación válida para el estudio de las comunidades bacterianas potencialmente activas - qPCR confirma que la fase más activa es la termófila - Comportamiento diferenciado de la comunidad bacteriana durante el proceso: descenso durante el proceso, incremento solo en la fase termófila y sólo en la maduración - Hay una especialización bacteriana implicada en los diferentes procesos metabólicos de la degradación de la materia orgánica - Luteinomonas, Parapedobacter y Planomicrobium son potenciales biomarcadores para el proceso de maduración y tienen un papel relevante en la humificación
  29. Hacía donde vamos (o queremos ir): En Investigación - Aislamiento y caracterización de PGPR del compost de AL (en marcha) - Efecto de compost en la fijación simbiótica de nitrógeno (por hacer) - Tratamiento biológico del “carozo” y aislamiento de bacterias PGPR (en marcha) - Patente de un abono orgánico y biológico a partir del compost de AL (por hacer) - Compostaje a pequeña escala (en marcha): Diseño de un reactor (patente) Curso y libro sobre “La ciencia del compostaje en casa”
  30. http://www.compostandociencia.com Email: german.tortosa@eez.csic.es compostandociencia@gmail.com @germantortosa ¡Muchas gracias por vuestra atención!
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