Compréhension des mécanismes régissant l’endurcissement de graines de Vigna unguiculata

1. N° D’ordre : 13 / 2015 - C / S.B République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université des Sciences et de le Technologie Houari Boumediene Faculté des Sciences Biologiques Thèse Présentée pour l’obtention du diplôme de Doctorat 3° cycle En Sciences de la Nature et de la Vie Spécialité : Génétique, Physiologie Moléculaire et Microbiologie des Plantes. Par BOUCELHA Lilya Thème Compréhension des mécanismes régissant l’endurcissement des graines de Vigna unguiculata (L.) Walp. Soutenue publiquement le 11 Juin 2015 devant le jury composé de : AMIROUCHE Rachid (Professeur, FSB/USTHB)……………... Président ABROUS-BELBACHIR Ouzna (Professeur, FSB/USTHB)……. Examinateur HARCHE-KAID Meriem (Professeur, USTO/ Oran)…………… OUAFI-HARCHAOUI Saïda (Professeur, FSB/USTHB)……… KAMELI Abdelkrim (Professeur, ENS / Kouba)………………. KHELIFI Lakhdar (Professeur, ENSA / El Harrach)…………... Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur DJEBBAR Réda (Maître de Conférences A, FSB/USTHB)…….. Directeur de thèse

2. Résumé Depuis toujours, plusieurs approches ont été tentées pour améliorer la germination, la croissance et le développement des espèces végétales. L’amorçage ou endurcissement (priming) est une des techniques de pré-semis la plus connue qui permet d’influencer le développement des semis, en modulant les activités métaboliques de la germination avant la percée de la radicule, c'est à dire au cours de la phase réversible de la germination, la graine pouvant revenir à son état initial sans dommages. L’endurcissement consiste à faire subir aux semences un traitement osmotique (osmopriming) ou hormonal (hormopriming) et/ou une redéshydratation (hydropriming) qui permettent la levée de la dormance, l’homogénéisation (la synchronisation) de la germination, une meilleure croissance, une floraison plus précoce et une tolérance plus vigoureuse aux stress abiotiques tels que la sécheresse et la salinité. Notre travail s’inscrit dans cette optique et a pour objectif d’étudier les conséquences de l’hydropriming (simple et double) et de l’osmopriming (par du PEG6000 à 10 et 30 %) sur des graines du haricot à œil noir (Vigna unguiculata), ainsi que la compréhension des mécanismes régissant l’endurcissement au niveau embryonnaire (cotylédons, radicule et gemmule). Les résultats obtenus montrent que l'endurcissement permet d’avoir une germination plus rapide et plus homogène et une meilleure croissance des radicules et des parties aériennes en conditions favorables et non favorables (stress hydrique). Nous avons également démontré qu’une double redéshydratation (double hydropriming) est plus efficace dans l’amélioration de ces paramètres comparativement aux autres traitements. D’autre part, notre étude montre que les traitements de prégermination des semences, et plus particulièrement la double redéshydratation, provoquent des modifications métaboliques et biochimiques telles que l’hydrolyse des réserves, la forte production d’acides aminés et des sucres solubles ainsi que la modification de leur composition. Notre étude a surtout montré que ces traitements prégerminatifs, et notamment le double hydropriming, induit une plus forte production d’espèces réactives d’oxygène, ERO (H2O2 et superoxyde) ainsi qu’une forte activation des systèmes anti-oxydatifs (ascorbate peroxydase, catalase et gaïacol peroxydase), particulièrement au niveau de la gemmule. Ces résultats qui confirment le rôle des ERO dans le processus de germination, expliquent partiellement les mécanismes impliqués dans les phénomènes d’osmopriming et d’hydropriming. Afin de valider nos résultats, nous avons appliqué un stress hydrique, par arrêt d’arrosage, à des plantes issues de graines traitées. Les résultats obtenus ont montré que les traitements prégerminatifs, et surtout le double hydropriming, permet d’obtenir des plantes plus tolérantes au déficit hydrique. Notre travail permet de conclure que la double redéshydratation pourrait représenter une méthode très efficace pour l'amélioration de la production végétale et en particulier dans des conditions hydriques défavorables. Mots clefs : Vigna unguiculata, graine, embryon, traitements prégerminatifs, hydropriming, osmopriming, endurcissement, stress hydrique, stress oxydatif, espèces réactives d’oxygène.

3. A la mémoire de mon père parti si tôt « La science a la chance et la modestie de savoir qu'elle est dans le provisoire, de déplacer les frontières de l'inconnu et d'avancer ». Sigmund Freud « C'est dans l'’effort que l'on trouve la satisfaction et non dans la réussite. Un plein effort est une pleine victoire ». Ghandi « Le courage de la goutte d'eau, c'est qu'elle ose tomber dans le désert ». Lao She

4. REMERCIEMENTS

5. Remerciements Remerciements En fait, la partie la plus difficile dans une thèse ce n’est ni l’expérimentation ni la rédaction. Le plus dur dans une thèse, ce sont les remerciements car on a toujours la hantise d’oublier quelqu’un tant son aboutissement est le fruit d’un travail collectif. Alors, allons-y et que ceux que j’oublierai me pardonne par avance. Mais, en même temps c’est la partie qui m’a fait vraiment plaisir à écrire parce que c’est chargé d’émotions ! Tout d’abord, je remercie le Bon Dieu le tout puissant pour toutes ces bénédictions qu’il m’a offertes et de m’avoir donné la connaissance, la force et la volonté d’achever cette thèse et je lui rends grâce. La toute première personne à qui je dois exprimer toute ma profonde gratitude et mes plus vifs remerciements, c’est mon directeur de thèse Dr Réda DJEBBAR, Maitre de conférences (A) à la Faculté des Sciences Biologiques (USTHB). En plus de son vaste savoir (une encyclopédie !), son immense culture, sa grande intelligence et son large esprit scientifique, il jouit de très hautes valeurs morales et humaines qui m’ont aidée à surmonter toutes les difficultés. J’ai eu la chance et l’honneur d’être encadrée depuis ma licence par M. Djebbar R. Je le remercie de m’avoir ouvert la première porte de la recherche scientifique. Cet Expert m’a bien appris le Vrai Sens de la Science ! M. Djebbar, merci de m’avoir donnée beaucoup de votre temps et votre attention et de m’avoir encouragée, supportée et soulagée dans les moments difficiles que j’avais traversés. Je vous remercie également pour votre très chère confiance qui m’a toujours offert des motivations, des capacités et la volonté d’avancer. Un Grand Merci pour votre abnégation, votre disponibilité, votre patience légendaire, votre soutien, votre grande sollicitude, vos conseils judicieux, votre bonne humeur et pour tous les bons moments passés à discuter dans les divers domaines de la vie. Grâce à vos grandes compétences dans le domaine scientifique, j’ai appris avec vous les Choses fondamentales. Vous m’avez transmis votre manière de voir et d’aborder la Science et la Vie, votre optimisme et votre philosophie. Vous resterez un exemple pour moi ! Je ne pourrai jamais vous récompenser ou trouver les mots pour pouvoir vous remercier suffisamment ! Merci pour Tout ! Je tiens à exprimer toute ma gratitude aux membres du jury qui ont bien accepté d’examiner ce travail. Leurs remarques éclairées et critiques nous seront certainement très utiles et instructifs. Ils ajouteront sans nul doute de la valeur à cette thèse. Je suis très honorée par la présence du professeur AMIROUCHE Rachid de la Faculté des sciences biologiques (USTHB), en tant que président de ce jury. Ses grandes compétences et sa longue expérience dans le domaine végétal permettront assurément de bien enrichir et améliorer ce travail. Je tiens à lui exprimer toute ma gratitude et mes vifs remerciements pour nous avoir transmis sa passion pour l’univers des plantes. Je le remercie également de m’avoir toujours encouragée et soutenue.

6. Remerciements Tout l’honneur et la gratitude s'adressent également aux examinateurs : -Le professeur BELBACHIR-ABROUS Ouzna, de la Faculté des sciences biologiques (USTHB), dont ses compétences dans le domaine de la Physiologie du végétal la placent naturellement en qualité d’examinateur. Certainement ses remarques aideront grandement à améliorer ce travail. -Le professeur, HARCHAOUI-OUAFI Saida de la Faculté des Sciences Biologiques (USTHB), qui me fait l’honneur et le plaisir d’examiner ce travail. Sa longue expérience dans la Biochimie Végétale permettra assurément d’enrichir cette thèse. -Le professeur KAID-HARCHE Meriem (UST Oran) qui, grâce à sa connaissance et son expérience dans le domaine végétal, et à tous les niveaux, apportera un regard intéressant à ce travail. Je suis très honorée par sa présence. -Le professeur KHELIFI Lakhdar (Ecole National Supérieure d’Agronomie, Alger) dont la présence dans ce jury est nécessaire au vu de ses compétences en génétique végétale. Ses remarques nous permettront sans aucun doute de bien améliorer cette thèse. -Le professeur KAMELI Abdelkrim (ENS, Kouba), grâce à son expérience et ses grandes compétences dans la biochimie végétale, ce travail sera certainement bien enrichi et amélioré. Je tiens à affirmer ma gratitude, encore une fois, à Mme Abrous en tant que membre de notre équipe de recherche. Elle a une place très spéciale et précieuse dans mon univers. J’avais eu vraiment de la chance et l’honneur de la connaitre et d’être proche d’elle dans le même labo. Je la remercie infiniment de m’avoir sacrifiée beaucoup de son temps pour m’encourager, me soutenir, me réconforter, m’écouter et me conseiller malgré toutes ses nombreuses tâches. Sa tendresse, sa sollicitude et ses encouragements m’ont offert la volonté et l’énergie nécessaires pour continuer et surmonter la dure épreuve que j’avais traversée. Je tiens à lui exprimer tous mes respects et mon infinie gratitude. A cette excellente enseignante qui a été la mienne, Mme Harchaoui-Ouafi, je tiens à exprimer toute ma gratitude et mes remerciements très chaleureux. Je ne lui serai jamais assez reconnaissante pour son extrême gentillesse, sa grande attention, son affection, ses encouragements permanents, ses conseils judicieux, son humilité et toutes ses valeurs humaines. Je lui témoigne ma plus grande admiration. Une mention très spéciale à Mme Slimani Hakima, la grande sœur et l’adorable amie ! Elle a été toujours présente dans les bons comme dans les mauvais moments. Je la remercie pour son amitié, son attention, son bon cœur, ses encouragements, son soutien, ses conseils, son humour et pour tous les agréables moments qu’on a passés ensemble. Je lui souhaite tout le bonheur du monde parce qu’elle le mérite !

7. Remerciements Une mention très spéciale à mes sœurs offertes par la science Bekka Selma et Drai Lila ! Je vous remercie de tout mon cœur pour votre amour, votre attention, vos encouragements permanents, votre soutien, vos conseils, la bonne ambiance et surtout pour tous nos fous rires, nos souvenirs et les agréables moments que nous avons partagés ensemble. Je ne pourrai jamais les oublier. Vous m’avez offert la chaleur familiale qui m’a été d’un grand réconfort ! Vous étiez toujours à mes côtés soit dans les bons ou les mauvais moments. Selma ta présence au labo m’offrait l’ambiance, la joie et le sourire et au même temps au fond de toi tu as bien partagé avec moi ma peine de la disparition de mon père ! Mille Merci d’avoir toujours pensé à moi et essayé de me remonter le moral dans les périodes difficiles que j’avais vécues ! Lila tu es la première personne que j’avais connue quand je suis venue la première fois au labo pour préparer mon mémoire de licence en 2009. Je me rappelle bien de ton accueil chaleureux et dès le premier jour on a lié une bonne amitié qui s’approfondissait d’un jour à l’autre ! Je te remercie également de m’avoir bien aidée dans mes manips quand j’étais débutante ! Ainsi, tu es un facteur fondamental dans l’ambiance du labo. Un grand merci de m’avoir aidée face aux différentes entraves rencontrées. Je vous souhaite sincèrement beaucoup de succès dans votre vie et vos études parce que vous êtes des filles formidables ! Je tiens à remercier vivement Boussoufa Amel, Cherchali Amina et Benhabyles Lamia, pour leur profonde amitié, leur gentillesse, leur sympathie, leur attention et leur soutien permanent. Vous avez joué un rôle fondamental en me donnant le courage et l’énergie qui m’ont permis d’achever cette thèse. Mon travail aurait été pénible sans la bonne ambiance que vous avez su créer. Un Merci plus spécial à Bourahla Maissa ; une fille angélique ! Sa douceur, sa noblesse et sa bonté m’offraient un énorme réconfort et beaucoup de soulagement surtout dans les moments de saturation. Je la remercie de m’avoir toujours écoutée, encouragée et soutenue. Je tiens à remercier également Slimani Karima et Messaoudene Lynda pour leur gentillesse, leur sollicitude et leur soutien perpétuel. A toutes ces chères amies je souhaite beaucoup de bonheur, réussite et une bonne continuation pour leur thèse de doctorat. Mes respects et remerciements vont également à Mme AÏD Fatiha, professeur à la Faculté des Sciences Biologiques (USTHB), notre chef d’équipe et directrice du LBPO. Je la remercie pour ses encouragements durant la réalisation de ce travail. Par la même occasion, je remercie également tous les autres membres du laboratoire de physiologie végétale, sans aucune exception, mais plus particulièrement Bahar Salima, Belaid Faiza, Ait Yahia Ouahiba, Boulahia Karima, Rabhi Sadjia, Osman Siham, Khelif Leila, Bellout Yacine, Ami Katia et Manaa Iméne pour leurs encouragements permanents et leurs conseils judicieux. Mais, un Merci plus spécial à Mme Zegaoui Zahia qui m’a toujours bien encouragée, soutenue et conseillée. Je la remercie pour sa sympathie et son attention. Je tiens également à remercier vivement Mme Belkebir Aicha et Mme Abdelkrim Fatima pour leur gentillesse, leur bonté et leurs encouragements.

8. Remerciements Et une mention spéciale à Mlle Charef Samira, notre chère ingénieure de la salle 109. Je la remercie infiniment pour son accueil chaleureux, son amitié, sa sollicitude, son soutien, sa gentillesse, mais surtout pour son Sourire et la bonne ambiance qui m’ont toujours fourni le courage et l’énergie essentiels pour travailler ! Je lui souhaite beaucoup de bonheur et du succès dans sa vie parce qu’elle le mérite. Une mention aussi très spéciale à mes « Sœurs de Combat », et plus particulièrement Sofia Merah, Bellahreche Zineb, Chahinez Messailli, Sabrina Soutou, Sarah Madani, Chérifa Selmani et Nadjet Azizi. Je considère leur connaissance et leur bonne amitié parmi les meilleurs résultats de cette thèse parce qu’elles sont des filles adorables, très gentilles, cultivées et bien sympathiques. Je les remercie pour leur amitié, leur attention, leur soutien perpétuel et tous les bons moments que nous avons passés ensemble ! Je leur souhaite beaucoup de bonheur dans leur vie et de soutenir le plus tôt possible. Mais, Sofia Merah tu as une place à part dans ma vie et mon cœur, je suis chanceuse de t’avoir comme une amie trop précieuse ! Je te remercie pour toutes tes bonnes valeurs, ton amour et tes encouragements permanents. Je ne pourrai jamais oublier les bons moments que nous avons partagés ensemble en prenant du thé au labo ! Un merci aussi spécial à Belharache Zineb qui m’a toujours offert le sourire, l’ambiance et la bonne humeur. Je la remercie pour sa grande attention, sa sensibilité, son soutien et surtout pour tous les agréables moments passés à rigoler ensemble. Je tiens à remercier chaleureusement l’ensemble de mes enseignants, sans aucune exception, pour m’avoir tant appris sur la biologie végétale même s’il reste tant à apprendre. Je tiens à leur exprimer ma sincère et profonde gratitude. Mais, je remercie bien particulièrement Mme Amirouche Nabila, Mme Gaceb Rabea, Mme Bougeudoura Nadia, Mme Rahmania Fatma, Mme Chaabane Djamila, M. Trabsi Ismail, M. Kaci Yahia et M. Amrani Said pour leur attention, leur gentillesse, leurs encouragements permanents et leurs conseils qui m’offraient un grand plaisir et beaucoup de courage. Par la même occasion, j’adresse également mes vifs remerciements et ma gratitude aux enseignants de la faculté des sciences biologiques (USTHB) qui m’ont encouragé et soutenu, et particulièrement M. Charbal Farid, Mme Saidi Mehdia, Mme Hamouli Zohra, Mme Ouldrouis Sonia, Mme Kadik Leila, M. Abdelrahmani Ahmed, Mme Hourizi Ratiba, M. Benkhalfa Mourad, Mme Negazi Samia, Mme Mezioug Dalila, Mme Khammar Farida, M. Koceir El Hadj, Mme Taguet Farida, M. Khalkhal Ali et M. Bensaid Sahraoui. Leur soutien, leur attention et leurs encouragements durant la réalisation de cette thèse m’ont été très précieux. Une mention plus spéciale à Mme Benazzoug Yasmina Professeur à la faculté des sciences biologiques (USTHB). En plus de ses compétences et son grand niveau intellectuel, c’est une source de gentillesse, de bonté et de sagesse. Je lui suis reconnaissante pour m’avoir accordée son attention et sacrifiée de son temps pour me

9. Remerciements soutenir perpétuellement et me conseiller malgré toutes ses nombreuses tâches. Cette attention m’offrait le courage et la force pour continuer, je tiens à lui témoigner ma gratitude infinie et ma grande admiration. J’adresse également mes vifs remerciements à Mme la doyenne Laraba- Djebbara Fatima et Mme la vice doyenne Triki-Hamoudi Djelila. Qu’elles trouvent ici le témoignage de ma sincère gratitude pour leurs soutien et encouragements à mon égard. Je tiens à remercier énormément Mlles Moussouni Souhila et Khedim Tinhinen pour leur bonne amitié, leur grande attention, leur gentillesse, leur sympathie et leur soutien ! A ces chères amies je souhaite beaucoup de succès et du bonheur. Sans oublier bien sûr Slimani Zakia, Si Dahbi Farida et Radi Nora. Mes remerciements s’adressent également à tous mes collègues et mes amis de la FSB. Je ne me risquerai pas de les citer au risque d’en froisser quelques-uns, victimes de ma mémoire. Mais, plus particulièrement Djouadj Lydia, Belhadi Fairouz, Bouguemra Selma, Tachoua Wafa et Toumi Ryma pour leur amitié, leur bonté et leurs encouragements. Un merci plus spécial à ma voisine et mon amie Mouhoub Ryma. A mon frère de combat Baik Nourredine ; je tiens à lui exprimer mon amitié et remerciements pour ses encouragements permanents et son attention. Un merci plus spécial à Aboud Nabil mon frère et mon cher ami. En plus de sa grande culture et ses motivations, il se caractérise par beaucoup de qualités humaines. Je le remercie infiniment pour sa grande attention, son soutien et son extrême gentillesse. Je leur souhaite de soutenir leur thèse le plus tôt possible. Je tiens à exprimer mes remerciements aux ingénieurs des laboratoires de la FSB qui m’ont aidée, encouragée et soutenue et bien particulièrement Brahimi- Bettayeb Lynda, Saichi Manel et Namani Wissam. Je les remercie pour leur amitié, leur gentillesse et surtout pour leur attention. Mes gratitudes vont également au personnel ATS de la FSB et particulièrement à M. Nems Djamel, M. Bouaroura Ahmed, M. Lamara Abdelatif, Mme Rabia Aicha, M. Rahmoun Yahia, M. Azzouz Yazid, M. Asfiren Said et M. Boukhalfa Fouad pour leur bonté, leur attention et leurs encouragements. A Boudjalti Aldjia (Djidji) et Draceni Yasmine, je tiens à exprimer ma profonde amitié et mes vifs remerciements pour leur amour, leur grande sollicitude, leur extrême gentillesse, leur bonté, leur bonne humeur et leur soutien perpétuel. Je leur souhaite beaucoup de bonheur et de réussite dans leur vie parce qu’elles sont des filles formidables. Une mention très spéciale à Mlle Sana Chaker, une fille merveilleuse qui fournit de la joie et du plaisir à mes jours par son extrême gentillesse, sa noblesse, sa

10. Remerciements tendresse et sa douceur. Je la remercie infiniment pour son amour, sa fidèle amitié, son soutien perpétuel, sa bonne humeur et pour les agréables moments inoubliables que nous avons partagés ensemble. Je lui souhaite tout le bonheur du monde parce qu’elle le mérite. Je tiens à remercier également son fiancé Benbelkacem Yacine pour sa gentillesse, ses encouragements et de m’avoir aidé dans la traduction de l’article en anglais. Une mention aussi spéciale à Chaoui Lynda ma meilleure amie d’enfance, une fille plus qu’adorable, comblée de gentillesse, douceur, affection, bonté et beaucoup d’autres bonnes qualités humaines ! Et malgré qu’elle soit installée à Canada, elle est restée toujours très fidèle ! Je ne trouverai jamais les mots pour pouvoir la remercier suffisamment pour son indéfectible amitié, sa sollicitude infinie et son soutien permanent malgré la très grande distance ! Lynda tu es un exemple de fidélité, je te souhaite tout ce qu’il y a de meilleur dans ce monde. Je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements et ma très grande gratitude à des personnes si chères qui jouissent d’une place très spéciale et précieuse dans ma vie et mon cœur se sont les membres de la famille Djebbar, ma deuxième famille ! Je commence par tata Djamila, une source trop profonde de noblesse, gentillesse, bonté, tendresse et douceur. Je la remercie de m’avoir considérée comme sa quatrième fille et de m’avoir soutenue et encouragée. Et à mes sœurs adorées Sara, Lynda et Lilya qui ont bien reçu les gènes de noblesse, loyauté, gentillesse et sympathie transmis par leurs parents ! Je tiens à exprimer mes remerciements chaleureux pour leur amour, leur grande attention, leur bonne humeur perpétuelle et leur soutien permanent. J’ai vraiment de la chance d’avoir connu cette famille merveilleuse ! Et enfin, mais c’est le plus important, toute ma gratitude et mes plus vifs remerciements iront à des êtres exceptionnels, mes parents, qui se sont sacrifiés tout au long de leur vie pour me soutenir et me garantir un bel avenir. Ma mère (si indispensable pour ma survie) a été ma plus fervente supportrice. Je ne pourrai jamais la récompenser pour son amour infini, son éducation, sa grande sollicitude et son soutien permanent. Elle m’a appris les meilleures valeurs de ce monde. Je suis ce que je suis grâce à elle ! Elle mérite le titre plus que moi ! Je tiens à lui exprimer toute ma gratitude et mes reconnaissances. Que Dieu la garde pour moi. Mon père qui m’a toujours accompagné à la fac et m’a attendu quand je tardais au labo en vue de terminer les longues manips. Mais, dommage il est parti trop tôt, avant que je n’aie achevé ma thèse ! Le destin ne lui a pas donné l’occasion de récolter son fruit. Sa mort subite m’a détruite entièrement mais j’ai essayé de surmonter ma peine et de continuer juste pour lui réaliser son rêve, malgré sa disparition. Papa je te Dédie cette thèse. Repose en paix ! Et je tiens à t’exprimer toutes mes reconnaissances pour tout ce que tu as fait pour pouvoir y arriver.

11. Remerciements La mention la plus spéciale à ma sœur Amira qui me fait fleurir mes jours et me fournit perpétuellement la joie et le sourire. Je ne trouverai jamais les mots pour pouvoir te remercier pour ton amour, ta grande attention, ta tendresse et nos agréables moments passés à rigoler ensemble qui me permettaient de diminuer la charge et la pression de la thèse. Je te remercie également de m’avoir supportée durant des années, en allumant le PC durant toute la nuit alors que tu ne peux pas dormir s’il y a un tout petit flux de lumière. Mille Merci ma princesse de m’avoir donné la chance d’avoir la meilleure sœur du monde ! Je tiens à remercier infiniment mon frère Mohamed qui m’a aussi beaucoup accompagné à la fac en prenant la relève de mon père malgré son occupation par son bac ! Merci beaucoup Moh tu es un frère que toute fille rêve d’avoir grâce à ta gentillesse et ta bonté ! Je tiens à remercier également son ami Djamel d’avoir fait plusieurs fois le trajet à Bab Ezzouar afin de me récupérer. Un grand merci à mon adorable petit frère Samir pour son amour, son attention, son écoute et sa sympathie. T’es le meilleur cadeau que mes parents m’ont offert ! Je tiens à exprimer également toute ma gratitude et mes remerciements à ma Grand-mère qui était toujours à mes côtés. Sa gentillesse, sa sollicitude et ses encouragements me donnaient l’énergie nécessaire pour continuer. Je termine mes remerciements par mes petits cousins adorés Mehdi et Hani qui ont toujours prie pour moi pour terminer et soutenir, cette innocence m’offrait beaucoup de courage et de plaisir.

12. Sommaire SOMMAIRE ABREVIATIONS ET ACRONYMES LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX INTRODUCTION …………………………………………………………………………………………………… 1 OBJECTIFS DE LA THESE ………………………………………………………………………………. 3 I.ETAT DE L’ART I.1 La semence …………………………………………………………………………………………………………. 4 I.1.1 Vision globale …………………………………………………………………….. 4 I.1.2 Structure de la graine ……………………………………………………………... 4 I.1.3 Types de graines ………………………………………………………………….. 5 I.1.4 Les réserves ……………………………………………………………………….. 5 I.1.5 La dessiccation ……………………………………………………………………. 6 I.1.6 La longévité des semences………………………………………………………… 7 I.1.7 Qualité de semences……………………………………………………………….. 7 I.2 La germination …………………………………………………………………………………………………… 7 I.2.1 Définition …………………………………………………………………………. 7 I.2.2 Types de germination ……………………………………………………………... 8 I.2.3 Les phases de germination ………………………………………………………... 9 I.2.4 Régulation de la germination ……………………………………………………... 10 I.2.5 Les inaptitudes à la germination ………………………………………………….. 11 I.2.6 La régulation de la dormance ……………………………………………………... 11 I.2.7 Hétérogénéité de la germination ………………………………………………….. 12 I.3 Les espèces réactives d'oxygène (ERO ou ROS) et la germination …. 13 I.3.1 Définition …………………………………………………………………………. 13 I.3.2 Formation des espèces réactives d’oxygène (ERO) ………………………………. 15 I.3.3 Les mécanismes antioxydants …………………………………………………….. 22 I.3.4 Stress Oxydatif ……………………………………………………………………. 28 I.3.5 Effets délétères des ERO …………………………………………………………. 28 I.3.6 Effets bénéfiques des ERO ……………………………………………………….. 29 I.3.7 ERO et Germination : La fenêtre oxydative ……………………………………… 30 I.4 Les traitements prégerminatifs des semences (priming) …….………………. 34 I.4.1 Définition …………………………………………………………………………. 34 I.4.2 Types d'endurcissement …………………………………………………………... 35 I.4.3 Mécanismes de l'endurcissement …………………………………………………. 38

13. Sommaire I.5 Le stress hydrique ……………………………………………………………………………………………. 43 I.5.1 Définitions et concepts ……………………………………………………………. 43 I.5.2 Le statut hydrique de la plante ……………………………………………………. 44 I.5.3 Les phases du stress ………………………………………………………………. 45 I.5.4 Les stratégies adaptatives aux stress ……………………………………………… 45 I.5.5 Les effets d'un stress hydrique ……………………………………………………. 46 I.5.6 La tolérance au stress hydrique …………………………………………………… 48 I.6 La plante : Le haricot à œil noir ou Vigna unguiculata ………………………… 53 I.6.1 Description ………………………………………………………………………... 53 I.6.2 Intérêt de la plante ………………………………………………………………… 53 I.6.3 Exigences de la plante …………………………………………………………….. 54 I.6.4 Importance économique…………………………………………………………... 54 II.MATERIEL ET METHODES II.1 Matériel végétal ……………………………………………………………………………………………… 55 II.2 Méthodes d'études ………………………………………………………………………………………… 55 II.2.1 Traitements prégerminatifs des semences ……………………………………….. 55 II.2.2 Étude physiologique des semences et mise en culture …………………………... 57 II.2.2.1 Cinétique d’imbibition des semences ayant subi des traitements prégerminatifs…….. 57 II.2.2.2 La germination………………………………………………………………............... 57 II.2.2.3 Taux de survie dans des conditions stressantes (PEG 20 %)…………………………. 58 II.2.2.4 La croissance linéaire des radicules …………………………………………………. 58 II.2.2.5 Fuite des électrolytes des graines …………………………………………………….. 58 II.2.2.6 Densité des graines …………………………………………………………………… 59 II.2.3 Étude à l’échelle de l’embryon …………………………………………………... 59 II.2.3.1 Prélèvement des embryons ………………………………………………………........ 59 II.2.3.2 La teneur en eau des embryons ………………………………………………………. 60 II.2.3.3 Analyses biochimiques ………………………………………………………………... 60 II.2.3.4 Analyses cytochimiques ………………………………………………………………. 66 II.2.4 Étude des plantes issues des différents types de graines ………………………… 67 II.2.4.1 Mise en pots …………………………………………………………………………... 67 II.2.4.2 Application de stress sur les plantules ……………………………………………….. 67 II.2.4.3 Mesure de la croissance linéaire des parties aériennes ……………………………… 67 II.2.4.4 Étude physiologique et biochimiques des plantes stressées ………………………….. 67 II.2.5 Estimation de la longévité des graines traitées …………………………………... 70 II.2.6 Pourcentage de variation ………………………………………………………… 70 II.2.7 Tests statistiques ………………………………………………………………… 70 III.RESULTATS ET DISCUSSION III.1 État des graines après traitement ………………………………………………………… 71 III.2 Germination et émergence ………………………………………………………………………… 72 III.2.1 Germination ……………………………………………………………………... 72 III.2.1.1 En conditions favorables ………………………………………………………. 72

14. Sommaire III.2.1.2 En conditions de stress osmotique ……………………………………………….. 75 III.2.2 Fuite des électrolytes …………………………………………………………… III.2.3 Taux de survie des plantules dans des conditions osmotisantes (PEG 20 %) …... 77 79 III.2.4 Croissance des radicules ………………………………………………………… 80 III.2.4.1 En conditions favorables ………………………………………………………... 80 III. 2.4.2 En conditions de stress osmotique (PEG 20 %) …………………………………... 81 III.2.5 Discussion ……………………………………………………………................. 84 III.3 Étude à l’échelle de l’embryon ………………………………………………………………………. 87 III.3.1 Teneur en eau des embryons ……………………………………………………. 87 III.3.2 Analyses biochimiques ………………………………………………………….. 89 III. 3.2.1 Protéines ………………………………………………………………………. 89 III.3.2.2 Acides aminés …………………………………………………………………... 94 III. 3.2.3 Glucides ……………………………………………………………………….. 105 III.3.2.4 Discussion…………. …………………………………………………………….. 114 III.3.3 Systèmes anti-oxydants et espèces réactives d’oxygène ………………………….. 115 III.3.3.1 Activités enzymatiques antioxydantes …………………………………………………. 115 III.3.3.2 Production d’espèces réactives d’oxygène (ERO) au niveau de l’embryon…………… 121 III.3.3.3 Discussion ……………………………………………………………………………... 125 III.4 Conséquences du priming sur des plantes soumises à un stress hydrique 127 III.4.1 La croissance linéaire des plantes ……………………………………………….. 127 III.4.2 La teneur relative en eau (TRE) ………………………………………………… 130 III.4.3 La conductance stomatique ……………………………………………………... 132 III.4.4 L'intégrité membranaire ………………………………………………………… 133 III.4.5 Teneurs en proline libre ………………………………………………………… 135 III.4.6 Teneurs en pigments photosynthétiques ………………………………………... 136 III.4.7 Discussion …………………………………………………………………….... 140 III.5 Longévité des graines redéshydratées (ageing) ………………………………………………. 142 CONCLUSION ET PERSPECTIVES …………………………………………………. 144 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ……………………………………………… 148

15. Abréviations et acronymes ABREVIATIONS ET ACRONYMES 1O2 : Oxygène singulet 3h Double hydro : Double cycle de redéshydratation (2 x 3 heures) 3h hydro : 3 heures d’imbibition dans l’eau distillée suivie d’une redéshydratation 6h hydro : 6 heures d’imbibition dans l’eau distillée suivie d’une redéshydratation 6h Imbib : 6 heures d’imbibition (simple) dans l’eau distillée ABA : Acide abscissique ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ADP : Adénosine diphosphate AIA : Acide Indole Acétique AOX : Oxydase Alternative APX : Ascorbate peroxydase ARN : Acide ribonucléique ARNm : ARN messager Asc oxyd : Ascorbate oxydé ATP : Adénosine Tri Phosphate C : Concentration de la substance Car : Caroténoïdes Cat : Catalase CCM : Chromatographie sur couche mince Chl : Chlorophylle Chl* : Chlorophylle excitée CTE : Chaine de Transport d’Électrons Cv : Coefficient de vélocité Cytb6/f : Cytochrome b6/f CTE : Chaine de transport d’électrons D.O : Densité optique DAB : 3,3’ diaminobenzidine DHA : Dehydroascorbate EDTA : acide éthylènediamine tétraacétique ERO : Espèces réactives d’oxygéne FAD : Flavine Adénine Dinucléotide oxydée FADH : Flavine adénine dinucléotide (forme réduite). Fdx : Ferrédoxine GA : Acide gibbérellique GPOX : Gaïacol Peroxydase GPX : Glutathion Peroxydase GR : Glutathion Réductase HO° : radical hydroxyle HSP : Heat-shock protein KDa : kiloDalton LEA : Late embryogenesis abundant MDA : Malondialdehyde MIP: Protéines intégrées à la membrane (aquaporines) MnSOD : SOD à manganèse MVF : Matière végétale fraiche MVS : Matière végétale sèche NAD : Nicotinamide adenine dinucleotide NAD(P) : Nicotinamide Adenine Dinucléotide phosphate NADH : nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite) NBT : Nitro Blue Tétrazolium O2 : Oxygène O2 °- : Anion superoxyde P : Pression de turgescence p/v : Rapport poids / volume PAL : La phénylalanine ammonia-lyase PEG 10 % : 6 heures d’imbibition dans le PEG à 10 % PEG 30 % : 6 heures d’imbibition dans le PEG à 30 % PEG: Polyéthylène glycol PMVF : Poids de la matière végétale fraiche PMVS : Poids de la matière végétale sèche POX : Peroxydases prot : Protéines PSI : Photosystème I PSII : Photosystème II PT : Poids à la turgescence Q : Quinones QA et QB : Plastoquinones QTL : Quantitative Trait Locus R : Coefficient de corrélation SOD : Superoxyde dismutase tr/min : Tours / minutes TRE : Teneur relative en eau Tris : tris (hydroxyméthyl) aminométhane V : Volume v/v : Rapport volume / volume ε: Coefficient d’extinction molaire. π : Potentiel osmotique ρ : Densité ψ fol : Potentiel hydrique foliaire

16. Liste des figures et tableaux LISTE DES FIGURES ET DES TABLEAUX Figures Figure 01 : Origine des diverses structures constitutives des semences. 4 Figure 02 : Schémas d’une graine du haricot sans téguments avec et sans cotylédons. 5 Figure 03 : Schémas représentant la germination hypogée (A) et épigée (B). 8 Figure 04 : Principaux événements liés à la germination. 9 Figure 05 : Modèle de régulation de la dormance et de la germination par l’acide abscissique (ABA) et l’acide gibbérellique (GA) en réponse à l’environnement. 12 Figure 06 : Espèces réactives d'oxygène (ERO) radicalaires et non radicalaires. 14 Figure 07 : Représentation du transport d’électrons photosynthétique, source d’espèces réactives de l’oxygène. 17 Figure 08 : Représentation schématique de la chaîne de transfert des électrons de la membrane mitochondriale interne. 19 Figure 09 : Caractéristiques principales du métabolisme de la photorespiration. 20 Figure 10 : Production et élimination des formes activées de l’oxygène (ERO) chez les plantes. 24 Figure 11 : Réaction de la peroxydase utilisant le gaïacol comme substrat. 26 Figure 12 : Schématisation de la balance entre les ERO et les antioxydants. 28 Figure 13 : Représentation schématique de l'évolution de la teneur en H2O2 dans les graines de tournesol au cours de leur développement, après la maturation, pendant la germination et le vieillissement. 32 Figure 14 : Modèle hypothétique proposant un rôle central des ERO dans la levée de la dormance et la germination des graines. 33 Figure 15 : Le modèle de l'absorption d'eau et des événements métaboliques pendant l'amorçage des semences. 43 Figure 16 : De multiples fonctions de la proline dans les plantes. 51 Figure 17 : Distribution et localisation des protéines induites par le stress dans la cellule végétale. 52

17. Liste des figures et tableaux Figure 18 : A: Les graines de Vigna unguiculata. B: Morphologie de la partie aérienne de Vigna unguiculata. 55 Figure 19 : Redéshydratation des graines. A: Imbibition des graines dans l'eau distillée. B: Séchage des graines sous ventilation. 56 Figure 20 : Graines de Vigna unguiculta. A: Graines témoins. B: Graines redéshydratées. 57 Figure 21 : Mesure du lessivage des électrolytes. A: Imbibition des graines. B: Le conductimètre utilisé. 59 Figure 22 : Prélèvement des embryons du haricot à œil noir «Vigna unguiculata ». 60 Figure 23 : Les trois organes de la graine. A: Cotylédons. B: Radicules. C: Gemmules. 60 Figure 24 : Plantules de Vigna unguiculata âgées de deux jours. 66 Figure 25 : La mise en pots des plantules de Vigna unguiculata dans la chambre de culture. 67 Figure 26 : Le poromètre et son utilisation. 69 Figure 27 : Imbibition des graines de Vigna unguiculata témoins et amorcées. 71 Figure 28 : La masse volumique des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. 72 Figure 29 : Cinétique d’imbibition de graines de Vigna unguiculata (haricot à œil noir) selon les différents des traitements prégerminatifs. 73 Figure 30 : Photos montrant la germination des graines de Vigna unguiculata (haricot à œil noir) après 14 heures de mise en germination dans l'eau. 73 Figure 31: Effets de différentes méthodes d'amorçage sur la germination des semences de Vigna unguiculata dans l'eau distillée. A: Vitesse de germination. B: Capacité de germination. C: Photos montrant la germination des semences au premier jour de la mise en germination. 75 Figure 32 : Effets de différentes méthodes d'amorçage sur la germination des semences de Vigna unguiculata (haricot à œil noir) en conditions osmotisantes (PEG à 20 %). A: Vitesse de germination. B: Capacité de germination. C: Photos montrant la germination des semences au troisième jour de la mise en germination. 77 Figure 33: Évolution de la conductivité des lessivats des graines de Vigna unguiculata témoins et amorcées au cours de la germination. 78

18. Liste des figures et tableaux Figure 34: Effets de différentes méthodes d'amorçage sur le taux de survie des plantules issues des semences de Vigna unguiculata témoins et traitées mises à germer dans le PEG à 20 %. 79 Figure 35: Photos montrant des plantules âgées de sept jours issues des semences témoins et traitées de Vigna unguiculata mises à germer dans le PEG à 20 %. 80 Figure 36: Effets de différentes méthodes d'amorçage sur la longueur des radicules (cm) des plantules âgées de deux jours issues des semences de Vigna unguiculata témoins et traitées mises à germer dans l’eau distillée et dans le PEG à 20 %. 81 Figure 37: Photographies montrant la croissance des radicules des plantules âgées de c jours issues des semences de Vigna unguiculata témoins et traitées mises à germer dans l’eau. 81 Figure 38: Photographies montrant les radicules des plantules âgées de sept jours issues des semences de Vigna unguiculata témoins et traitées mises à germer en dans une solution de PEG à 20 %. 82 Figure 39: Teneurs en eau des cotylédons, de la radicule et de la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées après deux heures d'imbibition. 88 Figure 40: Évolution de la teneur en protéines totales au cours de la germination des graines témoins de Vigna unguiculata chez les cotylédons, la radicule et la gemmule. 90 Figure 41: Teneurs en protéines totales des cotylédons, de la radicule et de la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. A: Teneurs en mg par g de MVF. B: Teneurs en mg par organe. 92 Figure 42: Teneurs en protéines totales des plantules âgées de deux jours issues des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. 93 Figure 43: Teneurs en acides aminés libres totaux des cotylédons, de la radicule et de la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. A: Teneurs en mg par g de MVF. B: Teneurs en µg par organe. 95 Figure 44: Rapport acides aminés totaux / protéines totales. 96 Figure 45: Teneurs en proline libre des cotylédons, de la radicule et de la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. A: Teneurs en mg par g de MVF. B: Teneurs en µg par organe. 98 Figure 46: Rapport proline libre / acides aminés totaux. 99 Figure 47: Chromatographie sur couche minces des acides aminés des cotylédons. 101

19. Liste des figures et tableaux Figure 48: Chromatographie sur couche minces des acides aminés de la gemmule. 102 Figure 49: Chromatographie sur couche minces des acides aminés de la radicule. 103 Figure 50: Teneurs en amidon des cotylédons, de la radicule et de la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. A: Teneurs en mg par g de MVF. B: Teneurs en µg par organe. 106 Figure 51: Teneurs en sucres solubles des cotylédons, de la radicule et de la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. A: Teneurs en mg par g de MVF. B: Teneurs en µg par organe. 108 Figure 52: Chromatographie sur couche minces des sucres solubles des cotylédons. 110 Figure 53: Chromatographie sur couche minces des sucres solubles de la gemmule. 111 Figure 54: Chromatographie sur couche minces des sucres solubles de la radicule. 112 Figure 55: Activité de la catalase chez les cotylédons, la radicule et la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. 116 Figure 56: Activité de l'ascorbate peroxydase chez les cotylédons, la radicule et la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. 117 Figure 57: 57 Activité de la gaïacol peroxydase chez les cotylédons, la radicule et la gemmule prélevés des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. 118 Figure 58: Activité de la gaïacol peroxydase au niveau des jeunes plantules âgées de deux jours issuses des graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. 120 Figure 59: 59: Photographies montrant la mise en évidence du peroxyde d’hydrogène par le DAB dans les embryons prélevés de graines témoins et traitées. 122 Figure 60 : Photographies d’un embryon représentatif de chaque lot prises sous loupe binoculaire (Gr ×10). 122 Figure 61: Photographies montrant la mise en évidence du l’anion superoxyde par le NBT dans les embryons prélevés de graines témoins et traitées. 123 Figure 62: Photographies d’un embryon représentatif de chaque lot prises sous loupe binoculaire (Gr ×10). 124 Figure 63: Effets des traitements prégerminatifs sur la croissance linéaire des parties aériennes des plantules de Vigna unguiculata âgées d’un mois en conditions normales et en conditions de stress hydrique. 127 Figure 64: Croissance des parties aériennes des plantules âgées de quinze jours issues des semences de Vigna unguiculata témoins et traitées (conditions non stressantes). A: Stade première feuille. B: Stade deuxième feuille. C: Stade troisième feuille. 128

20. Liste des figures et tableaux Figure 65: Effets d'un stress hydrique (arrêt d'arrosage pendant quinze jours) sur les plantes de Vigna unguiculata âgées d’un mois issues des semences témoins et traitées. Zones de feuilles stressées. 129 Figure 66: Les plantes de Vigna unguiculata âgées deux mois issues des semences témoins et traitées, après un réarrosage. A: Stade feuille. B: Stade floraison. C: Stade formation de la gousse. 130 Figure 67: Teneur relative en eau (TRE) des plantes stressées âgées d’un mois issues de graines Vigna unguiculata témoins et traitées. 131 Figure 68: La conductance stomatique des plantes stressées issues de graines Vigna unguiculata témoins et traitées. 133 Figure 69: L'intégrité membranaire des plantes stressées issues de graines Vigna unguiculata témoins et traitées. 134 Figure 70: Teneurs en proline libre des plantes stressées issues de graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. 136 Figure 71: Teneurs en chlorophylles a, b et totales des plantes stressées issues de graines de Vigna unguiculata témoins et traitées. 137 Figure 72: Teneurs en caroténoïdes (A) et le rapport caroténoïdes / chlorophylles totales (B) des plantes stressées issues de graines Vigna unguiculata témoins et traitées. 139 Figure 73: Longévité des graines de graines Vigna unguiculata redéshydratées. A : Cinétique de la capacité de la germination durant une année après l'application de l'hydropriming. B : Photographies montrant des plantules âgées de quatre jours issues de graines doublement redéshydratées après différents temps de conservation. 142 Figure 74: Modèle expliquant les mécanismes impliqués dans le phénomène de l’endurcissement induit par hydropriming et osmopriming. 147

21. Liste des figures et tableaux Tableaux Tableau 01 : Propriétés physico-chimiques des espèces réactives de l’oxygène. 15 Tableau 02 : Sources d’espèces réactives de l’oxygène lors du fonctionnement cellulaire intrinsèque chez les plantes. 16 Tableau 03 : Sources d’espèces réactives de l’oxygène chez les plantes en situation d’interactions biotiques. 22 Tableau 04 : Rôles et localisations subcellulaires des principales enzymes antioxydantes. 23 Tableau 05 : Rôles et localisations subcellulaires des principales molécules antioxydantes. 27 Tableau 06 : Synthèse des principaux travaux sur l’hydropriming des semences de différentes espèces cultivées. 35 Tableau 07 : Synthèse des principaux travaux sur l’osmopriming des semences de différentes espèces cultivées. 37 Tableau 08 : Composition chimique de la graine de Vigna unguiculata 53 Tableau 09 : Principaux résultats de la germination des graines de Vigna unguiculata traitées et témoins dans des conditions normales et osmotisantes (PEG à 20 %). 83 Tableau 10 : Pourcentage de variation (par rapport au témoin) des paramètres physiologiques. 83 Tableau 11 : Pourcentage de variation (par rapport au témoin) de la teneur relative en eau des cotylédons, de la radicule et de la gemmule. 89 Tableau 12 : Pourcentage de variation (par rapport au témoin) des teneurs en protéines totales et en acides aminés totaux et du rapport acides aminés totaux / protéines totales. 97 Tableau 13 : Pourcentage de variation (par rapport au témoin) des teneurs en proline libre et du rapport proline libre / acides aminés totaux. 100 Tableau 14 : Composition des cotylédons en acides aminés selon le traitement des graines de Vigna unguiculata. 101 Tableau 15 : Composition de la gemmule en acides aminés selon le traitement des graines de Vigna unguiculata. 102 Tableau 16 : Composition de la radicule en acides aminés selon le traitement des graines de Vigna unguiculata. 103

22. Liste des figures et tableaux Tableau 17 : Pourcentage de variation (par rapport au témoin) des teneurs en sucres solubles et en amidon. 109 Tableau 18: Identification des sucres solubles contenus dans les cotylédons des graines témoins et traitées. 110 Tableau 19 : Identification des sucres solubles contenus dans la gemmule des graines traitées et témoins. 111 Tableau 20 : Identification des sucres solubles contenus dans la radicule des graines traitées et témoins. 112 Tableau 21 : Pourcentage de variation (par rapport au témoin) des activités enzymatiques antioxydantes. 121 Tableau 22 : Pourcentage de variation (par rapport au témoin) de la croissance linéaire en conditions favorables et stressantes (déficit hydrique) des plantes issues de graines traitées et non traitées. 130 Tableau 23 : Pourcentage de variation (par rapport au témoin) des paramètres physiologiques et biochimiques des plantes issues de graines traitées et non traitées en conditions de stress hydrique. 140

23. INTRODUCTION

24. Introduction 1 INTRODUCTION La production végétale et l'établissement d’une bonne agriculture dépendent étroitement de la germination des semences qui est une étape cruciale dans le cycle de vie des végétaux supérieurs (Cheng and Bradford, 1999). Or, la germination peut être hétérogène vu que les semences ne germent pas toutes de la même manière ni en même temps. En outre, les graines et les plantes sont souvent soumises à des contraintes abiotiques sur le terrain, telles que la faible disponibilité en eau, ce qui est le cas dans les régions arides et semi-arides, la salinité du sol, les températures extrêmes (basses ou élevées) (Ghassemi-Golezani et al., 2008). Ceci provoque l’inhibition de la germination des graines sur le terrain et le flétrissement des plantes. Afin de résoudre ces problèmes et d’améliorer les performances germinatives, le développement et le rendement des espèces végétales ainsi que leur tolérance aux stress abiotiques, plusieurs approches ont été utilisées depuis plusieurs années (Basra et al., 2003). La technique la plus fréquente et la plus commune est l’amorçage ou traitement de prégermination, souvent dénommé « Priming ». C’est une méthode physiologique qui améliore la production végétale en modulant les activités métaboliques de la germination avant l'émergence de la radicule (Bradford, 1986; Taylor and Harman, 1990). Cette technique est basée sur le fait que la germination peut être divisée en plusieurs étapes et qu'elle peut être interrompue par divers procédés juste avant l'émergence radiculaire à travers les téguments de la semence. Ces procédés de prégermination doivent tenir compte de plusieurs paramètres pouvant influer sur le développement de la semence tels que : l'état physiologique de la semence, la quantité d'eau utilisée pour le traitement (quantité suffisante pour déclencher un certain nombre de transformations biochimiques, moléculaires, mais insuffisante pour que la radicule perce les téguments), la durée du traitement, la température à laquelle est conduite le traitement, ou la nature de la méthode utilisée pour déclencher la prégermination des semences (osmo-ou hydro- prégermination par exemple) (Ôzbingol et al., 1998). Les méthodes d'amorçage des semences peuvent être divisées en deux groupes selon que l'absorption d'eau est incontrôlée (hydro et hormopriming) ou contrôlée (osmopriming) (Taylor et al, 1998.). L’osmopriming est le type d'amorçage de semences le plus commun. Il consiste à faire subir aux graines un traitement prégerminatif osmotique seul ou suivi d’une redéshydratation. Cette hydratation contrôlée des semences est réalisée grâce à des agents osmotiques tels que le polyéthylène glycol (PEG), les sels (KNO3, NaCl, KCl) ou les glucides (mannitol) (Bradford, 1986; Yari et al., 2010). L’hydropriming ou la redéshydratation est la technique d’amorçage la plus simple et la moins coûteuse qui consiste à imbiber avec de l'eau les semences puis à les déshydrater avant de les semer (Tarquis and Bradford, 1992). Le priming des semences induit, en général, des modifications aux niveaux physiologique, biochimique, cellulaire, moléculaire et génétique telles que la mobilisation des réserves, la dégradation de l'albumen, l’activation des systèmes anti oxydatifs, la stimulation de la synthèse des osmolytes et l’activation du cycle cellulaire et de certains gènes de tolérance aux stress abiotiques (Bray et al., 1989 ; De Castro et al., 2000 ; Varier et al., 2010). L’objectif de cette thèse est d’étudier les effets de l’osmopriming (PEG6000 à 10 et 30 %), de l’hydropriming (un cycle de redéshydratation) et d’un nouveau type de traitement prégerminatif qui consiste en un double hydropriming (deux cycles de redéshydratation), sur la

25. Introduction 2 germination et la croissance des graines de Vigna unguiculata (haricot à œil noir) en conditions favorables et stressantes. Afin d'élucider les mécanismes impliqués dans le phénomène de l'endurcissement, nous nous somme proposés d'étudier, également, les modifications physiologiques et biochimiques qui se produisent au niveau de l’axe embryonnaire (radicule et gemmule) et des cotylédons des graines de Vigna unguiculata. Dans ce cadre, nous nous intéresserons, dans un premier lieu, à l'évolution quantitative des réserves protéiques et glucidiques (amidon), de leurs produits de dégradation tels que les acides aminés et les sucres solubles, ainsi qu’aux osmolytes tels que la proline libre. Nous tenterons également d'identifier les éventuelles modifications qualitatives des acides aminés et des sucres solubles par une approche chromatographique (chromatographie sur couche mince). Ensuite, nous étudierons les changements de l’état redox provoqués au cours de l’endurcissement en : ✓ Mesurant les activités enzymatiques anti-oxydatives de la catalase, l’ascorbate peroxydase et la gaïacol peroxydase, ✓ Mettant en évidence, par des tests cytochymiques, la production des espèces réactives d’oxygène ou ERO (peroxyde d’hydrogéne et anion superoxyde) au niveau des tissus embryonnaires. Afin d’évaluer les effets de l’endurcissement sur la tolérance à une contrainte hydrique (induite par un arrêt d’arrosage) des plantes issues des graines traitées, nous mesurerons la croissance linéaire, la teneur relative en eau, la conductance stomatique, l’intégrité membranaire ainsi que la teneur en proline libre et en pigments photosynthétiques. En parallèle, nous nous intéresserons à la longévité des graines ayant subi un hydropriming (simple et double), une année après l’application de la redéshydratation. Le corps de la thèse sera ainsi structuré : Une Synthèse bibliographique à travers laquelle sera fait le point sur les connaissances passées et actuelles relatives à la terminologie usitée, semences, germination, endurcissement, formes réactives d’oxygène, stress oxydatif et stress hydrique ainsi que sur la plante utilisée pour ce travail. Une partie expérimentale dans laquelle nous détaillerons toutes les méthodes et les techniques utilisées Une partie consacrée à l’exposition des résultats obtenus et leurs interprétations Une conclusion générale qui reprendra les principaux résultats obtenus et tracera des perspéctives à donner à ce travail.

26. Objectifs de la thèse 3 Objectifs de la thèse Notre thèse a comme objectifs : 1/ L’étude des effets de différents types de traitement prégerminatif, à savoir l’osmopriming (PEG6000 à 10 et 30 %), l’hydropriming (un cycle de redéshydratation), et surtout, le double hydropriming (deux cycles de redéshydratation), sur la germination et la croissance de Vigna unguiculata (haricot à œil noir) en conditions favorables et stressantes. 2/ La compréhension des mécanismes physiologiques et biochimiques régissant l’endurcissement des semences de Vigna unguiculata, au niveau des cotylédons, de la radicule et de la gemmule. 3/ L’étude des changements de l’état redox au niveau de l’axe embryonnaire et des cotylédons lors de la germination d’une part et de l’endurcissement d’autre part, par l’estimation des activités enzymatiques antioxydantes et la production des formes actives d’oxygéne (ERO). 4/ L’étude de l’effet du traitement prégerminatif des semences de Vigna unguiculata sur la tolérance à une contrainte hydrique des plantes issues de ces graines. 5/ Le suivi de la longévité de gaines ayant subi un hydropriming (simple et double) durant une année après application de la redéshydratation.

27. 4 ETAT DE L’ART

28. 4 I.ETAT DE L’ART I.1. La Semence I.1.1 Vision globale La graine (ou le grain) est un des facteurs de dissémination des espèces végétales chez les spermaphytes (plantes à fleurs). Elle est issue de la reproduction sexuée allogame (fécondation croisée entre deux individus) ou autogame (autofécondation). L’individu formé est donc différent de la plante mère. Chez beaucoup d’espèces, la reproduction végétative complète voire supplante la reproduction sexuée. Elle se fait alors à partir de tiges spécialisées (stolons, rhizomes, tubercules), ou des bulbes (bulbilles), ou bien à partir de drageons (racines horizontales). En revanche, pour de nombreuses espèces annuelles, la semence est l’unique vecteur de propagation. C’est le cas notamment pour les plantes cultivées que sont le blé, le maïs, le soja, le haricot, la lentille… etc. (Gimeno-Gilles, 2009). I.1.2 Structure de la graine La double fécondation caractéristique des Angiospermes conduit à la formation de la graine. L’œuf principal donnant l’embryon (l'élément principal de la graine) avec des ébauches de gemmule et de radicule, l’œuf accessoire aboutissant à la formation de l’albumen ou tissu de réserves nécessaires au développement de la plantule avant l’acquisition de l’autotrophie. Les téguments de l’ovule donnent pour leur part les téguments de la graine alors que la paroi de l’ovaire donne le péricarpe du fruit (Baud et al., 2002; Gallardo et al., 2006). Figure 01 : Origine des diverses structures constitutives des semences (d'après Côme, 1970).

29. État de l’art 5 I.1.3 Types de graines A la fin de l’embryogénèse, la division cellulaire s’estompe progressivement et fait place à une expansion cellulaire qui accompagne le remplissage des graines par les réserves (Baud et al., 2002 ; Gallardo et al., 2007). D’où, on distingue plusieurs types de graines selon les tissus de réserves formés (Mazliak, 1982) : I.1.3.1 Les graines albuminées : avec un albumen triploïde (3n) abondant, sans reste de nucelle et un embryon (parfois très petit) à cotylédons minces. Exemple : les céréales. I.1.3.2 Les graines exalbuminées : caractérisées par de gros cotylédons occupant tout l'espace interne et ayant digéré albumen et nucelle (albumen absent). Exemple : les légumineuses. I.1.3.3 Les graines périspermées : c'est un modèle peu fréquent, caractérisé par la présence d'un périsperme qui est un tissu nourricier diploïde (2n) issu de nucelle, ce périsperme peut être accompagné ou pas d'un peu d'albumen. Exemple : le caféier, les piperaceae… Remarque : au cours de son développement l'albumen digère le nucelle, mais pas toujours complètement. Cette portion persistante du nucelle est appelée périsperme. I.1.3.4 Les graine à endosperme : présentent un endosperme haploïde (n) qui provient du gamétophyte femelle. C’est le cas des conifères. Figure 02 : Schémas d’une graine du haricot sans téguments avec et sans cotylédons (Gaussen et al., 1982). I.1.4 Les réserves Dans le cycle de vie des spermatophytes, la graine est le stade vital qui permet la protection de l’embryon végétal (nouvel individu) grâce à son enveloppe durcie, et de nutrition grâce à des réserves de substances nourricières. Les graines ont en effet la propriété d’accumuler des réserves destinées au développement futur de l’embryon en jeune plantule. Les semences fournissent également la base de la nourriture aux quelques milliards d'êtres humains (Dubos, 2001). Elles sont utilisées comme aliments par les animaux et l'homme parce qu'effectivement les graines contiennent toute une série de réserves tout aussi importantes les unes que les autres.

30. État de l’art 6 On y trouve des réserves énergétiques comme l'amidon, mais on y trouve aussi des protéines qui ont des caractéristiques très variées et on y trouve aussi des lipides, en particulier ce qu'on appelle les triglycérides qui sont des lipides qui vont être très utiles à la graine lorsqu'elle va germer pour fournir de l'énergie par un mécanisme de dégradation de ses lipides qu'on appelle la beta-oxydation (Souana, 2011). I.1.4.1 Les protéines : sont présentes dans toutes les graines sous forme de grains d'aleurone accumulés dans les vacuoles avant la déshydratation. Les légumineuses représentent une source importante des protéines végétales. Plusieurs auteurs subdivisent les protéines en quatre classes : les albumines, les globulines, les gluténines et les prolamines. Les légumineuses contiennent des légumines et des vicilines appartenant à la classe des globulines. Elles sont stockées dans des corps protéiques de 0.1 à 25 µm de diamètre, grains d'aleurones, repartis dans tout l'organe de réserve, les cotylédons (Anzala, 2006). I.1.4.2 Les glucides : L’amidon représente la principale résèrve glucidique des graines. Il est localisé, sous forme de grains, au niveau des cellules de l'albumen, des cotylédons ou du périsperme. La cellulose et l’hémicellulose, constituants des parois, représentent une autre forme des glucides retrouvés au niveau des graines (Anzala, 2006). Chez la plupart des légumineuses, les résèrves glucidiques soit moins importantes que celles des protéines (Souana, 2011). I.1.4.3 Les lipides : chez les graines oléagineuses exploitées comme source d'huile. Exemple : arachide, colza, maïs, tournesol, soja, sésame, noix, le ricin, le lin, carthame, amandier, cocotier, cotonnier, cacaoyer,… La plus grande partie de ces réserves est constitué d'ester, de glycérol et d'acides oléique et palmitique, présents en gouttelettes de différentes tailles appelées oléosomes (Vallée et al., 1999). Chez les légumineuses les lipides constituent environ 10 % du poids sec (Djemel et al., 2005). Ainsi, parmi les réserves de la graine, il s'en trouve aussi qui sont des réserves minérales et donc au fond, la graine dispose de tout ce qu'il lui faut pour assurer son développement, son démarrage de germination, jusqu'à ce qu'elle puisse substituer à ses réserves de nouvelles ressources qui vont être constituées par le fait qu'elle va être capable de développer un appareil photosynthétique, utiliser la lumière et le gaz carbonique pour fabriquer des sucres (Bewley, 1997). I.1.5 La dessiccation Le développement des graines est divisé en trois grandes étapes : l’embryogenèse (formation de l’embryon), le remplissage (l’accumulation des réserves) et la dessiccation (la phase de quiescence) (Bewley and Black, 1994). A un stade plus ou moins précoce de son développement, l'embryon cesse sa croissance et entre dans un état de vie ralentie. Cette phase de repos s'accompagne d'une déshydratation importante « la dessiccation ». A ce stade, les graines dites orthodoxes renferment entre 5 et 10 % d’eau seulement (Corbineau and Côme 1989), ce qui permet à l'embryon, d'une part, de pouvoir attendre très longtemps les conditions favorables à la reprise de son activité (germination) et, d'autre part, de résister aux agressions extérieures (Dubos, 2001). Ainsi, les téguments de la graine sont protecteurs et imperméables, ils empêchent tout échange avec le milieu extérieur. Or sans échanges, on ne peut plus parler de vie. La graine sèche est donc un système fermé, en vie latente.

31. État de l’art 7 La tolérance des graines à la dessiccation, ou la capacité à survivre à une perte d’eau cellulaire quasi-totale, est acquise pendant le remplissage, puis perdue lors de la germination (Leprince et al., 1990 ; Hong and Ellis, 1992). Les différents organes de la graine acquièrent la tolérance de façon asynchrone (Leprince et al., 1990; Leprince et al., 1993). De plus, la tolérance à la dessiccation, tout comme la capacité des graines à germer, peut être acquise avant, pendant ou après que les graines aient atteint leur maturité de masse en fonction de l’espèce (Probert et al., 2007). Des protéines spécifiques s’accumulent durant cette phase de quiescence afin d’assurer la tolérance à la dessiccation dont les plus importantes sont les LEA (Late Embryogenesis Abundant) (Han et Kermode, 1996) (Voir partie réservée aux protéines de stress hydrique). La dissémination se fait directement par la graine lorsqu'elle est libérée dans le milieu, ou indirectement lorsqu'elle reste à l'intérieur du fruit. Dans ce cas, plusieurs unités de dispersion (Evenari, 1961) peuvent assurer la dissémination : une partie du fruit, le fruit entier, plusieurs fruits groupés, quelquefois même la plante entière. I.1.6 La longévité des semences On appelle longévité, le temps au bout duquel une graine ne peut plus germer. Cette durée est différente selon les espèces. En général, les graines possédant des téguments très durs ont une grande longévité. Cette longévité est, également, liée à la nature des réserves. Ewart (1908) classe les semences en trois catégories : les semences macrobiotiques (les Poaceae), qui vivent plus de 15 ans, les semences mésobiotiques, les plus nombreuses, qui ont une durée de vie comprise entre 3 et 15 ans, et les semences microbiotiques, qui ne survivent pas plus de trois ans (les oléagineuses). Certaines perdent leur capacité de germination au bout de après quelques jours (Oxalis sp.) ou quelques semaines seulement (Populus sp.). I.1.7 Qualité de semences Chez les espèces cultivées, sont considérées comme semences de bonne qualité, des semences qui: • Germent toutes. • Germent vite. • Donnent des plantules normales et vigoureuses. • Sont peu sensibles aux facteurs du milieu (température, oxygénation, potentiel hydrique du sol, salinité……..) et donc qui germent dans des conditions très diverses. • Se conservent bien. Ces propriétés permettent une bonne vigueur germinative (Rajjou et al., 2012). I.2. La germination La production végétale et l'établissement de bonnes cultures agricoles dépendent étroitement de la germination des semences qui est une étape cruciale dans le cycle de vie des végétaux supérieurs (Cheng and Bradford, 1999). I.2.1 Définition Après la phase de quiescence et lorsque les conditions de l’environnement sont favorables, le développement de l’embryon reprend. L’axe embryonnaire s’allonge alors dans

32. État de l’art 8 les deux sens. L’hypocotyle, qui présente un gravitropisme négatif, amène le méristème apical et les cotylédons hors de terre. Les cotylédons fournissent les réserves énergétiques qui sont alors mobilisées pour la croissance. Ils verdissent, signifiant l’acquisition de l’activité photosynthétique avant la mise en place des premières feuilles à partir du méristème apical. La radicule, elle, possède un gravitropsime positif et permet au méristème racinaire de s’enfoncer pour développer des racines (Gimeno-Gilles, 2009). Entre le stade de graine sèche quiescente et le développement de la plantule existe une phase transitoire qui se termine lorsque la radicule perce les téguments. A ce moment, la graine est considérée comme germée. La germination est donc définie comme la phase transitoire entre le stade graine sèche et l’apparition de la radicule (Bewley and Black, 1994). Cette phase nécessite en premier lieu l’imbibition des tissus. Si les conditions physiologiques sont favorables (absence de dormance primaire) ainsi que les conditions environnementales (disponibilité en oxygène, eau, température adéquate), la germination est possible. Il est communément admis que la percée de la radicule est un phénomène dirigé par l’expansion cellulaire uniquement (Bewley, 1997) et non par la prolifération : les cellules radiculaires de la graine non dormante s’allongeraient donc en l’absence d’inhibition par le milieu. Les processus physiologiques qui se déroulent pendant cette phase sont très complexes. Cependant, l’activité peut se mesurer par le biais de plusieurs facteurs, principalement l'imbibition et la respiration. I.2.2 Les types de germination : On distingue deux types de germination (Hopkins, 1999). I.2.2.1 Germination épigée : L’hypocotyle (issu de la tigelle) est le premier à s’allonger, entraînant les cotylédons et les premières feuilles au-dessus du sol (fig. 03). La gemmule se développe et donne une tigelle feuillée au-dessus des deux cotylédons. C’est le cas de la plupart des Dicotylédones à l’exemple de Vigna unguiculata. I.2.2.2 Germination hypogée : L’hypocotyle reste court et compact (la tigelle ne se développe pas) et les cotylédons demeurent dans le sol (fig. 03). C’est plutôt l’épicotyle qui subit une élongation extensive, entraînant les premières feuilles au-dessus du sol. C’est le cas de certaines Dicotylédones (ex. petit pois, fève) et la plupart des graminées (Monocotylédones). Figure 03: Schémas représentant la germination hypogée (A) et épigée (B) Source : http://hortidact.eklablog.com A B

33. État de l’art 9 I.2.3 Les phases de germination Le processus de germination commence dès que la graine sèche est hydratée. La cinétique de prise d’eau permet de caractériser la germination en trois phases (Bewley, 1997) (fig. 4). Figure 04 : Principaux événements liés à la germination (d’après Bewley, 1997). La première phase ou phase d’imbibition est un phénomène d’entrée rapide et passive d’eau. Elle se déroule même si la graine n’est pas viable. Cette entrée d’eau est accompagnée d’une augmentation de la consommation d’oxygène attribuée à l’activation des enzymes mitochondriales qui vont fournir de l’ATP (Anzala, 2006). L’intensité respiratoire s’accroît très fortement au cours des premières heures de l'imbibition et s’accompagne parfois d’un dégagement de chaleur. La deuxième phase est la phase de germination au sens strict. Elle est caractérisée par une diminution de l’entrée d’eau ; l’hydratation des tissus et des enzymes est totale. La consommation en oxygène est stable. Durant cette phase, il y a reprise de la respiration et des activités métaboliques. La présence d’eau et d’oxygène permet l’activation des processus respiratoires et mitotiques. L’eau rend mobiles et actives les phytohormones hydrosolubles en stock dans la graine. C’est le cas des gibbérellines qui sont véhiculées vers la couche à aleurones où elles vont activer la synthèse d’hydrolases (telles que les -amylases, les protéinases, les lipases ou les nucléases) nécessaires à la dégradation des réserves, à la division et l’élongation cellulaire (Anzala, 2006). -Les -amylases hydrolysent l’amidon stocké dans l’albumen et libèrent des molécules de glucose, substrat du métabolisme respiratoire. -Les protéases lysent les réserves protéiques qui favorisent la formation de phytohormones telles que l’auxine responsable de l’élongation des cellules. Ainsi, les acides aminés issus de

34. État de l’art 10 cette hydrolyse sont utilisés dans la synthèse protéique ou intégrés dans le cycle de Krebs après transamination. -Les lipases dégradent les triglycérides en donnant du glycérol et des acides gras. Les acides gras sont ensuite oxydés en acétyl CoA puis transformés en glucides par le cycle glyoxylique ou intégrés dans le cycle de Krebs. -Les nucléases permettent la libération d’acides nucléiques impliqués dans la formation des cytokinines, hormones qui stimulent la division cellulaire. La phase de germination au sens strict se termine avec la percée du tégument par la radicule, rendue possible grâce à l’allongement des cellules. La troisième phase ou phase de croissance post-germinative est caractérisée à nouveau par une entrée d’eau et une augmentation importante de la respiration. La consommation de l’oxygène serait due aux enzymes néosynthétisées. I.2.4 Régulation de la germination I.2.4.1 Mode de formation des enzymes : Soit ces enzymes sont déjà présentes dans la graine et l’imbibition et la réhydratation des tissus permettent leur activité (cas d’enzymes de la respiration). Soit encore on peut assister à une activation d’enzymes préexistantes sous une forme inactive (action de protéases par exemple). Cependant dans le cas le plus fréquent, les enzymes sont synthétisées de novo dès le début de la germination. Dans cette synthèse d’enzymes, deux mécanismes ont été mis en évidence et qui peuvent, d’ailleurs, intervenir séquentiellement. • Stimulation de la transcription avec synthèse de nouveaux mRNA. • Stimulation de la traduction par une transition monosomes-polysomes (l’activité de traduction est beaucoup plus importante quand plusieurs ribosomes se déplacent sur une même molécule de RNA formant plusieurs copies du polypeptide dans un même temps). Dans ce second cas il faut considérer que des ARN préexistants sont dans les graines pour permettre la reprise rapide de la synthèse (Gimeno-Gilles, 2009). I.2.4.2 Contrôle hormonale de la transcription : Les interactions hormonales entre embryons et tissus de réserve dans l’action des gibbérellines sur la germination sont certainement très répandues. Par exemple chez le pois, l’ablation de l’embryon empêche la synthèse de protéases au niveau des cotylédons. La germination subit l’effet de certains facteurs extérieurs comme la disponibilité en eau, la température, qui a un impact direct sur le métabolisme, et sur le taux d’oxygène dissout, ainsi que la lumière qui agit de manière différente sur les espèces (elle inhibe la germination des espèces photosensibles négatives et stimule les photosensibles positives) (Gimeno-Gilles, 2009). Certaines caractéristiques internes de la graine influencent aussi la germination telles que la maturité de la graine (qui doit être complètement différenciée morphologiquement et ses réserves bien constituées), la longévité, la dormance de l’embryon ou bien les inhibitions tégumentaires (Côme, 1970).

35. État de l’art 11 On peut d’ailleurs souligner que les caractéristiques de germination des espèces cultivées résultent d’une sélection très poussée qui a contribué à éliminer un grand nombre de mécanismes de contrôles naturels et qui conduit à une germination rapide et uniforme nécessaire dans le cas des plantes cultivées. I.2.5 Les inaptitudes à la germination En règle générale, les graines mûrissent, deviennent quiescentes puis elles germent dés que l'eau, l'oxygène et la température seront disponibles (Srivastava, 2002). Néanmoins, il arrive chez plusieurs espèces qu'après quiescence, les graines ne germent pas et entrent en dormance, bien que les conditions environnementales leur soient optimales (Heller et al., 2004). L’inaptitude à la germination est une caractéristique spécifique des graines qui peut se définir comme le blocage de la germination d’une graine intacte et viable malgré des conditions environnementales favorables (Finch-Savage and Leubner-Metzger, 2006). Ceci représente une adaptation empêchant la germination spontanée qui pourrait survenir trop précocement (Gimeno-Gilles, 2009). Lang et al. (1987) répertorient cinquante quatre types d’inaptitude à la germination basés sur la variation des facteurs qui déterminent ces inaptitudes. Nous distinguerons deux groupes (ou causes) classiquement admis, à savoir l'inhibition tégumentaire et la dormance embryonnaire. Dans le premier cas, les embryons isolés (séparés des téguments) germent très bien dans des conditions de germination où les semences ne germent pas ; il s'agit alors d'une action inhibitrice des enveloppes séminales, qui empêchent le passage de l'eau ou de l'oxygène. Une simple altération (physique ou chimique) des téguments peur lever cette inaptitude (Mazliak, 1982). Dans le second cas, même isolés, les embryons ne germent pas ; il s'agit alors d'une incapacité des embryons à germer, qualifiée de dormance embryonnaire (Valée et al., 1999). Dans ce cas, la dormance peut être levée par le froid ou, au contraire des températures élevées ou par l’acide gibbérellique, par exemple (Mazliak, 1982). I.2.6 Régulation de la dormance Les dormances physiques et physiologiques sont progressivement acquises au cours de la maturation des graines et sont régulées par des signaux endogènes, notamment par les régulateurs de croissance que sont l’acide gibbérellique (GA) et l’acide abscissique (ABA) (fig. 06). Ces deux hormones ont des actions antagonistes puisque la germination est inhibée par l’ABA et stimulée par les GAs (Kermode, 2005 ; Kucera et al., 2005). L’état dormant résulte de l’augmentation de la biosynthèse de l’ABA et/ou de sa sensibilité et de la dégradation des GAs. Ainsi, on distingue deux aspects de la dormance physiologique : primaire ou secondaire. La dormance primaire correspond à l’état des graines fraîchement récoltée et est initié par l’ABA endogène (la substance clé de la dormance) produit par l’embryon au cours de la maturation (Hilhorst, 1995 ; Kucera et al., 2005). Cet état disparaît progressivement lors du stockage dans des conditions sèches ou alors grâce à des traitements imposées à la graine imbibée : stratification par le froid ou le chaud, lumière (pour les espèces pour lesquelles la lumière représente un facteur stimulant), les gibbérellines et autres hormones, les butenolides (Krock et al., 2002), et l’oxyde nitrique (Bailly et al., 2004; Bethke et al., 2006). La dormance secondaire est observée chez les graines ayant une dormance physiologique non profonde. Elle

36. État de l’art 12 intervient lorsque les conditions nécessaires à la perte de la dormance primaire ou l’induction de la germination ne sont pas remplies. Cette dormance est levée lorsque les conditions sont remplies mais peut être induite à nouveau (Finch-Savage and Leubner-Metzger, 2006). Figure 05 : Modèle de régulation de la dormance et de la germination par l’acide abscissique (ABA) et l’acide gibbérellique (GA) en réponse à l’environnement (D’après Finch-Savage and Leubner-Metzger, 2006). Selon ce modèle, les facteurs environnementaux (la température) affectent la balance ABA/GA et la sensibilité à ces hormones. La synthèse de l’ABA et sa signalisation (catabolisme du GA) contrôle l’orientation vers le maintien de la dormance, alors que la synthèse de GA et sa signalisation (catabolisme de l’ABA) contrôle l’orientation vers la germination. I.2.7 Hétérogénéité de la germination La germination peut être hétérogène vu que les semences ne germent pas toutes de la même manière ni en même temps. Cette hétérogénéité peut s’observer entre deux lots de semences différents ou dans un même lot (Mazliak, 1982). I.2.7.1 Entre deux lots de semences : Deux lots de semences d’une même espèce ne germent pas de la même manière s’ils présentent des différences dans : • L’origine géographique : sol, photopériode… • Les conditions climatiques : notamment celles prévalant au moment de la récolte. • La date de la récolte : très souvent, les graines fraîchement récoltées éprouvent des difficultés à germer (ex. blé, orge..). Ainsi, leur aptitude germinative s’améliore au cours de leur conservation (généralement à des températures élevées). • Les conditions de post-maturation (ou de conservation) : les conditions favorables sont représentées par des températures élevées et une atmosphère sèche.

37. État de l’art 13 I.2.7.2 Dans un même lot de semences : Dans un même lot de semences, la germination ne se déroule pas de manière homogène. Les causes de cette hétérogénéité sont nombreuses et variées : • Patrimoine héréditaire (génétique): il n’est pas le même pour toutes les graines vu qu’elles proviennent de pieds différents. • Position des graines sur la plante-mère et dans le fruit : généralement, ce sont les graines provenant des fruits du sommet de la plante qui germent le mieux (cas de la plupart des arbres fruitiers). Quand le fruit d’Arachis hypogea (arachide, cacahuète) renferme deux graines, la graine basale est toujours plus dormante que la graine apicale (Toole et al., 1964). • Taille des semences : les semences de la majorité des espèces présentent des taux de germination différents selon leur taille c'est à dire la densité, le poids, le volume ou même la forme (cas du maïs). En général, les grosses graines germent mieux. • Stade de maturation : les graines présentent des stades de maturation différents. Ainsi, au niveau d’un même lot, on trouve des graines immatures. • Durée de conservation : le taux de germination des graines diminue avec la durée de conservation. En effet, les graines perdent peu à peu leur aptitude germinative au cours du temps (Mazliak, 1982). I.3. Les espèces réactives d'oxygène (ERO ou ROS) et la germination Introduction L’oxygène a joué un rôle extraordinaire dans l’évolution des formes vivantes. A l'exception des organismes anaérobies, l’oxygène est indispensable à la survie du reste des êtres vivants. Cet oxygène permet aux mitochondries, les centrales énergétiques des cellules, d’arracher des électrons à la matière organique pour fabriquer de l’énergie. Son absence, l’anoxie, est mortelle à court terme. Cependant, ce même oxygène peut devenir un poison, parce qu’il est à l’origine de molécules extrêmement agressives, toxiques pour l’organisme qu’on appelle espèces réactives de l’oxygène, ERO (en anglais ROS, Reactive Oxygen Species) et radicaux libres. Mais, ces molécules jouent, en fait, un double rôle dans la physiologie des organismes se comportant, d’une part, comme des acteurs des voies de signalisation cellulaire et, d’autre part, comme des produits toxiques s’accumulant sous conditions de stress. I.3.1 Définition Les ERO regroupent l'ensemble des composés issus de la réduction de l'oxygène moléculaire, ainsi que les radicaux libres. Le terme de radical libre renvoie à n’importe quelle espèce capable d’une existence indépendante (d’où le terme de libre) contenant un ou plusieurs électrons non appariés (Halliwell, 2006). Un électron non apparié est un électron qui occupe seul, une orbitale atomique ou moléculaire. Un radical libre est le plus souvent instable, donc réactif (afin d’apparier son électron célibataire pour arriver à un équilibre) et sa durée de vie est très courte (de l’ordre d’une micro à nanoseconde) (Bouguerne, 2012). Les radicaux libres ne sont pas forcément associés à des espèces dérivant de l’oxygène, la notion de réactivité n’est pas forcément relative aux radicaux (Bertrand, 2008). Les ERO désignent à la fois des espèces radicalaires de l’oxygène telles que le superoxyde (O2 °- ) ou le

38. État de l’art 14 radical hydroxyle (HO° ) et des espèces non radicalaires telles que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’oxygène singulet (1 O2) (Garrel et al. 2007). Ainsi, tous les radicaux oxygénés sont des ERO, mais tous les ERO ne sont pas des radicaux (Bertrand, 2008). L’anion superoxyde et le radical hydroxyle sont très instables par comparaison au H2O2 qui diffuse librement et possède une durée de vie plus longue. La réactivité d’un radical dépend de sa nature (Nzengue, 2008) (tab. 01). Figures 06: Espèces réactives de l’oxygène (ERO) et de l’azote. Source: http://www.acadpharm.org/dos_public/J.Cillard_23_03_11.pdf Tableau 01: Propriétés physico-chimiques des espèces réactives de l’oxygène (Ramel, 2009).

39. État de l’art 15 I.3.2 Formation des espèces réactives d’oxygéne (ERO) Chez les organismes aérobies les ERO sont continuellement produites par différentes voies métaboliques. Chez la cellule animale, la mitochondrie est le site majeur de la production des ERO, contrairement aux cellules végétales pour lesquelles la production des ERO est majoritairement liée aux activités photosynthétique et photorespiratoire chez certaines espèces. Le flux d’électrons à travers la chaine photosynthétique excède de plus de dix fois de celui de la mitochondrie et la production de superoxyde par les mitochondries est vraisemblablement nettement plus faible que celle du chloroplaste (Foyer et Noctor, 2003). La réponse des plantes aux ERO dépend à la fois de la nature du ERO, de sa concentration, de son site de production, ainsi que de son interaction avec le contexte cellulaire (tab. 02). I.3.2.1 Fonctionnement cellulaire intrinsèque et production des ERO Le fonctionnement des différents organites de la cellule végétale produit des formes actives d’oxygène même en conditions non stressantes. Ces sites de production sont : le chloroplaste, la mitochondrie, le peroxysome et le réticulum endoplasmique, dans une moindre mesure (tab. 02). Tableau 02 : Sources d’espèces réactives de l’oxygène lors du fonctionnement cellulaire intrinsèque chez les plantes (Ramel, 2009).

40. État de l’art 16 I.3.2.1.1 Les chloroplastes Le chloroplaste est le siège de la photosynthèse, processus qui permet aux plantes de synthétiser des glucides en exploitant l’énergie lumineuse et le CO2 atmosphérique. Toutefois, ce processus indispensable à une vie photo-autotrophe est également producteur d’espèces réactives de l’oxygène. Le chloroplaste est souvent considéré comme étant la principale source d’ERO chez les organismes photosynthétiques (Foyer and Noctor, 2003; Edreva, 2005; Asada, 2006). Le processus photosynthétique est à l’origine de la formation directe d’1 O2 et d'O2 .- et indirecte d'H2O2 (par dismutation de l'O2 .- ) et d'OH. . La première source d’ERO se situe au niveau du photosystème II (PSII). Au niveau du centre réactionnel, l’absorption d’un photon par la chlorophylle a permet d’augmenter son énergie et libérer ainsi rapidement un électron, qui sera ensuite transféré vers une chaîne de transporteurs d’électrons de la membrane des thylakoïdes. La chlorophylle se retrouve à l’état triplet excité (Chl*) et peut ainsi réagir avec l’oxygène moléculaire pour former de l’oxygène singulet (1 O2) fortement oxydant (Macpherson et al., 1993; Telfer et al., 1994). En plus de l’oxygène singulet, l’anion superoxyde (O2 .-) est produit dans les chloroplastes au niveau du photosystème I (PSI) (Asada, 2006) et du photosystème II (PSII) (Zhang et al., 2003). Normalement, le flux d’électrons provenant du centre réactionnel PSI est dirigé vers l’accepteur NADP+ , qui, une fois réduit, participe à la réduction du CO2 au niveau du cycle de Calvin. Lorsque ce flux d’électrons est trop important (par exemple, une forte lumière), il est redirigé vers la Ferrédoxine (Fdx) qui utilise l'oxygène moléculaire comme accepteur d'électrons, ce qui conduit à la formation importante d'anion superoxyde au niveau du site de réduction du PSI (réaction de Mehler) (Laisk and Edwards, 1998; Asada, 1999). Une production de superoxyde est également possible au niveau du PSII, avec la réduction de l’oxygène moléculaire par les plastoquinones QA (Cleland and Grace, 1999; Navari-Izzo et al., 1999), et QB (Zhang et al.,2003). Bien que cette source de O2 .- au niveau du PSII ne cause pas de dommage direct aux protéines D1 et D2 (les deux sous unités majeures du centre réactionnel du PSII) ni aux pigments (Davies, 1987; Liu et al., 2004), il est possible que cela influence d’autres sous-unités du PSII. Le PSI est généralement considéré comme la source majeure de la production d’O2 .-. Une fois produit, ce superoxyde se transforme, spontanément (réaction non enzymatique) ou par l’action de superoxyde-dismutases, en H2O2 dans le stroma (Edreva, 2005). Ce H2O2 pourra à son tour être transformé en OH. en présence de Fe2+ par la réaction de Fenton, ou bien entrer dans le cycle de l’ascorbate-glutathion et être transformé en H2O et O2 (Asada, 1999; Dat et al., 2000).

41. État de l’art 17 Figure 07: Représentation du transport d’électrons photosynthétique, source d’espèces réactives de l’oxygène (d’après KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Source : http://www.genome.jp/kegg/). I.3.2.1.2 La mitochondrie Chez les organismes aérobies, les mitochondries jouent un rôle primordial dans la bioénergétique des cellules, grâce au processus de respiration situé au niveau de leur membrane interne. Ce processus, rassemblant des complexes protéiques qui assurent un transfert de protons et/ou d'électrons, est appelé chaîne respiratoire. Les mitochondries représentent néanmoins une source significative d’ERO dans les cellules, même lors du fonctionnement normal de l’organisme. Cette production est variable en fonction de l’organe considéré et des conditions du milieu. Becker (2004) a montré que dans des conditions physiologiques normales, environ 5 % de l’O2 absorbé était transformé en superoxyde, alors que le restant était consommé par la respiration et réduit en eau (Ramel, 2009). De la même façon que pour la chaîne de transport des électrons (CTE) des chloroplastes, c’est une saturation de la CTE mitochondriale qui semble être la cause des pertes d’électrons vers l’O2 (fig. 08). Cette fuite d’électrons se fait au niveau de la NADH déshydrogénase appartenant au complexe I (Turrens and Boveris, 1980), ainsi qu’au niveau du cytochrome bc1 du complexe III (Rich and Bonner, 1978). Cette production d’ERO est indissociable du processus respiratoire et fortement modulée par les conditions environnementales (Moller, 2001). Le superoxyde formé sera ensuite rapidement transformé en H2O2 par dismutation spontanée ou par action de la SOD mitochondriale (Boveris and Chance, 1973; Loschen et al., 1974). La contribution des mitochondries dans la production d’ERO dans les tissus photosynthétiques des plantes semble

42. État de l’art 18 être plus faible que celle des mitochondries des cellules animales, où elle est considérée comme étant la source principale d’ERO (Purvis, 1997). La production d’ERO à proximité des CTE peut générer des dégâts membranaires, induisant une diminution accrue de l’efficience de la CTE et une perte plus importante d’électrons. La résultante est une augmentation de la génération d’ERO diminuant d’autant plus l’efficience de la CTE. Ainsi, lors de stress importants, la génération initiale d’ERO peut conduire à un cycle délétère de production de ces espèces toxiques pour l’organisme. Ce cycle de production d’ERO mitochondriales est notamment considéré comme l’une des causes principales du vieillissement cellulaire (Loeb et al., 2005). Bien qu’il existe des photosensibilisateurs potentiels (précurseurs hémiques) au niveau des mitochondries, la production d’oxygène singulet n’y a pas été mise en évidence (Noctor et al., 2007). Les mitochondries constituent la source principale d’ERO dans les cellules non- chlorophylliennes, alors qu’elles ne représentent qu’une faible part dans les cellules chlorophylliennes exposées à la lumière (Foyer and Noctor, 2003). Les mitochondries des végétaux diffèrent de leurs homologues animales par des fonctions supplémentaires comme la participation au cycle de la photorespiration (Noctor et al., 2007). Figure 08 : Représentation schématique de la chaîne de transfert des électrons de la membrane mitochondriale interne (d’après Foyer and Noctor, 2000) Complex I : NADH déshydrogenase ; complex II : succinate déshydrogenase ; complex III : cytochrome bc1 ; complex IV cytochrome c oxydase ; complex V : ATPase ; Q : poolubiquinone ; AOX : oxydase alternative c : cytochrome c ; Ext1 and Ext2 : NAD(P)H déshydrogenases externes. I.3.2.1.3 Les peroxysomes Les peroxysomes possèdent une structure simple, une taille réduite et une très grande quantité de catalases. En raison de ces caractéristiques, les peroxysomes sont impliqués, selon leur localisation tissulaire, dans un grand nombre de fonctions cellulaires essentielles (del Rio

43. État de l’art 19 et al., 2002). Les peroxysomes situés dans les tissus de stockage et les graines (appelés glyoxysomes) sont spécialisés dans la dégradation des lipides de réserves et dans leur transformation en acides organiques pour la respiration et la néoglucogenèse (Tolbert, 1981 ; Beevers, 1982; Huang et al., 1983). Ainsi, les peroxysomes ont longtemps été considérés comme des organites spécialisés dans la détoxication du peroxyde d’hydrogène. Les peroxysomes sont en fait le siège d’une forte activité métabolique très centrée sur le métabolisme oxydatif (Corpas et al., 2001; Nyathi and Baker, 2006). Ils possèdent de nombreux systèmes antioxydants et prooxydants. Les deux principales sources d’ERO peroxysomales sont la photorespiration et la β-oxydation des acides gras (Corpas et al., 2001; Nyathi and Baker, 2006). I.3.2.1.3.1 La photorespiration La photorespiration est un processus vital pour les plantes. Bien qu’il apparaisse comme un mécanisme coûteux en énergie et peu rentable, ce mécanisme physiologique remplit le rôle de « soupape de sécurité » du photosystème, en évitant la saturation de la CTE chloroplastique (Wingler et al., 2000). La photorespiration est un processus complexe illustrant bien les échanges de métabolites entre les différents composants cellulaires. En effet, il implique des réactions métaboliques dans le chloroplaste, la mitochondrie et le peroxysome (Foyer and Noctor, 2000) (fig. 9). L’oxydation du glycolate, effectuée dans le peroxysome, conduit à la formation de glyoxylate et d’H2O2 (Foyer and Noctor, 2000; Wingler et al., 2000; Nyathi and Baker, 2006). Figure 09: Caractéristiques principales du métabolisme de la photorespiration GO: glycolate oxydase ; GDC: Glycine décarboxylase ; Fd-GOGAT: Ferredoxin-dependent Glutamate synthase ; SHMT: Sérine hydroxyméthyltransférase ; CAT: Catalase. Source : http://www.ige.tohoku.ac.jp/outou/image/page_thumb22.html

Compréhension des mécanismes régissant l’endurcissement de graines de Vigna unguiculata

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