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Técnicas de Diagnóstico Molecular UAP AQP

En esta presentación se exponen las técnicas aplicadas para el aislamiento, purificación y cuantificación de ácidos nucleicos previos a su utilización para la aplicación de técnicas de diagnóstico molecular. Se exponen también los fundamentos y las principales caracteristicas de cada técnica.

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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
PRESENTADO POR: EMERSON TURPO BALDÁRRAGO
¿Qué son las Técnicas de Diagnóstico
Molecular?
• Son procedimientos basados en la caracterización
física de moléculas de ácidos nucleicos.
• Permiten llegar al diagnóstico rápido de las
enfermedades infecciosas en aquellos casos donde
el diagnóstico convencional no pueda ser
utilizado.
Esquema General
Obtención y preparación de la muestra
Liberación del material genético
Purificación del material extraído
Cuantificación y amplificación del material genético
Aplicación de técnicas moleculares
Aislamiento y purificación de ADN
 Un procedimiento suave de lisis
de las células y de solubilización
del ADN.
 Una segunda fase con uno o
varios métodos enzimáticos o
químicos de eliminación de
contaminantes (proteínas, ARN y
otras macromoléculas).
Purificación de ARN
La lisis de las células se produce por:
 La utilización de detergentes.
 La lisis celular utilizando
tiocianato de guanidinio, que es el
método más utilizado para la
extracción de ARN de tejidos.
Cuantificación de Ácidos Nucleicos
 Determinación por espectrofotometría
ADN y ARN: Absorción de Luz UV 260 nm.
Utilizar cubetas de cuarzo.
ADN: 50 µg/mL; ARN: 40 µg/mL
 Método de tinción con Bromuro de etidio
Bromuro de etidio  Compuesto fluorescente.
Al unirse al ADN su fluorescencia aumenta.
La fluorescencia obtenida es proporcional a la cantidad de ADN
presente.

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Técnicas de Diagnóstico Molecular UAP AQP

  • 1. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS PRESENTADO POR: EMERSON TURPO BALDÁRRAGO
  • 2. ¿Qué son las Técnicas de Diagnóstico Molecular? • Son procedimientos basados en la caracterización física de moléculas de ácidos nucleicos. • Permiten llegar al diagnóstico rápido de las enfermedades infecciosas en aquellos casos donde el diagnóstico convencional no pueda ser utilizado.
  • 3. Esquema General Obtención y preparación de la muestra Liberación del material genético Purificación del material extraído Cuantificación y amplificación del material genético Aplicación de técnicas moleculares
  • 4. Aislamiento y purificación de ADN  Un procedimiento suave de lisis de las células y de solubilización del ADN.  Una segunda fase con uno o varios métodos enzimáticos o químicos de eliminación de contaminantes (proteínas, ARN y otras macromoléculas).
  • 5. Purificación de ARN La lisis de las células se produce por:  La utilización de detergentes.  La lisis celular utilizando tiocianato de guanidinio, que es el método más utilizado para la extracción de ARN de tejidos.
  • 6. Cuantificación de Ácidos Nucleicos  Determinación por espectrofotometría ADN y ARN: Absorción de Luz UV 260 nm. Utilizar cubetas de cuarzo. ADN: 50 µg/mL; ARN: 40 µg/mL  Método de tinción con Bromuro de etidio Bromuro de etidio  Compuesto fluorescente. Al unirse al ADN su fluorescencia aumenta. La fluorescencia obtenida es proporcional a la cantidad de ADN presente.
  • 8. Electroforesis en campo pulsante (PFGE) • Consiste en la separación electroforética de grandes moléculas de DNA inmersas en gel de agarosa, alternando la orientación del campo eléctrico. • El tiempo de activación de cada campo → Pulso. • El tiempo de reorientación es D.P. al tamaño de la molécula. Fundamento
  • 9. Electroforesis en campo pulsante (PFGE) Arma epidemiológica para comparar genéticamente cepas pertenecientes a una misma especie. Diferenciar cepas pertenecientes a especies distintas. Requiere una preparación muy elaborada de la muestra y equipamiento especializado. Características
  • 10. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) “En cada ciclo de reacción se duplica la cantidad de material genético presente en la muestra” A.N. de doble cadena Primers/ Cebadores Taq Polimerasa
  • 11. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) Alta sensibilidad y especificidad. Producto final: ácido nucleico de doble cadena. El producto final puede ser analizado en tamaño, secuencia y cantidad. Útil para la búsqueda de material genético de un agente infeccioso en una muestra clínica. Útil para la identificación de aislamientos. Características
  • 12. Amplificación aleatoria (RAPD) • Su fundamento es similar al del la PCR, pero utiliza Cebadores aleatorios para la amplificación arbitraria del ADN. • Los fragmentos de DNA generados se separan mediante electroforesis en gel de agarosa. • Se obtienen patrones y mediante comparación permite la identificación de patógenos. Fundamento Patrón RAPD para E. coli
  • 13. Amplificación aleatoria (RAPD) • Aplicación en estudios epidemiológicos. • Útil para la comparación de aislamientos pertenecientes a una misma especie. • Útil para discriminar entre variedades y aislamientos de patógenos. Características
  • 14. Polimorfismo de Longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) • Se fundamenta en la utilización de Restrictasas que rompen el DNA en dianas o secuencias específicas. • La molécula de ADN es digerida en diferentes sitios y da lugar a fragmentos de diferente longitud, que dan lugar a Patrones de restricción. Fundamento
  • 15. Polimorfismo de Longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) • Utilizada para generar patrones electroforéticos (marcadores genéticos) de aislamientos pertenecientes a una misma especie o a especies diferentes. • Utilidad en Epidemiología molecular. Características
  • 16. Hibridación • Se fundamenta en la formación de moléculas de doble cadena, cuyas hebras tienen distinto origen. • Requieren dos elementos básicos: La secuencia diana de ácido nucleico y un fragmento corto de ácido nucleico conocido como Sonda. Fundamento
  • 17. Hibridación • Encontramos diferentes tipos, siendo las más comunes: Southern blot y Dot blot. • El Southern blot permite la transferencia de fragmentos de ADN originados por endonucleasas de restricción y posterior hibridación con una sonda marcada, permitiendo la comparación de patrones genéticos. • El Dot blot permite la detección cualitativa de una agente infeccioso en muestra de sangre, heces, esputos, etc. Características
  • 18. Secuenciación • Se fundamenta en la interrupción controlada de la síntesis de una hebra complementaria durante una replicación in vitro. • La principal característica de este método es el uso de didexosinucleótidos que provocan la detención de la reacción de la síntesis de ADN. Fundamento