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Polycopié TP : Physiologie des Stress_Boucelha_2021.pdf

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Préambule
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Ce polycopié présente une compilation de travaux pratiques en relation avec la physiologie des stress. Il est destiné aux étudiants de licence et master en Sciences du Végétal.

Ces manipulations permettront aux étudiants de mettre en adéquation les connaissances acquises en cours et la pratique. C’est une excellente illustration pour étudier et comprendre les mécanismes et les effets du stress hydrique sur les plantes au niveau morphologique, physiologique et biochimique avec des approches quantitatives et qualitatives. Ces manipulations peuvent être réalisées avec des techniques simples, des appareils courants et des réactifs facilement disponibles.

Les TP reposent sur une comparaison entre des plantes témoins (non stressées) et des plantes stressées par un arrêt d’arrosage. Après chaque TP, l’étudiant doit remettre un compte-rendu reprenant le protocole expérimental, les méthodes et leurs principes ainsi que les résultats et leurs modes de calcul. L’étudiant devra interpréter ces résultats sur la base de ses connaissances théoriques. Chaque protocole est précédé de rappels relatifs à chaque paramètre étudié.
Ce polycopié est structuré en trois parties distinctes. La première partie est consacrée à de brefs rappels sur le stress hydrique et les effets et réponses y afférentes. La deuxième partie regroupe les protocoles des différents travaux pratiques à réaliser. Les principes des différentes techniques utilisées sont exposés dans la troisième partie. En annexe, la préparation des réactifs et solutions utilisés est expliquée.

Nous espérons que ce modeste travail aidera les enseignants dans la mise en place de travaux pratiques et les étudiants à mieux appréhender les mécanismes physiologiques du stress hydrique.

Pour toute remarque ou suggestion, les utilisateurs peuvent contacter les auteurs : liliaboucelha@yahoo.fr ou reda_djebbar@yahoo.fr

Boucelha Lilya est Maître de conférences B et Djebbar Réda est Professeur. Tous deux sont rattachés à la Faculté des Sciences Biologiques, Université des Sciences et Technologie Houari Boumediene (USTHB), Alger

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Ces manipulations permettront aux étudiants de mettre en adéquation les connaissances acquises en cours et la pratique. C’est une excellente illustration pour étudier et comprendre les mécanismes et les effets du stress hydrique sur les plantes au niveau morphologique, physiologique et biochimique avec des approches quantitatives et qualitatives. Ces manipulations peuvent être réalisées avec des techniques simples, des appareils courants et des réactifs facilement disponibles.

Les TP reposent sur une comparaison entre des plantes témoins (non stressées) et des plantes stressées par un arrêt d’arrosage. Après chaque TP, l’étudiant doit remettre un compte-rendu reprenant le protocole expérimental, les méthodes et leurs principes ainsi que les résultats et leurs modes de calcul. L’étudiant devra interpréter ces résultats sur la base de ses connaissances théoriques. Chaque protocole est précédé de rappels relatifs à chaque paramètre étudié.
Ce polycopié est structuré en trois parties distinctes. La première partie est consacrée à de brefs rappels sur le stress hydrique et les effets et réponses y afférentes. La deuxième partie regroupe les protocoles des différents travaux pratiques à réaliser. Les principes des différentes techniques utilisées sont exposés dans la troisième partie. En annexe, la préparation des réactifs et solutions utilisés est expliquée.

Nous espérons que ce modeste travail aidera les enseignants dans la mise en place de travaux pratiques et les étudiants à mieux appréhender les mécanismes physiologiques du stress hydrique.

Pour toute remarque ou suggestion, les utilisateurs peuvent contacter les auteurs : liliaboucelha@yahoo.fr ou reda_djebbar@yahoo.fr

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  1. 1. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Faculté des Sciences Biologiques Destinés aux étudiants de Licence et Master en Sciences du Végétal Auteurs Dr Lilya BOUCELHA et Pr Réda DJEBBAR Validé par le Conseil Scientifique de la Faculté Mai 2020 T T Tr r ra a av v va a au u ux x x p p pr r ra a at t ti i iq q qu u ue e es s s E E En n n r r re e el l la a at t ti i io o on n n a a av v ve e ec c c l l la a a P P Ph h hy y ys s si i io o ol l lo o og g gi i ie e e d d de e es s s S S St t tr r re e es s ss s s
  2. 2. Préambule Ce polycopié présente une compilation de travaux pratiques en relation avec la physiologie des stress. Il est destiné aux étudiants de licence et master en Sciences du Végétal. Ces manipulations permettront aux étudiants de mettre en adéquation les connaissances acquises en cours et la pratique. C’est une excellente illustration pour étudier et comprendre les mécanismes et les effets du stress hydrique sur les plantes au niveau morphologique, physiologique et biochimique avec des approches quantitatives et qualitatives. Ces manipulations peuvent être réalisées avec des techniques simples, des appareils courants et des réactifs facilement disponibles. Les TP reposent sur une comparaison entre des plantes témoins (non stressées) et des plantes stressées par un arrêt d’arrosage. Après chaque TP, l’étudiant doit remettre un compte-rendu reprenant le protocole expérimental, les méthodes et leurs principes ainsi que les résultats et leurs modes de calcul. L’étudiant devra interpréter ces résultats sur la base de ses connaissances théoriques. Chaque protocole est précédé de rappels relatifs à chaque paramètre étudié. Ce polycopié est structuré en trois parties distinctes. La première partie est consacrée à de brefs rappels sur le stress hydrique et les effets et réponses y afférentes. La deuxième partie regroupe les protocoles des différents travaux pratiques à réaliser. Les principes des différentes techniques utilisées sont exposés dans la troisième partie. En annexe, la préparation des réactifs et solutions utilisés est expliquée. Nous espérons que ce modeste travail aidera les enseignants dans la mise en place de travaux pratiques et les étudiants à mieux appréhender les mécanismes physiologiques du stress hydrique. Pour toute remarque ou suggestion, les utilisateurs peuvent contacter les auteurs : liliaboucelha@yahoo.fr ou reda_djebbar@yahoo.fr Boucelha Lilya est Maître de conférences B et Djebbar Réda est Professeur. Tous deux sont rattachés à la Faculté des Sciences Biologiques, Université des Sciences et Technologie Houari Boumediene (USTHB), Alger.
  3. 3. Tables des matières I. Stress hydrique : principaux effets et réponses …………………………… 1 I.1 Introduction ………………………………………………………………………………...................... 1 I.2 Stress : Définitions et concepts…………………………………………………………...................... 2 I.3 Effets du stress hydrique …………………………………………………………………………......... 3 II. Manipulations ……………………………………………………………….. 4 II.1 Préparation du matériel végétal ……………………………………………………………………… 4 II.2 Application du stress hydrique ……………………………………………………………………….. 4 CROISSANCE 5 TP 1- Mesure de la croissance linéaire (en longueur) de la partie aérienne ……………................ 5 TP 2- Mesure de la croissance pondérale de la partie aérienne …………………………............... 5 TP 3- Mesure de la surface foliaire ……………………………………………………………….. 6 TP 4- Etude de l’architecture des racines sous conditions de stress ……………………................ 6 RELATIONS PLANTE-EAU 7 TP 1- Mesure de la teneur relative en eau : TRE (ou RWC, relative water content) …………….. 10 TP 2- Mesure de la Transpiration foliaire ………………………………………………................ 10 TP 3- Estimation du potentiel hydrique ………………………………………………………................ 11 TP 4- Mesure de Conductance stomatique à la vapeur d’eau …………………………………….. 13 PIGMENTS PHOTOSYNTHETIQUES 15 TP- Extraction et dosages des pigments photosynthétiques ……………………………................ 15 SUCRES SOLUBLES 17 TP 1- Etude quantitative des sucres éthanolosolubles : Mesure de la teneur …………………….. 17 TP 2- Etude qualitative des sucres solubles par CCM ……………………………………………. 17 METABOLISME AZOTE TP 1- Mesure de la teneur en protéines hydrosolubles …………………………………................ 19 TP 2- Etude qualitative des protéines par électrophorèse SDS-PAGE …………………................ 20 TP 3- Mesure de la teneur en proline libre foliaire ……………………………………………….. 21 STRESS OXYDATIF 23 TP 1- Détection du peroxyde d’hydrogène (H2O2) par méthode cytochimique ………………….. 25 TP 2- Détection de l’anion superoxyde (O2 - ) par méthode cytochimique ………………............... 25 TP 3- Altération des membranes : Mesure de l’intégrité membranaire …………………............... 26 TP 4- Peroxydation lipidique : mesure de la teneur en malondialdéhyde (MDA) ……………….. 27 TP 5- Mesure de l’activité anti-oxydante de la superoxyde dismutase (SOD) …………................ 29 TP 6- Mesure de l’activité anti-oxydante enzymatique de la catalase (Cat) …………………… 30 TP 7- Mesure de l’activité anti-oxydante de l’ascorbate peroxydase (APX) …………………….. 31 TP 8- Mesure de l’activité anti-oxydante de la gaïacol Peroxydase (GPOX) ……………….…… 32 TP 9- Mesure de la capacité anti-oxydante non enzymatique totale (CANET) ………………….. 33 III. Techniques utilisées : principes 34 III.1 Spectrophotométrie d’absorption …………………………………………………………………… 34 III.2 Chromatographie sur couche mince ………………………………………………………………... 36 III.3 Electrophorèse ………………………………………………………………………………………… 38 III.4. Conductimétrie ………………………………………………………………………………………... 40 REFERENCES BIOBLIOGRAPHIQUES 42 ANNEXES 46
  4. 4. Stress hydrique : définition, effets et réponses TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 1 I. Stress hydrique : principaux effets et réponses I.1 Introduction Au cours de leur existence, les végétaux sont souvent soumis à des conditions défavorables dues à l’absence, l’insuffisance ou la prédominance d’un ou de plusieurs facteurs exogènes tels que l’eau, la lumière, les substances chimiques … (facteurs abiotiques) ou les attaques par les parasites (facteurs biotiques). Ces différents stress réduisent considérablement la productivité végétale et menacent la sécurité alimentaire (Djebbar, 2012 ; Boucelha, 2015). Le déficit hydrique est l'un des stress environnementaux les plus importants affectant la productivité agricole dans le monde (Kramer, 1980). Il occupe et continuera d'occuper une très grande place dans les chroniques agro-économiques. C'est un vrai problème dans beaucoup d'environnements arides et semi-arides, où les précipitations changent d'année en année et où les plantes sont soumises à des périodes plus ou moins longues de déficit hydrique (Boucelha et Djebbar, 2015). D'un point de vue physique, le stress hydrique résulte d'un abaissement du potentiel hydrique dans l'air et/ou dans le sol en dessous d'une certaine valeur, dépendant du génotype, du phénotype et des caractéristiques du milieu (type de sol, température, vent, etc.). Dans le cas d’une forte salinité du sol, et aussi dans d’autres conditions telles qu’une inondation ou le gel, l’eau existe dans la solution du sol mais les plantes ne sont pas capables de l'absorber, on parle de sécheresse physiologique (Djebbar, 2012). Le stress hydrique est multidimensionnel dans sa nature et affecte les plantes à différents niveaux de leur organisation. Un déficit en eau entraîne une série de perturbations anatomiques, morphologiques, biochimiques et physiologique. Le degré de sensibilité au déficit hydrique dépend du stade de développement de la plante mais aussi de la sévérité du stress. Une plante soumise à un stress passe par plusieurs étapes selon sa réaction en relation avec l’intensification progressive ou la durée du stress (Larcher, 2003) (fig.1). Figure 1 : Les phases successives d’un stress (d’après Selye, 1936, 1973 et Stockers, 1947, in Larcher, 1995, modifié par Djebbar, 2012).
  5. 5. Stress hydrique : définition, effets et réponses TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 2 Le stress hydrique provoque des effets importants sur les réactions métaboliques de la plante. Il a été prouvé que l'accumulation de la proline et de certains glucides chez les plantes stressées constituent des réponses métaboliques d'adaptation à la sécheresse (Djebbar, 2012). Lors d’une déshydratation, le maintien du potentiel hydrique s’exprime par un maintien de la turgescence cellulaire, rendu possible grâce à l’ajustement osmotique qui est un paramètre essentiel de la résistance au stress. Les solutés accumulés ont un poids moléculaire faible, un pH neutre, sont non toxiques, chimiquement divers, très solubles dans l’eau et n’interfèrent pas avec le métabolisme cellulaire (Ramanjulu et Bartels, 2002). Les modifications qui se manifestent lors d’un stress hydrique résultent d’une signalisation au niveau des racines traduite par l’augmentation de la synthèse d’acide abscissique (ABA) qui agit en tant que signal chimique racine-feuille et induit une cascade de signalisation incluant les espèces oxygène réactives (ROS) l’oxyde d’azote, le calcium, etc.… avec pour conséquence la fermeture des stomates ce qui réduit les pertes en eau par transpiration (Lee and Luan, 2012). Les plantes développent différentes stratégies en réponse positive à la sécheresse. Ces stratégies sont classées en trois catégories : évasion, évitement et tolérance à la sécheresse (Turner et al., 2001). La tolérance des plantes au stress fait intervenir des mécanismes physiologiques, biochimiques et moléculaires impliquant l’expression de gènes et de protéines spécifiques. Le phénomène de la déshydratation des plantes tolérantes est caractérisé par des modifications fondamentales des relations hydriques, des processus physiologiques et biochimiques, de la structure de la membrane et de l’ultra structure des organites subcellulaires (Gravot, 2009). En effet, l’adaptation à la sécheresse est sans aucun doute l’un des processus biologiques les plus complexes. I.2 Stress : Définitions et concepts La plupart des biologistes définissent le stress comme une déviation significative des conditions optimales de la vie entraînant des changements et des réponses au niveau structural et fonctionnel de l’organisme (In Djebbar, 2012). Ainsi, le stress biologique se définit comme tout facteur de l'environnement induisant un dysfonctionnement de la plante ou comme force ou influence adverse qui tend à inhiber le fonctionnement normal des systèmes (Jones and Jones, 1989). Un stress hydrique peut se produire aussi bien sous l’effet d’un excès que d’un manque d’eau. Le stress provoqué par un déficit hydrique est bien plus fréquent. Un déficit hydrique s’installe lorsque l’eau disponible pour la plante ne lui permet pas de répondre à la demande climatique (In Djebbar, 2012). Selon Kramer (1980), le stress hydrique est un concept physiologique, il s’agit d’une perturbation du fonctionnement physiologique normal de l’organisme. Le stress hydrique dépend donc à la fois de l’espèce et du processus physiologique considéré, ce qui le rend difficile à définir. Pour cette raison, Levitt (1982) préfère parler de contrainte hydrique lorsque le fonctionnement de la plante est affecté par le déficit hydrique mais que les tissus de la plante ne subissent pas une baisse de leur teneur en eau. Enfin, on parle de stress hydrique lorsque les tissus de la plante subissent une baisse de leur teneur en eau qui affecte tout le métabolisme de la plante (In Djebbar, 2012).
  6. 6. Stress hydrique : définition, effets et réponses TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 3 I.3 Effets du stress hydrique Le stress hydrique est multidimensionnel dans sa nature et affecte les plantes à différents niveaux de leur organisation. Un déficit en eau entraîne une série de perturbations anatomiques, morphologiques, biochimiques et physiologique. Le degré de sensibilité au déficit hydrique dépend du stade de développement de la plante mais aussi de la sévérité et de la durée du stress (fig. 2). Figure 2 : Réponses morphologiques, physiologiques et biochimiques de la plante soumise à un stress hydrique.
  7. 7. Manipulations : Préparation du matériel végétal TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 4 II. Manipulations Toutes les analyses et les mesures seront réalisées sur des plantes (graminées ou légumineuse) stressées (S) et non stressées ou témoins (T). Chaque mesure, pour chaque paramètre, sera réalisée au moins 3 fois. La préparation du matériel végétal se fait comme suit : II.1 Préparation du matériel végétal II.1.1 Germination Les graines de l’espèce prise comme modèle biologique (blé, lentilles, haricot, …) sont rincées avec de l’eau javellisée (NaClO) pour les désinfecter. Après un rinçage abondant à l'eau, elles sont mises à germer sur du papier absorbant. L'arrosage est réalisé régulièrement avec de l'eau distillée. La germination se déroule dans l’étuve à 26° C (température optimale). II.1.2 Mise en pots Après germination de trois à cinq jours, les plantules sont repiquées dans des pots en plastique de 14 cm de diamètre et de 10 cm de profondeur dont le fond est troué, contenant du terreau (1/3), de la terre argileuse (1/3) et du sable (1/3) afin de faciliter le drainage de l’eau. II.2 Application du stress hydrique Le stress de déficit hydrique est provoqué par un arrêt d’arrosage durant 10-15 jours après deux semaines de croissance (plantules au stade 2ème feuille). Ainsi, nous obtenons deux lots de plantes dont un lot est arrosé régulièrement et considéré comme contrôle (témoin) et un autre non arrosé considéré comme stressé (fig. 3). Figure 3 : Photos montrant des plantes de blé tendre Triticum aestivum témoins et stressées par un arrêt d’arrosage.
  8. 8. Manipulations : Croissance TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 5 CROISSANCE Le processus de croissance qui est un phénomène quantitativement mesurable correspond, selon Kofler (1963), à une augmentation irréversible du poids et de la dimension. La croissance cellulaire est le processus le plus sensible au stress hydrique (Hsiao, 1976). En effet, la réduction de croissance est l'une des premières manifestations du déficit hydrique (Kramer et Boyer, 1995 ; Saab et Sharp, 2004). La limitation de la croissance foliaire est un mécanisme adaptatif qui permet de réduire la transpiration. La croissance de la plante en conditions de sécheresse est affectée par l’altération de la photosynthèse, de la respiration, de la translocation, de l’absorption des ions, du métabolisme carboné et des hormones (Kramer et Boyer, 1995 ; Saab et Sharp, 2004 ; Djebbar, 2012). La plante répond à un déficit hydrique selon sa durée et son intensité par des modifications morphologiques, qui se traduisent par une diminution de la surface foliaire, un épaississement de la cuticule, et par le développement du système racinaire pour une utilisation plus efficiente des réserves hydriques du sol (Soar et Loveys, 2007). Par ailleurs, la plante développe de nombreux tissus vasculaires afin d’assurer l’exportation des photosynthétats. Un stress (hydrique, salin, minéral…) provoque, également, une modification de la croissance et l’architecture de la racine. Les racines sont le point d’entrée naturel des ions et de l’eau dans la plante. La sélection de plantes cultivées dotées d’une meilleure efficacité, pour l’utilisation des nutriments par leurs racines, est une priorité dans l’agriculture durable, utilisant moins d’intrants. Le stress hydrique constitue une cause majeure de perte de rendement, pour tous types de cultures, au sein de divers environnements. Les plantes ont des capacités plus ou moins étendues à tolérer des épisodes climatiques extrêmes. Certaines espèces végétales ou variétés au sein d’une espèce sont capables de continuer à croître et à se reproduire dans des conditions physiques qui s’écartent des moyennes habituelles ; elles font appel à la plasticité de leur génome. D’autres restreignent leur cycle de vie dans une gamme de paramètres moins étendue ; elles sont adaptées à un milieu particulier. TP 1- Mesure de la croissance linéaire (en longueur) de la partie aérienne Afin de suivre la croissance linéaire des parties aériennes, des mesures de la longueur sont effectuées. Les mesures d’allongement des plantules sont effectuées sur la deuxième feuille des plantes stressées et non stressées au stade un mois de croissance correspondant au 15éme jours après l’arrêt d’arrosage pour les stressées. Ces mesures sont faites soigneusement à l’aide d’un papier millimétré. Chaque valeur représente la moyenne de dix mesures. Elle est exprimée en cm. TP 2- Mesure de la croissance pondérale de la partie aérienne La croissance pondérale indique l’accumulation de matière végétale. Des plantules stressées et non stressées sont pesées à l’aide d’une balance de précision (poids de la matière végétale fraîche, PMVF), puis placées à l’étuve (48 h, 80° C). Ensuite, le poids de matière végétale sèche (PMVS) est mesuré. Chaque valeur représente la moyenne de dix mesures. Elle est exprimée en mg.
  9. 9. Manipulations : Croissance TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 6 TP 3- Mesure de la surface foliaire Pour la mesure de la surface, prendre une dizaine de feuilles. Les peser individuellement. Les numéroter. Les coller sur une feuille de papier à l’aide de scotch. En faire une photocopie. A l’aide de ciseaux, découper les contours des feuilles des plantes étudiées et les peser un par un. Pour connaître la surface de chaque feuille, peser un carré de papier de 5cm x 5cm (25 cm2) ) et faire une règle de trois (fig. 4). Figure 4 : Photos montrant la procédure de la mesure de la surface foliaire. Calcul de la surface foliaire spécifique (SFS ou SLA) La surface foliaire spécifique (SFS) est définie comme le rapport de la surface foliaire au poids sec de la feuille (exprimé en cm².g-1 ). La surface foliaire spécifique traduit l'épaisseur des feuilles et a une signification physiologique particulière. Ce paramètre est notamment corrélé positivement à la capacité photosynthétique de la plante. La sécheresse et le stress hydrique ont des effets variables sur la surface foliaire spécifique. Chez diverses espèces, la sécheresse diminue la surface foliaire spécifique. TP 4- Etude de l’architecture des racines sous conditions de stress Afin d’étudier l’architecture des racines en conditions normales et en conditions de stress de déficit hydrique, la germination sera menée dans en conditions hydroponiques ou plus idéalement sur gel d’agarose. Cela permettra d’observer directement les racines. L’architecture des racines est étudiée au moyen du logiciel EZ-Rhizo : (http://www.psrg.org.uk/plant-biometrics.html). EZ-Rhizo permet une acquisition précise et rapide des paramètres morphologiques des racines à partir d'une boite de Petri numérisée (scannée). Le format .bmp est obligatoire. Le programme mesure une dizaine de paramètres primaires comme le chemin parcouru par la racine principale, le vecteur associé, l’angle de ce vecteur avec la verticale, le nombre de racines latérales, leur longueur, mesures répétées pour chaque ordre racinaire. Il mesure aussi des paramètres dérivés comme la profondeur, la différenciation de zones de la racine (apicale, branchée, basale). Les données collectées sont organisées dans une base de données (mySQL) associée au logiciel et sont interrogeables par une fenêtre de requête pour l'export et la manipulation sous Excel. EZ-Rhizo n'est disponible qu'en anglais et fonctionne uniquement sous Windows. Remarque : EZ-Rhizo ne gère pas les racines superposées ou celles qui se croisent. Une étape d'édition manuelle est incluse dans le protocole d'analyse pour corriger les imperfections des images.
  10. 10. Manipulations : Croissance TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 7 ✓ Mode opératoire Préparation du gel d’agarose : 1 % d’agarose dans de l’eau. Chauffer et couler dans les boîtes de Petri. Boîtes contrôles (conditions normales) : Après solidification du gel, verser dessus de l’eau et laisser absorber. Boîtes essais (conditions de stress) : Après solidification du gel, verser dessus du PEG à 20 % et laisser absorber. Après absorption (quelques heures), mettre 4 à 5 grains de blé imbibés à germer et déposés d’une manière alignée. Bien sceller les boîtes avec de la cellophane. Placer les boîtes de Petri verticalement dans une étuve à 26-28° C. Après quelques jours, étudier l’architecture des racines au moyen du logiciel Rhizo. Comparer entre le contrôle et l’essai (stressé) (fig. 5). Figure 5 : Photos montrant les étapes de la mesure de l’architecture racinaire par EZ-Rhizo
  11. 11. Manipulations : Relation plante-eau TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 8 RELATIONS PLANTE-EAU Constituant 80 % du végétal, l’eau est d’une importance primordiale pour les plantes. Elle possède des fonctions mécaniques et biochimiques. Ainsi la présence de l’eau de manière intracellulaire permet non seulement de maintenir l’organisation en bicouche des membranes mais provoque aussi une pression de turgescence responsable de la rigidité et de l’élongation cellulaire. L’absorption et le transport de l’eau à travers divers tissus, des racines vers le xylème, peut suivre une voie apoplastique, une voie symplastique ou une voie transmembranaire (Steudle and Peterson 1998 ; Henzler et al., 1999). La pression d’eau dans la plante est régulée grâce au processus d’évapotranspiration. Au niveau des stomates, l’eau s’évapore dans l’atmosphère créant une force de succion permettant de faire circuler l’eau des racines aux feuilles. C’est le principal processus responsable de la circulation de l’eau dans la plante. A côté de ces fonctions mécaniques, l’eau est aussi le solvant d’un grand nombre de réactions biochimiques ainsi qu’un réactif indispensable comme c’est le cas pour la photosynthèse (Despinasse, 2015). Les mouvements hydriques dans le continuum sol-plante-atmosphère sont régis par les forces de liaison de l’eau dans chacun de ces compartiments. La sécheresse affecte non seulement les relations hydriques de la plante à travers la réduction de la teneur en eau et de la turgescence, mais affecte également l’ouverture stomatique, limite les échanges gazeux, réduit la transpiration et l’assimilation de carbone (photosynthèse). La transpiration est l’émission de vapeur d’eau excédentaire dans l’atmosphère. Elle constitue l’une des étapes essentielles de cycle naturel de l’eau. La turgescence cellulaire peut être estimée par la teneur relative en eau (TRE). Cette notion a été proposée par Clarke et McCaig (1982), Schonfeld et al. (1988) et Matin et al. (1989) ; elle consiste à déterminer en pourcentage la quantité d’eau présente dans les feuilles. Elle permet d’estimer le statut de l’eau de la plante, et en particulier le déficit hydrique. Sa mesure nécessite peu de moyens dans l’ensemble. La teneur relative en eau est fortement liée à l’environnement c’est à dire que la variation de la quantité de l’eau dans le milieu influe sur la quantité de l’eau dans les plantes. Une TRE élevée permet le maintien de la turgescence cellulaire chez ces plantes, ce qui permet l’ouverture des stomates ; l’assimilation du carbone et donc une bonne activité photosynthétique, ainsi que l’élongation cellulaire (Meyer et Grenn, 1981). Pour absorber de l’eau du milieu extérieur, la plante exerce une force qui est en fait, le potentiel hydrique. Ce potentiel représente la force de rétention de l’eau dans la cellule. Le potentiel hydrique d’une cellule (Ψplante) est la résultante de deux forces opposées : le potentiel osmotique Ψs (correspondant à pression osmotique π, de valeur négative) et le potentiel de pression Ψp (correspondant à la pression de turgescence P, de valeur positive). Ψplante = Ψs + Ψp Au niveau cellulaire : - La pression osmotique (π) : est produite par les solutés contenus dans la cellule (ions, sucres, acides aminés, …). Sa valeur est proportionnelle à la concentration de ces solutés (loi de Van’t Hoff). Elle contribue à absorber l’eau du milieu extérieur selon le principe de l’osmose. - La pression de turgescence (P) : elle est exercée par la paroi et surtout les membranes. Elle est de sens opposé à la pression osmotique et tend à faire sortir l’eau de la cellule.
  12. 12. Manipulations : Relation plante-eau TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 9 Dans des conditions hydriques normales, la valeur de pression osmotique est supérieure à celle de la pression de turgescence, ce qui donne un potentiel hydrique de signe négatif (Ψplante < 0). Un gradient de potentiel de plus en plus négatif s'établit tout au long de la plante, des racines jusqu'aux feuilles, siège des phénomènes transpiratoires. Au niveau du sol, l’eau est également retenue par des forces osmotiques et matricielles résultant en un potentiel hydrique (Ψsol). D’après la loi de la physique, l’eau se déplace toujours du potentiel le plus élevé vers le potentiel le plus bas (en valeurs relatives). En conditions hydriques favorables, Ψplante < Ψsol, l’eau se déplace, ainsi, du sol vers la racine (la différence de potentiel est en faveur de la plante). Si le sol s’assèche, la valeur Ψsol s’abaisse et la différence de potentiel ne permet pas à la plante d’absorber convenablement de l’eau à partir du sol (fig. 6). Figure 6 : Echanges d’eau entre le sol et la plante Lorsque le potentiel hydrique du sol s’abaisse, la réponse de la plante au niveau cellulaire se traduit, entre autres, par une accumulation de solutés dans le cytoplasme entraînant une diminution du potentiel hydrique intracellulaire et donc permettant à la plante d’absorber l’eau contenue dans le sol. Ce phénomène est appelé ajustement osmotique. Cet aspect sera détaillé à travers la mesure de la teneur en proline. La perte d’eau par la plante est fonction de la conductance stomatique et de la demande évaporative. Pour éviter la dessiccation, la plante doit réguler la perte d’eau afin qu’elle n’excède pas la quantité absorbée par les racines (Jackson et al., 2000). Une alimentation en eau insuffisante induit une baisse du potentiel hydrique foliaire. Au-dessous d’une valeur seuil de ce potentiel hydrique foliaire, les stomates se ferment par suite d’une augmentation de la résistance stomatique. Ainsi, la conductance stomatique est un indicateur du taux de transpiration foliaire et un paramètre de l’état hydrique de la plante. La fermeture des stomates entraîne une baisse de l’activité photosynthétique et de la transpiration (Lawlor, 2002 ; Lawlor et Cornic, 2002). Le contrôle de la régulation stomatique fait intervenir la turgescence cellulaire mais également des messagers racinaires, comme l’acide abscissique (ABA) (Davis et al., 1994 ; Sauter et al., 2001). La conductance stomatique est directement liée aux échanges gazeux, d’où sa forte corrélation avec la photosynthèse (r = 0.77). Sous des conditions de stress hydrique sévère, la réduction de CO2 fixé est due à la fermeture des stomates et à la réduction de l’activité de la Rubisco. Si le stress s’accentue, la photosynthèse peut être inhibée par des facteurs non stomatiques tel que l’altération des chloroplastes, le
  13. 13. Manipulations : Relation plante-eau TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 10 transfert des électrons ou la phosphorylation, avec arrêt de la croissance et mort par la déshydratation (Gimenez et al., 1992). La variation de la conductance stomatique est dictée par l’ouverture et la fermeture des stomates. La conductance stomatique (inverse de la résistance stomatique) se mesure soit en mmoles de CO2. m-2 . s-1 ou en mmoles de H20. m-2. s-1. TP 1- Mesure de la teneur relative en eau : TRE (ou RWC, relative water content) La TRE foliaire représente un bon paramètre pour apprécier le statut hydrique de la plante. Un disque foliaire de 12 mm prélevé sur la 2ème feuille au moyen d’un emporte-pièce (cas d’une légumineuse) ou un segment frais de 2 à 3 cm (cas de blé) est directement pesé (poids de la matière végétale fraîche, PMVF). Il est, ensuite, placé au réfrigérateur dans un tube à essai contenant de l’eau distillée pendant 24 heures, puis, après l’avoir essuyé avec du papier absorbant, pesé de manière à obtenir le poids à la turgescence (PT). Le fragment est finalement placé dans une étuve à 80° C pendant 48 heures, puis pesé pour obtenir le poids de matière végétale sèche (PMVS). La TRE est calculé selon la relation suivante : TRE % = (PMVF – PMVS) *100 / (PT – PMVS) TP 2- Mesure de la Transpiration foliaire La transpiration des plantes étudiées est mesurée par méthode gravimétrique. Recouvrir le sol du pot contenant la plante avec un film plastique afin d’éviter l’évaporation. Peser le pot au temps to (poids PO). Repeser après au moins 1 heure de temps (poids P). La différence de poids représente la quantité d’eau perdue par transpiration. Peser toutes les feuilles de chaque pot et ramener la quantité d’eau transpirée par gramme de MVF et par heure. Cette valeur représente l’intensité transpiratoire (I.T). Il est plus pertinent de représenter l’intensité transpiratoire par unité de surface (de feuille). Pour cela, la surface totale des feuilles (S) doit être mesurée (voir mesure de la surface foliaire). I.T (H2O. g-1. mn-1) = (P – PO) * 1 g / P (g) * 60 mn / t (mn) Ou I.T (H2O. cm-2. mn-1) = (P – PO) * 1 cm2 / S (cm2) * 60 mn / t (mn)
  14. 14. Manipulations : Relation plante-eau TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 11 TP 3- Estimation du potentiel hydrique A travers cette manipulation, le potentiel hydrique sera estimé au niveau du tissu du tubercule de pomme de terre pour une question de commodité. Il ne sera pas question d’une comparaison entre des plantules témoins et des plantes stressées comme c’est le cas pour l’ensemble des TP exposés. Les tubercules de pomme de terre ont été choisis parce qu'ils permettent des expériences simples et de courte durée afin de mesurer le potentiel hydrique. Quelques notions essentielles seront brièvement et d'une façon élémentaire résumées ici. Cette introduction sommaire rendra accessible cette manipulation même à ceux qui n'auraient pas encore acquis certaines notions telle que le phénomène d’osmose. • La pression osmotique La pression osmotique, désigné par le symbole , est fonction de la température, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation. PO = R . T . C . i PO : Pression osmotique (en Mpa) (1 atmosphère = 1,013 bars et 1 bar = 0,1 MPa) R : constante des gaz parfaits = 0.008.31 Kg.MPa/ mol .°K T : température absolue (donnée en °K = 273,15 + t). C : concentration molaire du corps dissous, exprimée en moles. i : coefficient d'ionisation (appelé parfois coefficient isotonique). Pour un non-électrolyte, i=1 • Le potentiel hydrique Le potentiel hydrique () d’une cellule représente la résultante du potentiel osmotique ( = - PO) et de la pression de turgescence (P) :  = - + P. A rappeler que l’eau circule toujours du potentiel le plus élevé vers le potentiel le plus bas (en termes de valeurs relatives). Milieu intérieur Milieu extérieur ΔΨ = ΨINT - ΨEXT Iso-osmotique Isotonique Équilibre ΔΨ = 0 Hypo-osmotique Hypertonique Plasmolyse * ΔΨ > 0 Hyper-osmotique Hypotonique Turgescence ** ΔΨ < 0 * l'eau sort de la cellule ** l'eau entre dans la cellule
  15. 15. Manipulations : Relation plante-eau TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 12 Rappelons que l’ajustement osmotique désigne une accumulation active de solutés (acides aminés, sucres solubles, ions, ...) qui permet à la plante d’abaisser son potentiel hydrique en augmentant la valeur de son potentiel osmotique. Détermination du potentiel hydrique tissulaire Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule. 1. Préparation du matériel - Laver trois pommes de terre, les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau. Découper les en « frites » de préférence de longueur égale. - Après les avoir lavés, conserver les segments de tissus dans un papier filtre humide. - Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée (Lo, mesurée avec précision), en supprimant les bords inférieurs et supérieurs. - Immerger une « frite » dans chaque dilution de solution de sorbitol (polyol, sucre). 2. Mode opératoire - Préparer dans 10 béchers des solutions de mannitol ou saccharose à différentes concentrations (de 0 à 1 M). Becher 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Concentration (M) 0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.6 0.80 1.00 Calculer la pression osmotique de ces solutions en utilisant la relation [PO= R . T . C . i] - Après 1 heure au minimum, mesurer pour chaque « frite » la longueur finale L. - On calculera alors : ΔL (%) = ((Lo-L) / Lo). 100 avec L0 = longueur initiale 3. Résultats Reporter sur un graphique les courbes correspondant au ΔL en fonction de la pression osmotique de la solution (en MPa). Interpréter et déduire le potentiel hydrique des tissus qui correspond à la pression osmotique de la solution dans laquelle il n’y a pas eu échange d’eau (isotonie).
  16. 16. Manipulations : Relation plante-eau TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 13 TP 4- Mesure de Conductance stomatique à la vapeur d’eau Dans cette manipulation, sera mesurée la conductance stomatique à la vapeur d’eau au moyen d’un appareil portable : le poromètre (Dragon SC1). ✓ Principe de l’appareil En pratique, un poromètre compare la diffusion de l’eau à la surface de la feuille à celle obtenue sur une surface dont les caractéristiques sont connues (plaque d’étalonnage). Le poromètre (fig. 7 et 8) permet de mesurer la conductance stomatique des feuilles sur chacune des faces séparément. Pour réaliser ces mesures, la conductance de la feuille est mise en série avec deux éléments de conductance connue. La différence d’humidité mesurée entre les éléments permet d’obtenir le flux de vapeur d’eau. La conductance stomatique peut ensuite être calculée en se basant sur les hypothèses suivantes : • L’humidité relative dans la feuille est égale à 1 • Toutes les valeurs de conductance sont en série, le flux est donc constant entre deux points • La température de la feuille est égale à la température du premier capteur d’humidité • La conductance peut donc être exprimée comme une fonction des distances entre les capteurs d’humidité, de la température et des deux mesures d’humidité relative (2). Le principe de l’appareil est le suivant : une pince contenant une petite cavité, jouant le rôle de chambre de transpiration, est fixée sur la feuille, délimitant de la sorte un volume. La feuille transpire, la vapeur d’eau diffuse dans cette chambre qui contient un capteur d’humidité dont la capacité électrique varie linéairement avec l’humidité de l’air de la chambre. Après avoir fixé la pince sur la feuille, on chronomètre le temps nécessaire pour passer de l’humidité H1 à l’humidité H2 (H2>H1). Cet intervalle de temps dépend de la facilité avec laquelle la vapeur d’eau peut s’échapper de la feuille, autrement dit, il dépend de l’ouverture des stomates. L’intervalle de temps ainsi mesuré est en fait comparé à ceux obtenus, lors d’un étalonnage, avec un papier buvard humide. Pour pouvoir effectuer des mesures répétitives, à la fin d’une mesure, l’humidité relative ayant atteint et même dépassée la valeur de H2, une quantité d’air déshydraté par passage dans un tube contenant du silicagel (disséquant) est alors envoyée dans la chambre de transpiration afin de la ramener à une humidité inférieure à H1. L’appareil est doté de 2 thermocouples permettant de contrôler la température de la feuille et de la chambre. ✓ Application La conductance stomatique (gs) de feuilles des plantes étudiées témoins et stressées par arrêt d’arrosage sont mesurées. La mesure doit se faire sur la face inférieure. A titre de comparaison, la conductance stomatique peur également être mesurée au niveau de la face supérieure de la feuille. A chaque mesure, ramener la valeur de la conductance stomatique à zéro en secouant vigoureusement la pince de mesure afin d’éliminer l’humidité résiduelle.
  17. 17. Manipulations : Relation plante-eau 14 Figure 07 : Structure de la pince du poromètre (en haut, droite, en coupe) et utilisation. Figure 08 : Vue d’ensemble du poromètre et valeurs indiquées sur l’écran. La valeur du haut (à gauche) représente la conductance stomatique à la vapeur d’eau. A droite, le temps de mesure. La colonne de gauche : température et humidité relative du capteur au contact de la feuille. La colonne de droite : température et humidité relative du capteur éloigné de la feuille.
  18. 18. Manipulations : Pigments photosynthétiques TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 15 PIGMENTS PHOTOSYNTHETIQUES La photosynthèse est particulièrement sensible aux effets du manque d’eau (Tezara et al., 1999 ; Lawlor, 2002). La résistance de la plante au manque d’eau passe par des réarrangements fonctionnels et structuraux de l’appareil photosynthétique. La photosynthèse des plantes supérieures décroit avec la diminution de la teneur relative en eau (TRE) et du potentiel hydrique foliaire (Iannucci et al., 2000). Un faible taux photosynthétique est un effet inévitable du stress hydrique et il a été attribué à une limitation stomatique et, dans un deuxième temps, à des altérations du métabolisme (Iannucci et al., 2000, Nayyar and Gupta, 2006). La diminution de la teneur en chlorophylles des feuilles sous stress hydrique est également bien connue (Sairam et al., 1997, Lawlor and Cornic, 2002 ; Parida et al., 2007 ; Tas and Tas, 2007). Le stress hydrique inhibe la synthèse des chlorophylles au niveau des quatre étapes consécutives de sa biosynthèse (Phung et al., 2011). Le rapport chlorophylle (a/b) est un bon indicateur du seuil de tolérance au stress hydrique (Guettouche, 1990). Tahri et al. (1997) montrent que l’augmentation de la teneur en proline foliaire sous l’effet du stress est suivie par un abaissement dans les teneurs en pigments chlorophylliens totaux (Chlorophylles a et b). Par ailleurs, il a été souvent observé que les caroténoïdes sont moins sensibles que les chlorophylles au stress hydrique (Gummuluru et al., 1989, Tas and Tas, 2007). Dans certains cas, et contrairement aux chlorophylles, il est observé, lors d’un stress hydrique, une augmentation de ces molécules. Outre leur rôle essentiel dans les premiers événements photosynthétiques, les caroténoïdes protègent l'appareil photosynthétique du stress photo- oxydatif survenant en condition de lumière intense, évitant les éventuels dommages. Leur structure permet de piéger les espèces réactives de l’oxygène protégeant ainsi la cellule (Bast et al., 1998). TP- Extraction et dosages des pigments photosynthétiques Extraction : Pour faciliter le broyage, un peu de sable sera ajouté dans le tube et pour neutraliser l’acidification, une petite quantité de carbonate de calcium sera également rajoutée. Pour chaque échantillon, broyer énergiquement 20 mg de feuilles dans un mortier, à sec, puis en ajoutant par petites fractions 2 ml d’acétone à 80 %. Continuer le broyage jusqu’à ce que le matériel végétal devienne incolore. Centrifuger 5 mn à 3000 t/mn et récupérer le filtrat dans un tube à essai bien propre et sec. Dosage proprement dit : le dosage est réalisé par méthode colorimétrique ; les pigments étant naturellement colorés. Pour cela, il faut lire les densités optiques (D.O) des échantillons à l’aide du spectrophotomètre préalablement étalonné avec de l’acétone 80 % (correspondant à D.O = 0). Les lectures de D.O seront réalisées à des longueurs d’onde 647 et 663 nm pour les chlorophylles et 470 nm pour les caroténoïdes. Les concentrations sont déterminées selon les équations suivantes Lichtenthaller (1987) :
  19. 19. Manipulations : Pigments photosynthétiques TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 16 Chl a (µg / ml) = 12.7 x D.O663 – 2.7 x D.O645 Chl b (µg / ml) = 22.9 x D.O645 – 4.7 x D.O663 Chl a + Chl b = Chl totale (µg / ml) = 20.2 x D.O645 + 8.02 x D.O663 Ou Chl totale = (D.O. 652) / 34,5 mg/ml Caroténoïdes (µg / ml) = {(1000 x D.O470) - [(1.82 x Chl a) + (85.02 x Chl b)]} /198 Calculs : Calculer les teneurs en chlorophylles a et b, en chlorophylles totales et en caroténoïdes pour 100 g de matière végétale fraîche pour les feuilles vertes et les feuilles stressées. Calculer les rapports a / b et caroténoïdes / Chl a+b / dans les deux cas. Comparer. Figure 09 : Effets du stress de déficit hydrique sur le phénomène de la photosynthèse (Despinasse, 2015).
  20. 20. Manipulations : Sucres solubles TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 17 SUCRES SOLUBLES Les sucres solubles jouent un rôle central dans la structure, le métabolisme et le fonctionnement des plantes. Ils figurent parmi les composés osmotiques fréquemment accumulés en cas de carence hydrique (Morgan, 1984). On parle d’ajustement osmotique ou osmo-ajustement. L’accumulation de sucres solubles (principalement, saccharose, glucose et fructose) peut être attribuée à une hydrolyse de l’amidon (Zhang et Archbold, 1993) et à l’inhibition de certaines voies métaboliques de synthèse (Imamul Huq, 1984). Ils seraient responsables du maintien de l’intégrité des structures membranaires, chloroplastiques et mitochondriales en particulier (Hoekstra et al, 1991). Ils sont de plus impliqués, lors d’un stress, en tant que signaux capables d’activer des voies de signalisation aboutissant à des modifications d’expression (Ramel, 2009). TP 1- Etude quantitative des sucres éthanolosolubles : Mesure de la teneur Principe : La méthode du dosage des sucres solubles est basée sur la technique de Mc Cready et al. (1950). Les oses, en présence de l’acide sulfurique (H2SO4) à 91 % et à chaud, produisent des dérivés du furfural qui réagissent à chaud avec l’anthrone pour donner un composé bleu-vert. Extraction : Les sucres solubles sont extraits à partir de 100 mg de matière végétale fraiche (MVF). Les feuilles sont broyées dans 4 ml d’éthanol bouillant à 80 %. Après agitation, le broyat est centrifugé pendant 20 min à 5000 t/mn. Le surnageant est récupéré. Une deuxième extraction est réalisée et le surnageant est ajouté au précédent. Les deux surnageants sont mélangés et ajustés à 10 ml avec l’eau distillée. Dosage : 2 ml de réactif à l’anthrone (0.2 g dans 100 ml d’acide sulfurique à 95 %) sont rajoutés à 1 ml d’extrait glucidique. Les tubes sont agités puis placés au bain-marie à 100° C pendant 7 min pour permettre le développement de la coloration. Après refroidissement les densités optiques sont lues au spectrophotomètre à une longueur d’onde λ= 630 nm. Le spectrophotomètre est préalablement étalonné grâce à un blanc préparé à partir de 1 ml d’éthanol et de 2 ml de réactif. Courbe étalon : Une gamme d’étalonnage est réalisée à l’aide de concentrations croissantes de glucose préparées à partir d’une solution mère de 100 μg.ml-1 . Calculs : Déterminer la teneur des feuilles en sucres éthanolosolubles (exprimée en µg. g-1 de MVF). TP 2- Etude qualitative des sucres solubles par CCM Les sucres solubles extraits des feuilles (des plantules témoins et stressées) sont séparés et identifiés par chromatographie sur couche mince de silice. La phase mobile est constituée de chloroforme, acide acétique et d'eau distillée (3/ 3.5/0.5, v/v/v). La cuve est préparée la veille afin de la saturer. De même que la plaque chromatographique (plaque de verre imprégnée de gel de silice) est placée toute une nuit à l’étuve (100° C) afin de l’activer. Sur une plaque, tracer, au crayon de papier, un trait à 2 cm environ du bord inférieur et parallèlement à ce dernier. Ce trait, dessiné sur la plaque, ne doit pas tremper dans le solvant d’élution contenu dans le bac.
  21. 21. Manipulations : Sucres solubles TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 18 Déposer sur le trait, à l’aide d’une micropipette, à 1 cm d’intervalle, une goutte de chaque étalon (sucres de référence) et de 20 µl l’échantillon à analyser (extrait de feuille témoins et stressées). -Laisser sécher les taches avant d’éluer. Plonger les plaques dans la cuve contenant le solvant d’élution. -Recouvrir rapidement la cuve par une plaque de verre, afin que l’atmosphère, dans le bac, reste saturée en vapeurs d’éluant. -Lorsque le solvant qui monte a atteint les ¾ environ de la hauteur de la plaque (front du solvant), sortir la plaque et marquer immédiatement (car le solvant s’évapore très vite) la hauteur du front à l’aide d’un crayon de papier, puis laisser évaporer le solvant. La révélation des sucres solubles est réalisée au moyen de thymol préparé dans l’alcool et l'acide sulfurique (0.5 g de thymol, 95 ml éthanol 96 % et 5 ml d'acide sulfurique pur). Après la mise des plaques dans l'étuve à 80° C pendant 15 minutes, les taches apparaissent colorées en rose. -Mesurer ensuite, avec une règle graduée, la hauteur du front du solvant. -Identifier les rapports frontaux (Rf) et les sucres correspondats aux taches numérotés (fig. 9). Comparer entre les plantes témoins et les plantes stressées. En déduire la composition des échantillons en sucres solubles. Figure 10 : Exemple d’un chromatogramme (CCM) de sucres éthanolosolubles extraits des feuilles de plantes de blé tendre témoins et stressées.
  22. 22. Manipulations : Métabolisme azoté TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 19 METABOLISME AZOTE L’effet de la sécheresse sur la production de biomasse est souvent associé à une perturbation du métabolisme de l’azote, qui est un élément essentiel pour la plante. Les effets du déficit hydrique portent sur la régulation de l’expression de gènes codant pour des enzymes impliquées dans la régulation du métabolisme azoté (Nitrate réductase, Glutamine synthétase et Glutamate déshydrogénase, par exemple), la biosynthèse de composés compatibles azotés tel que la proline ou le transport de nitrates (Rouached, 2014). Ainsi, les stress abiotiques, et particulièrement le stress hydrique, induisent des changements (tant qualitatifs que quantitatifs) au niveau du métabolisme azoté (protéines, acides aminés), permettent une modulation des voies métaboliques et donc une meilleure protection de la plante. Le déficit hydrique inhibe la synthèse de la plupart des protéines, tandis que celle d’un ensemble restreint de protéines appelées « protéines de stress » (LEA, HSP…) est induite. Simultanément, la protéolyse est favorisée. Alors que l’activité de certaines enzymes diminue (comme la Rubisco et la PEPcase), celle d’autres enzymes peuvent augmenter. C’est le cas, par exemple, des enzymes hydrolytiques comme l’α-amylase et les protéinases, ou d’enzymes catalysant la synthèse des composés de type « osmolyte compatible » (Calatayud et al, 2013). La proline fait partie de cette catégorie de composés et son accumulation dans les feuilles, les tiges et les racines est considérée comme une des réponses induites les plus répandues en cas de stress, ce qui en fait un excellent indicateur de stress. La proline est le seul acide aminé dont la fonction amine soit secondaire. Cet acide aminé joue un grand rôle dans l’osmo- ajustement. En effet, lorsque le potentiel hydrique du sol diminue, la réponse de la plante au niveau cellulaire se traduit, entre autres, par une accumulation de solutés dans le cytoplasme entraînant une diminution du potentiel hydrique intracellulaire et donc permettant à la plante d’absorber l’eau contenue dans le sol. Ce phénomène est appelé ajustement osmotique. Outre son implication dans l’ajustement osmotique, la proline est également impliquée dans l’osmoprotection, la stabilisation du pH et de l’état redox (rôle anti-oxydant) (In Djebbar, 2012). Le niveau d’accumulation de la proline dépend du type et de l’intensité du stress. Sa détermination va permettre de détecter le stress, de le suivre dans le temps et de comparer son intensité. Par ailleurs il semble que la capacité d’accumulation de la proline soit un paramètre transmissible génétiquement et donc il peut être utilisé pour la sélection de variétés tolérantes aux stress hydrique, par exemple. TP 1- Mesure de la teneur en protéines hydrosolubles Il est bon de rappeler que la majorité de ces protéines solubles sont représentées par des enzymes et notamment la Rubisco (celle qui sert à fixer le CO2) dans le cas des feuilles vertes. Il existe par ailleurs des protéines de structure liées aux lipides, dans le cas des membranes par exemple, qui ne sont pas solubles dans l’eau. Les protéines de réserve sont très minoritaires dans la feuille. Principe : Les protéines solubles sont dosées selon la méthode de Bradford (Bradford, 1976). Cette méthode est un dosage colorimétrique basé sur le changement de la couleur du bleu de Coomassie G250 après sa liaison avec les acides aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présents dans les protéines (Weckber et Cory, 1988). Cette technique est rapide, sensible et reproductible.
  23. 23. Manipulations : Métabolisme azoté TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 20 Extraction : 100 mg de feuille sont broyés, à froid, dans 1 ml de tampon Tris-HCl pH 8.1. Le broyat est centrifugé à 1300 tr/mn pendant 10 mn. Le surnageant contient les protéines solubles. Dosage : A 100 µl d’extrait protéique (surnageant) sont ajoutés 3 ml de réactif de Bradford. L’ensemble est bien homogénéisé au Vortex et, après au moins la 5 min d’incubation à l’obscurité, la lecture de densité optique se fait à une longueur d’onde de 595 nm. L’étalonnage du spectrophotomètre est réalisé sur un blanc constitué de 100µl d’eau distillée et 3 ml de réactif de Bradford. Courbe d’étalonnage : La gamme étalon est réalisée à partir d’une solution mère de sérum albumine de bœuf (BSA) ou de caséine à 2 mg.ml-1 . Une gamme des solutions filles à des concentrations croissantes (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 et 2 mg ml-1 ) est préparée. La courbe étalon tracée servira à déterminer la quantité de protéines solubles dans l’extrait végétal. Calculs : Déterminer la teneur des feuilles en protéines solubles (exprimée en mg. g-1 de MVS). TP 2- Etude qualitative des protéines par électrophorèse SDS-PAGE L’électrophorèse (SDS-PAGE), en affectant à toutes les protéines une charge négative, permet de séparer ces molécules uniquement en fonction de leur poids moléculaire (voir principe). La comparaison des profils électrophorétiques des extraits de feuilles des plantules témoins et stressées, permettra de détecter éventuellement de nouvelles bandes pouvant correspondre à des protéines de stress. La séparation des protéines est faite en fonction de leur poids moléculaire dans un gel de polyacrylamide à 15 % selon la technique de Laemmli (1970). Les protéines (60 μg de protéines par puits) sont additionnées à 50 % de tampon de charge dénaturant (V/V) puis sont dénaturées 5 min à 90° C, avant d’être déposées sur gel. Les protéines sont soumises à une électrophorèse d’environ 6 h à 80 V dans un tampon de migration Tris-glycine-SDS pH 8,5. Les protéines migrent successivement dans un gel de concentration à 5 % de polyacrylamide puis dans un gel de séparation à 15 %. Un marqueur de taille (Molecular Weight Marker) est utilisé. Après la migration, les gels sont colorés pendant une nuit dans une solution de bleu de Coomassie, puis décolorés dans un mélange acide acétique-méthanol-eau (voir détails du protocole dans la troisième partie). Exercice : Identifier les poids moleculaires des proteines correspondantes aux bandes indiquées sur la figure ci-dessous (fig. 10). Pour la préparation des différents réactifs, voir les annexes.
  24. 24. Manipulations : Métabolisme azoté TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 21 Figure 11 : Exemple de profil électrophorétique des feuilles de blé tendre témoin (T) et stressées (S) par un arrêt d’arrosage. TP 3- Mesure de la teneur en proline libre foliaire Caractéristiques de la proline Formule : C5H9NO2 Point de fusion : 205° C Masse molaire : 115,13 g/mol Nom IUPAC : acide pyrrolidine-2-carboxylique ✓ Mode opératoire Principe de dosage : La technique utilisée pour le dosage de la proline est celle de Bates et al. (1973) modifiée par Magne et Larher (1992). La ninhydrine ou hydrate de tricéto-hydrindène réagit, à chaud, avec les acides aminés en donnant un chromophore « acide aminé- ninhydrine ». Cependant pour la proline, la fonction imine fournit une teinte rouge rosé qui présente un maximum d’absorption à 520 nm (méthode de Bates, 1973). Le chromophore proline-ninhydrine est préalablement extrait par du toluène. La quantité de proline présente est conforme à la loi de Beer-Lambert. Extraction : Dans des tubes d’Eppendorf, 50 mg de la matière végétale sèche sont broyés dans 1 ml d’eau distillée. Ces tubes sont placés dans un bain-marie à 100° C pendant 30 minutes. Ensuite, une centrifugation de 10 minutes à 13000 rpm est réalisée. Le surnageant
  25. 25. Manipulations : Métabolisme azoté TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 22 est récupéré. L’extraction est réalisée une deuxième fois avec 500 μl d’eau distillée et le surnageant est ajouté au précédent. Dosage : 1 ml du réactif à la ninhydrine à 1 % (1 g dans acide acétique glacial + eau, 60/40 v/v) est ajouté à 500 μl d’extrait de proline. Les tubes à essais sont placés dans un bain-marie à 95° C pendant 20 min. Après refroidissement, 3 ml de toluène sont ajoutés. Après agitation au vortex (15 à 20 secondes), deux phases se développent : • La phase supérieure organique contenant la proline. • La phase inférieure aqueuse qui sera éliminée. La phase supérieure est prélevée et sa densité optique (D.O) est mesurée à une longueur d’onde de λ = 520 nm au spectrophotomètre. Courbe d’étalonnage : Une gamme étalon est réalisée à l’aide de concentrations croissantes en proline préparées à partir d’une solution mère de 10 µg.ml-1 . Calculs : Déterminer la teneur des feuilles en proline libre (exprimée en µg. g-1 de MVS) Attention ! La ninhydrine est cancérigène. A manipuler avec précaution.
  26. 26. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 23 STRESS OXYDATIF L'une des conséquences les plus néfastes des stress environnementaux, dont le stress hydrique, est l’apparition d’un stress oxydatif, c’est-à-dire l'accumulation d’espèces réactives d’oxygène (ERO) (fig. 11) qui endommagent les membranes et les macromolécules et affectent le métabolisme cellulaire (Appel and Hirt, 2004). Le déficit hydrique crée un déséquilibre entre la lumière captée et son utilisation et, donc, entre la génération et l’utilisation des électrons, ce qui inhibe la photosynthèse (Golding and Johnson, 2003). La dissipation de l’excès d’énergie lumineuse au niveau de l’appareil photosynthétique aboutit à la formation des ERO dans les chloroplastes. Figure 12 : Schématisation de la balance entre les ERO et les antioxydants Dans des conditions optimales, les feuilles sont dotées d’enzymes et de métabolites antioxydants suffisants pour faire face aux ERO. De nombreux stress (hydrique, thermique, chimique, biotique…) peuvent initier la production de formes actives de l'oxygène comme le radical superoxyde (O2 -• ), le peroxyde d'hydrogène (H2O2), le radical hydroxyle (OH• ) ou l'oxygène singulet (1 O2). Les formes actives de l'oxygène sont responsables de nombreux dégâts cellulaires comme les peroxydations lipidiques, la dénaturation de l'ADN, de l'ARN et des protéines. Chez les plantes, les ERO peuvent être éliminées de manière enzymatique (fig. 12) grâce à l'action de la superoxyde dismutase (SOD), de la catalase (CAT) ou des enzymes du cycle ascorbate glutathion (Flexas et al., 2006). Diverses molécules peuvent également piéger les ERO et les radicaux libres comme le glutathion réduit, l'α-tocophérol (Vit. E), l'acide ascorbique (Vit. C) ou les composés phénoliques.
  27. 27. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 24 Figure 13 : Production et élimination des formes activées de l’oxygène (ERO) chez les plantes (Gadjev et al., 2008). Peroxyde d’hydrogène (H2O2), Anion superoxyde (O2 - ) et oxygène singulet (1O2 ). PSI : photosystème I ; PSII : photosystème II ; ETC : chaîne de transport d’électrons ; SOD : superoxyde dismutase ; CAT : catalase ; AsA/GSH : cycle ascorbate/glutathion. Comment étudier le stress oxydatif ? Le stress oxydatif doit être étudié à travers trois aspects afin de comprendre ses mécanismes et ses manifestations. a. La production de ROS : Mise en évidence du H2O2 ou du superoxyde par une technique cytochimique, par exemple. b. Les effets délétères (conséquences) : Peroxydation des lipides membranaires par le dosage du malondialdéhyde (MDA) et mesure de l’intégrité membranaire, par exemple. c. Les systèmes de défense : Mesure des activités antioxydantes enzymatiques et non enzymatiques. Ce sont ces trois aspects que nous allons étudier.
  28. 28. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 25 TP 1- Détection du peroxyde d’hydrogène (H2O2) par méthode cytochimique Principe : Le peroxyde d’hydrogène est détecté par une méthode cytochimique en utilisant le 3,3’ diaminobenzidine (DAB) (D5637, Sigma-Aldrich). Le peroxyde d’hydrogène entraîne une oxydoréduction avec polymérisation de la molécule de DAB donnant un précipité marron très stable, au site de la réaction. Incubation : Des segments (5 segments de 2 cm) ou des petits disques de feuilles de chaque lot sont immergés dans une solution de DAB à 1 mg/ml dans l'eau pendant 24 heures à température ambiante sous agitation et à l’obscurité. La solution de DAB est préparée avant chaque expérimentation afin d’éviter toute auto-oxydation (Thordal-Christensen et al., 1997). Les segments sont ensuite rincés à l’éthanol à 60 % durant 12 heures. Figure 14 : Photos montrant un exemple de la détection cytochimique du peroxyde d’hydrogène (H2O2) par le DAB au niveau des feuilles de plantes de blé témoins et stressées par un arrêt d’arrosage. TP 2- Détection de l’anion superoxyde (O2 - ) par méthode cytochimique Principe : L’anion superoxyde est détecté par une méthode cytochimique en utilisant le nitrobleu de tétrazolium (NBT) (N6876, Sigma-Aldrich) (Rao and Davis, 1999). Les radicaux superoxydes présents réduisent le NBT en bleu de formazan stable de couleur bleue-indigo (Beyer and Fridovich, 1987). Incubation : Des segments (5 segments de 2 cm) ou des petits disques de feuilles de chaque lot sont immergés dans une solution de NBT à 0.5 mg/ml dans un tampon phosphate de sodium à pH 7,6 pendant 24 heures, à température ambiante, à l’obscurité. Les segments sont ensuite rincés à l’éthanol à 60 % pendant 12 heures.
  29. 29. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 26 Figure 15 : Photos montrant un exemple de la détection cytochimique de l’anion superoxyde (O2 - ) par le NBT au niveau des feuilles de plantes de blé témoins et stressées par un arrêt d’arrosage. TP 3- Altération des membranes : Mesure de l’intégrité membranaire Il est admis que le stress hydrique est accompagné d’un stress oxydatif qui augmente la production des radicaux libres provoquant, ainsi, une peroxydation des lipides membranaires qui cause une altération des membranes cellulaires (Smirnoff, 1993). La mesure de la fuite d’électrolytes a longtemps été utilisée comme technique pour quantifier les dommages des membranes cellulaires des plantes sous divers stress abiotiques (Adam et al., 2000 ; Sriram et al., 2000). Le taux de fuite d’électrolytes mesuré est utilisé pour estimer la stabilité de la membrane cellulaire. Il a été démontré que la mesure de la fuite d’électrolytes peut être corrélée avec différents paramètres physiologiques et biologiques conditionnant la réponse de la plante aux conditions de l’environnement telles que la résistance stomatique, le potentiel osmotique (Premachandra et al., 1989) et la synthèse d’enzymes antioxydantes (Liu and Huang, 2000 ; Sreenivasulu et al., 2000). ✓ Mode opératoire La destruction des membranes cellulaires est estimée par la mesure de la conductivité membranaire. Cette expérience consiste à mesurer le pourcentage de conductivité qui est proportionnel à la concentration de molécules chargées ayant quitté des cellules détruites et présentes dans le bain (fuite d’électrolytes) (Pike et al., 1998). Elle nous renseignera sur le taux de destruction des membranes (fig. 15).
  30. 30. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 27 Figure 16 : Principe de Mesure de l’intégrité membranaire des cellules végétales Pour cette expérience, nous disposons d'un conductimètre délivrant les mesures en μSiemens (il est important de faire attention à la température et aux volumex). Après les avoir rincés à l'eau distillée, 10 segments foliaires de 1 cm, ou des disques foliaires, sont placés dans 20 ml d’eau distillée dans un Erlenmeyer, puis agités pendant 1 h. La conductivité est lue une première fois. Le mélange eau et tissus foliaires est ensuite placé 30 min à 95° C pour obtenir une destruction totale des membranes. Nous obtenons, ainsi, la conductivité totale, deuxième mesure de conductivité lue après retour du mélange à la température ambiante. Les résultats sont exprimés en pourcentage, selon la formule ci-dessous : % fuite d’électrolytes = conductivité x 100 / conductivité totale TP 4- Peroxydation lipidique : mesure de la teneur en malondialdéhyde (MDA) La peroxydation lipidique est mesurée par la quantification du malondialdéhyde (MDA), un produit de dégradation des réactions de peroxydation lipidique se formant lors de l’attaque des lipides polyinsaturés par des espèces réactives de l’oxygène. Une molécule de MDA en milieu acide et à chaud est condensée avec deux molécules d’acide thiobarbiturique (TBA) pour former un complexe coloré en rose susceptible d’un dosage spectrophotométrique à une longueur d’onde λ = 532 nm. Cette technique présente d’excellentes qualités sur le plan de la sensibilité, sauf qu’elle manque de spécificité à cause des interférences (molécules ne relevant pas du stress oxydant mais réagissant avec le TBA, mais elle reste le test le plus simple et le plus classique qui permet l’évaluation de la
  31. 31. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 28 peroxydation lipidique. D’ailleurs certains auteurs ne parlent pas de MDA, mais de substances réagissant avec le TBA (TBARS) (fig. 16). Figure 17 : Réaction du TBA avec le MDA (https://www.institut-numerique.org%2Fb-methodes-de-travail) ✓ Mode opératoire Extraction : Broyer 100 mg de MVF dans 1.5 ml de TCA à 1 %, puis centrifuger à 1200 tours/mn durant 20 minutes. Récupérer le surnageant. Dosage : A 500 µl de l’extrait, rajouter 1 ml d’acide thiobarbiturique (TBA) à 0.5 % (préparé dans le TCA à 20 %). Mettre à incuber pendant 30 minutes au bain-marie à 95° C. Après refroidissement, la lecture de la D.O est effectuée à 532 et à 600 nm. La lecture de la DO à 600 nm sert à déduire l’absorption due à d’autres substances autres que le complexe MDA-(TBA)2.
  32. 32. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 29 Calculs : La teneur en MDA (mmoles. g-1 MVF) est calculée en utilisant le coefficient d’extinction molaire du MDA (ε = 155 mmol.L-1 .cm-1 ). TP 5- Mesure de l’activité antioxydante de la superoxyde dismutase (SOD) Principe : Le dosage de la SOD est effectué selon la méthode de Marklund et Marklund (1974) (légèrement modifiée par Boucelha et al. 2019a). L'autooxydation du pyrogallol en présence de l'EDTA est inhibée par la SOD de pH 7.9 à 9.1, la réaction est inhibée jusqu'à 90 % par la SOD, ce qui indique une totale dépendance de l'anion superoxyde (O2 - ) dans cette autooxydation. Le principe du dosage est donc basé sur la compétition entre la réaction d'oxydation du pyrogallol par l'O2 - et la dismutation de l'O2 - par la SOD. Une unité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme capable d'inhiber 50 % de l'auto- oxydation du pyrogallol dans les conditions du dosage (fig.18). Figure 18 : Principe de la réaction de la SOD et l’auto-oxydation du pyrogallol.
  33. 33. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 30 Extraction : 150 mg de MVF sont broyés à froid dans 1 ml de tampon d’extraction (Tris-HCl pH 8.1). Une centrifugation est ensuite réalisée à 12000 tr/mn pendant 20 min à 4° C. Le surnageant (l’extrait enzymatique) est récupéré et maintenu au froid jusqu’à utilisation. L'évaluation de l'autooxydation du pyrogallol est réalisée par mesure différentielle entre un contrôle et un essai. Le témoin : 2.1 ml du tampon réactionnel (Tris-HCl) à 50 mM pH 8.2, EDTA 1 mM. La réaction est initiée par l'ajout du 100 µl de pyropagallol à 1 mM (préparé dans 0.01N de HCl). L’augmentation de l’absorbance à 420 nm est due à l'autooxydation du pyrogallol, la variation de la DO est mesurée chaque 30 secondes pendant quatre minutes. L’essai : 2 ml tampon (Tris-HCl) à 50 mM pH 8.2, EDTA 1 mM et 100 µM d'extrait enzymatique. La réaction est initiée par l'ajout du 100 µl de pyrpgallol à 1 mM. La variation de DO est mesurée une deuxième fois. Le % d'inhibition durant une minute est calculé selon l'équation suivante : % d’Inhibition = ((ΔDOcontrôle-ΔDOessai) / ΔDOcontrôle) *100 L’activité de la SOD est exprimée en unité de SOD par minute et par mg de protéines. TP 6- Mesure de l’activité antioxydante enzymatique de la catalase Objectifs de la manipulation : Le but de cette manipulation est de mesurer l’activité l’une des enzymes clés dans l’élimination du H2O2 : la catalase (CAT). 2 H2O2 2 H2O + O2 Ces manipulations portent sur l’activité enzymatique de la catalase chez des plantules étudiées ayant subi un stress hydrique en comparaison avec des témoins Principe : Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) possède un pic d'absorption dans I'UV (entre 230 et 250 nm). Cette absorption est facilement mesurable. La décomposition du H2O2 se traduit par une diminution de densité optique et l'activité enzymatique peut ainsi être mesurée. Cette méthode ne peut être utilisée qu'avec des préparations enzymatiques qui n'absorbent pas entre 230 et 250 nm (Anderson et al., 1995) (technique spectrophotométrique). ✓ Mode opératoire Extraction des Protéines totales (dont les enzymes) : Broyer 100 mg de matériel végétal à basse température (0 à 4° C) dans un mortier en présence de 1 ml de tampon Tris-HCl pH 8.1 contenant du β-mercaptoethanol (agent réducteur, réduit les ponts disulfures) ce qui permet de préserver l’activité enzymatique. Centrifuger pendant 5 minutes à 15000 g à 4° C. Recueillir le surnageant qui contient les protéines solubles, enzymes y compris (extrait enzymatique) et qui sera conservé dans de la glace tout au long des manipulations. Mesure de l’activité de la catalase : Dans une cuve en Quartz : -2 ml de tampon phosphate-potassium (KH2PO4/K2HPO4) pH 7.5
  34. 34. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 31 - Ajouter un volume d’extrait végétal équivalent à 30 µg de protéines (50 ou 100 µl d’extrait) -Réaliser le zéro au spectrophotomètre à 240 nm. -Ajout de 100 µl d’H2O2 à 6 % (10 mM) pour initier la réaction. -La variation de la DO est mesurée durant 3 min toutes les 30 secondes. L’activité est exprimée en nmoles de H2O2 dégradées par mn et par mg de protéines. Coefficient d'extinction moléculaire du H2O2 à 240 nm et à 25°C : ε = 36 M-1 .cm-1 La conversion de la vitesse initiale (changement de l'absorbance à 240 nm) en activité spécifique de la catalase est exprimée comme suit : Activité (µmoles H2O2 dégradé. min-1.mg-1 prot) = ΔD0. min-1 x Volume réactionnel / (36 x mg de protéines) TP 7- Mesure de l’activité antioxydante de l’ascorbate peroxydase (APX) Principe : Le principe de mesure de l’activité ascorbate peroxydase (APX) repose sur les propriétés de cette enzyme à oxyder l’ascorbate en présence de H2O2. Ascorbate + H2O2 Monodehydroascorbate + H2O Cette activité est déterminée en suivant l’oxydation de l’ascorbate (ε=2.88 M-1.cm-1) en deshydroascorbate à 290 nm, d’après la méthode décrite par Nakano and Asada (1980). ✓ Mode opératoire Extraction des Protéines totales (dont les enzymes) : Comme décrite précédemment pour la catalase, sauf que pour les échantillons destinés à l’analyse de l’ascorbate peroxydase soluble totale, 5 mM d’ascorbate sont ajoutés au milieu d’extraction des protéines, l’enzyme étant labile en absence de son donneur d’électrons. L’absence d’ascorbate dans le milieu d’extraction permet la mesure de l’activité de l’APX cytosolique. En effet, les isoformes cytosoliques de l’APX sont considérées comme étant résistantes à la déplétion en ascorbate au contraire des isoformes chloroplastiques qui y sont fortement sensibles. La différence de l’activité APX entre échantillons extraits avec ou sans ascorbate permet d’en déduire l’activité des isoformes chloroplastiques par rapport à l’activité soluble totale. Mesure de l’activité de l’APX : Le milieu réactionnel est constitué de 2 ml de tampon phosphate potassium (KH2PO4/K2HPO4) à 100 mM, pH 7 contenant du Na4EDTA à 1 mM, 15 µl d’ascorbate à 50 mM, 50 µl d’H2O2 à 6 %, (10 mM) et 100 µl d’extrait enzymatique. La réaction est initiée par ajout de l’ascorbate et suivie pendant 30s. L’activité est exprimée en nmoles d’ascorbate oxydé par min et par mg de protéines. Coefficient d'extinction moléculaire de l’ascorbate à 290 nm et à 25°C : ε = 2.88 M-1 .cm-1 La conversion de la vitesse initiale (changement de l'absorbance à 290 nm) en activité spécifique de l’APX est exprimée comme suit :
  35. 35. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 32 Activité (nmoles d’ascorbate oxydé. min-1 mg-1 prot) = ΔD.O min-1 x Volume réactionnel / (2,88 x mg protéines) TP 8- Mesure de l’activité antioxydante de la gaïacol Peroxydase (GPOX) Parmi les enzymes antioxydantes, les peroxydases (EC 1.11.1.7) jouent un grand rôle dans la détoxification en régulant le niveau de H2O2 intracellulaire. Chez les plantes supérieures, le nombre d’isoenzymes peut être très élevé, plus de 40 gènes correspondant à des isoperoxydases pour chaque plante plusieurs autres isoformes peuvent être générés par des modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles. La gaïacol (ou guaiacol) peroxydase (GPOX) est un groupe important de peroxydase qui oxyde le gaïacol (omethoxyphenol) utilisé en tant que substrat réducteur. Elle appartient à la classe de glycoprotéines. Cette enzyme est localisée dans différents compartiments cellulaires (parois, mitochondries, membranes, cytosol, vacuoles) et participe dans de nombreux processus physiologiques comme le développement des plantes, la sénescence, la biosynthèse des lignines, l'organogenèse via la dégradation de l'AIA et la biosynthèse de l'éthylène. Grâce à son importante capacité à éliminer les formes actives d'oxygène, la GPOX intervient dans les conditions de stress (Albert et Anderson, 1987). En effet, cette enzyme consomme le H2O2 en utilisant le gaïacol ou le pyrogallol comme donneur d'électrons selon la réaction suivante : 2H2O2 + 4 gaïacol (2méthoxy phénol) Tétragaïacol + 8 H2O Figure 19 : Réaction de la peroxydase utilisant le gaïacol comme substrat (http://www.takween.com). Principe : L’activité de la gaïacol peroxydase est déterminée selon la méthode de MacAdam et al. (1992) légèrement modifiée par Boucelha et al. (2019b). Cette activité est mesurée par une technique colorimétrique basée sur l’augmentation de l’absorbance à 470 nm due à la polymérisation du gaïacol en tétragaïacol (oxydation) (fig. 17) donnant une coloration orangée en présence de peroxyde d’hydrogène (H2O2) (technique spectrophotométrique). L’activité de la GPOX sera mesurée au niveau des feuilles de plantule en conditions normales et en condition de stress de déficit hydrique.
  36. 36. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 33 ➢ Protocole expérimental Extraction de l’enzyme : Elle est réalisée à partie de 100 mg de matière végétale fraîche par 2 ml de tampon phosphate potassium (KH2PO4 / K2HPO4) à 0.1 M pH 6.5, dans de la glace. Après une centrifugation de 15 min à 12000 tr/min à 4° C, le surnageant (l’extrait enzymatique) est récupéré et maintenu au froid jusqu’à l’utilisation. Mesure de l’activité : Dans une cuve, à 100 µl de l’extrait enzymatique, sont ajoutés : - le mélange réactionnel constitué de 2.5 ml du même tampon phosphate utilisé pour l’extraction - 50 µl de H2O2 à 6 % (Correspondant à 10 mM). La réaction débute dès l’addition des 50 µl d’une solution de gaïacol (36 mM) au mélange réactionnel. L’activité est suivie en fonction du temps. La variation de la DO est mesurée, à 470 nm, chaque 30 secondes pendant quatre minutes. L’activité enzymatique est exprimée en µmoles de gaïacol oxydé par minute et par mg de protéines, en utilisant le coefficient d’extinction molaire du tétragaïacol (ε=26.6 mM-1 cm-1 ). Activité (μmol de tétragaiacol formé mg-1 prot) = ΔDO /min x volume réactionnel / (26.6 x mg protéines) TP 9- Mesure de la capacité anti-oxydante non enzymatique totale (CANET) D’après Prieto et al. (1999), la CANET correspond au dosage des antioxydants naturels capables de prévenir les dommages oxydatifs. Ces anti-oxydants non enzymatiques peuvent se comporter comme des piégeurs des radicaux libres par les interventions directes sur les molécules prooxydantes ou indirectement, en chélatant les métaux de transition, empêchant ainsi la réaction de Fenton. Ce type d’antioxydants possède un avantage considérable par rapport aux antioxydants enzymatiques. Parmi ces antioxydants non enzymatiques, nous pouvons citer le glutathion, l’acide ascorbique (vitamine C), les tocophérols (vitamine E), les caroténoïdes et les composés phénoliques dont les flavonoïdes (Asada, 1999 ; 2006). Les niveaux de la CANET reflètent le taux de l’état réduit de ces molécules. ✓ Mode opératoire La capacité anti-oxydante non enzymatique totale (CANET) d’extrait de feuilles a été estimée par la méthode de Prieto et al. (1999). Un échantillon de 20 mg de feuille est broyé dans 1 ml de méthanol pur. Ensuite, les extraits sont été mis à macérer à 4° C pendant 1 h, sous agitation. Dans des tubes Eppendorf, 100 µl d'extrait d'échantillon sont mélangés à 1 ml de réactif au molybdate d’ammonium. Les tubes sont, ensuite, incubés au bain-Marie à 95° C pendant 90 min. Après refroidissement du mélange à température ambiante, l'absorbance (D.O) de la solution est mesurée à 695 nm. La CANET est exprimée en mg équivalents d’acide
  37. 37. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 34 ascorbique par g de MVF. A cet effet, une courbe d’étalonnage d’acide ascorbique à 300 μg.ml-1 est tracée. III. Techniques utilisées : principes Dans cette partie nous allons présenter les principes des techniques utilisées pour les analyses des paramètres du stress hydrique citées précédemment. III.1 Spectrophotométrie d’absorption III.1.1 Introduction La spectrophotométrie est une méthode d'analyse physico-chimique qui permet de déterminer aussi bien qualitativement que quantitativement des ions ou des molécules présents dans une solution, sans la modifier ou l'altérer. Cette technique, utilisée en chimie et en biochimie utilise la propriété de ces ions ou molécules de pouvoir passer de l'état fondamental à un état excité par absorption d'un rayonnement de longueur d'onde adéquate. Elle permet, donc, d'identifier une substance chimique et de déterminer la concentration d'un soluté dans une solution, par l'interaction des électrons des molécules du soluté (appelé chromophore) avec la lumière. La spectrophotométrie (on parle aussi de colorimétrie) visible mesure les variations d'intensité d'un faisceau lumineux lors de la traversée d'une substance colorée. La couleur d'une substance (domaine du "visible") correspond à la teinte "complémentaire" de celle des radiations absorbées III.1.2 Principe Lorsqu'un faisceau de lumière blanche d'intensité Io traverse une solution d'un chromophore, ce dernier absorbe plus que d'autres certaines longueurs d'onde (la solution apparaît colorée) et restitue une intensité I du faisceau initial ; le domaine de longueurs d'onde absorbées préférentiellement s'appelle la couleur complémentaire. Figure 20 : Principe du spectrophotomètre.
  38. 38. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 35 Par exemple, une solution qui nous apparaît bleue sous-entend qu'elle absorbe principalement dans le jaune (λ~614 nm). ➢ Loi de Beer-Lambert Lorsqu’un faisceau monochromatique traverse une solution colorée, une partie de la lumière est absorbée par la solution proportionnellement à sa concentration. I = Io.10-εLc ε = coefficient d'extinction du chromophore C = concentration molaire de la solution L = épaisseur de la solution (de la cuve) On définit l'absorbance (A) ou densité optique (D.O) d'une solution comme : La lecture de la densité optique permet de mesurer une concentration (dosage)
  39. 39. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 36 III.2 Chromatographie sur couche mince III.2.1 Introduction Le terme de "chromatographie" a été créé par Mikhail TSWETT en 1905, pour décrire une technique de séparation de pigments végétaux (chlorophylles et caroténoïdes) sur des colonnes remplies d’une substance adsorbante. La chromatographie est une méthode physique de séparation et d’analyse basée sur les différences d'affinité des substances à analyser à l'égard des deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, sépare les constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré) partition sélective des solutés entre ces deux phases. Les séparations chromatographiques sont basées sur la répartition des solutés dans deux phases : soluté A (phase mobile) ↔ soluté A (phase stationnaire) La constante d'équilibre de cette réaction est appelée : rapport de distribution K. C'est le terme recommandé par l'UICPA (Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée) depuis 1993 au lieu de constante de distribution, coefficient de distribution et coefficient de partage encore utilisés. K est égal au rapport des concentrations du soluté A dans les deux phases : KA = [A]stat / [A]mob [A]stat = concentration (en mol. L-1 ) du soluté dans la phase stationnaire. [A]mob = concentration (en mol. L-1 ) du soluté dans la phase mobile. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile). 2.2 Chromatographie sur couche mince (CCM) L'analyse est qualitative (identification). On utilise comme phase stationnaire un agent adsorbant insoluble dans la phase mobile. Sa capacité d’adsorption dépend de sa surface et de son type d’activité. La phase stationnaire est fixée sur un support en verre ou en aluminium ou en plastique, sous forme de couche très fine (30 à 50 µm). Exemples d’agents adsorbants : gel de silice, oxyde d’aluminium (alumine), silicate de magnésium, cellulose en poudre, support imprégné ou greffé, échangeurs d'ions, micro- supports (HPTLC). La phase mobile liquide est dénommée éluant ou solvant d’élution. Elle doit être chimiquement inerte vis-à-vis de l’échantillon à séparer. Le choix des solvants se base sur l’échelle de polarité ; il est dicté en fonction des trois principaux critères : polarité du mélange à séparer, activité de la phase stationnaire et polarité de l’éluant (solvant).
  40. 40. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 37 Résultats obtenus après développement (retrait de la cuve et séchage) et révélation (application d’un réactif pour visualiser les taches ou spots). La révélation peur également se faire sous UV pour certaines molécules non colorées, avec ou sans réactif. Figure 21 : Schéma présentant les étapes d’une chromatographie sur couche mince (CCM) (https:// www.technobio.fr%2Farticle)
  41. 41. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 38 III.3 Electrophorèse III.3.1 Introduction L'électrophorèse permet, comme la chromatographie, une séparation des molécules en se basant sur une de leur propriété physique : ici leur charge électrique. Le principe consiste à mettre la solution contenant les molécules à séparer sur un gel aqueux entre une anode et une cathode et à faire passer un courant. Les ions positifs vont alors se déplacer vers la cathode et les ions négatifs vers l'anode, les molécules neutres ne bougeant pas. Comme il est difficile de se déplacer dans le gel, les molécules se déplaceront à des vitesses variables selon leur taille. Les molécules plus petites se déplaceront plus rapidement et atteindront l'extrémité du gel, tandis que les molécules plus grosses seront ralenties et resteront près du début. Cette technique est à la fois très puissante, car elle permet une séparation très fine des différentes et très (relativement) à facile à mettre en œuvre. Cette méthode est, comme la chromatographie, qualitative. On peut dire de cette technique qu’elle est semi-quantitative, puisque qu’on peut procéder à des dosages dans certains cas. Enfin, de par son mode opératoire, elle permet de traiter simultanément plusieurs échantillons sur un même gel et donc de soumettre ces échantillons exactement aux mêmes conditions expérimentales, pour des comparaisons fiables. Grâce à ces qualités, elle est couramment utilisée dans les laboratoires de recherche, mais aussi d'analyses médicales pour séparer les ADN, les ARN ou les protéines. Avec l'électrophorèse en gel, on obtient un gel où les molécules sont réparties sur toute la surface. Si elles sont colorées, les molécules apparaissent comme de courtes bandes à l'œil nu. Le gel peut être utilisé de bien des façons. III.3.2 Electrophorèse sur Gel PolyAcrylamide (SDS-PAGE) L'une des variantes les plus répandue de l'électrophorèse est la SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Le gel de polyacrylamide permet la séparation de molécules (protéines, acides nucléiques) selon 2 critères : la charge électrique et la taille. Les gels sont préparés en mélangeant, dans un tampon approprié, le monomère d'acrylamide et le bis-acrylamide. La polymérisation est catalysée par le persulfate d'ammonium et le Tetramethylethylenediamine (TEMED). Le copolymère obtenu est un réseau tridimensionnel. Il est facile de jouer sur le degré de réticulation, et par conséquent sur la taille des pores du gel, en jouant sur la concentration initiale en acrylamide. Le critère de séparation suivant la charge peut être éliminé par la présence au cours de l’électrophorèse d’un agent dénaturant et chargé des protéines, le dodécyl sulfate de sodium ou SDS. Le SDS est un dénaturant des protéines qui agit en créant des interactions hydrophobes entre sa chaîne hydrocarbonée et les régions hydrophobes des chaînes polypeptidiques. Le SDS étant chargé négativement il confère aux protéines des charges nettes très négatives. Les protéines ainsi traitées migrent alors comme des poly-anions, indépendamment des charges de leurs groupements ionisables. La dénaturation doit être complétée par la rupture des ponts disulfure par un agent réducteur tel que le ß- mercaptoéthanol ou le dithiothréitol (DTT). La séparation s'effectue alors exclusivement selon la taille. Ce type d’électrophorèse en conditions dénaturantes est appelé SDS-PAGE (pour Poly-Acrylamide Gel-Electrophoresis). Pour une porosité donnée du gel et pour une gamme de poids moléculaire donnés, il existe alors une relation linéaire entre la mobilité
  42. 42. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 39 électrophorétique et le logarithme de la masse molaire (fig. 20). On détermine dans ces conditions dénaturantes les masses moléculaires des chaînes polypeptidiques. La séparation des chaînes polypeptidiques est obtenue en déposant les échantillons sur un gel comportant deux parties correspondant à deux concentrations différentes d’acrylamide : - Un gel de concentration qui est un gel à gros pores (acrylamide 3% par exemple) dans du Tris-HCl pH 6.8. Ce gel comprend les zones de dépôt des échantillons. - Un gel de séparation qui est un gel à petits pores (acrylamide 8% par exemple) dans un tampon Tris-HCl pH 8.8. Le tampon situé en dessus et en dessous des gels est du Tris-glycinate pH 8.3. Dans le gel de concentration les molécules ne sont pas triées en fonction de leur taille car la porosité est importante, par contre les différences d'ions (glycinate, Cl) et de pH entraînent une concentration des molécules en une mince couche avant pénétration dans le gel de séparation. Figure 22 : Photos montrant les différentes étapes de la réalisation d’une électrophorèse SDS- PAGE
  43. 43. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 40 III.4. Conductimétrie III.4.1 Introduction Un conductimètre permet de déterminer la conductance d'une portion de solution ionique. Cet appareil est essentiellement constitué d'une cellule de mesure formée d'un corps rigide sur lequel sont fixées deux plaques parallèles de surface S, distantes de L. Ces deux plaques (ou électrodes) sont en platine, métal précieux qui résiste bien à la plupart des solutions aqueuses courantes. C’est Friedrich Wilhelm Georg Kohlrausch grand physicien allemand qui en 1874 trouvera la loi de Kohlrausch sur la conductivité des électrolytes et contribuera à la compréhension de leur comportement. En 1874, Kohlrausch démontra qu'un électrolyte possède un coefficient de résistance électrique défini et constant. En déterminant la variation de la conductivité en fonction de la dilution, il put déterminer la vitesse de transfert des ions en solution. Afin d'obtenir des résultats de haute précision, il utilisa des courants alternatifs qui prévenaient les dépôts d'électrolytes. Ces résultats aboutirent à la formulation de la loi de Kohlrausch. III.4.2 Conductance et conductivité d'une solution. III.4.2.1 Conductance Pour des tensions appliquées faibles, les solutions ioniques se comportent comme des conducteurs ohmiques ; tension appliquée aux électrodes et le courant circulant dans la solution sont proportionnels. u = R * i ----------------------> i = 1/R * U = G * U R est la résistance de la solution (en ohms, ) G est la conductance de la solution (en siemens, S) III.4.2.2 Conductivité La conductance d'une portion de solution ionique, de surface S et de longueur L se met sous la forme : G = σ S/L σ est la conductivité de la solution et se mesure en S. m-1 , en mS. cm-1 ou en µS.cm-1 . Elle caractérise la capacité de la solution à conduire le courant électrique. σ = G. L/S III.4.3 Mesures de la conductivité. La mesure des conductivités se fait en courant alternatif (pour éviter la polarisation des électrodes), en mesurant la tension aux bornes d'une cellule plongeant dans la solution à étudier et l'intensité du courant qui y circule. Les cellules sont en général formées de deux plaques conductrices parallèles de section S, séparées par une distance L. Le rapport S/L dépend de la cellule et permet de passer de la conductance G à la conductivité σ
  44. 44. Principes des techniques utilisées TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 41 Pour une cellule donnée, la conductance et la conductivité sont proportionnelles ; la conductivité peut être mesurée directement si l'appareil est étalonné dans ce sens. Il est alors utile, soit de disposer de solutions étalons, soit de connaître les conductivités de quelques solutions connues. Figure 23 : Principe de fonctionnement d’un conductimètre. (https://www. cap-concours.fr%2Fsanitaire-et-social%2Fconcours-paramedicaux
  45. 45. Références bibliographiques TP Physiologie des stress Boucelha L. et Djebbar R. (2020) 42 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES -Adam A.L., Gala A.A., Manninger K., Barna B. (2000). Inhibition of the development of leaf rust (Puccinia recondita) by treatment of wheat with allopurinol and production of a hypersensitive- like reaction in a compatible host. Plant Pathology., 49: 317-323. -Albert F., Anderson A.J. (1987). The effect of Pseudomonas putida colonization on root surface peroxidase. Plant Physiol., 85: 537-541. -Anderson D., Prasad K., Stewart R. (1995). Changes in isozyme Profiles of catalase, peroxidase and Glutathione reductase during acclimation to chiling in mesocotyls of maize seedlings. Plant Physiology., 109: 1247-1257. -Appel K., Hirt H. (2004). Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu Rev Plant Biol., 55: 373-399. -Bast A., Haenen G.R., van den Berg, R., van den Berg H. (1998). Antioxidant effects of carotenoids. Internat. J. Vit. Nutr. Res., 68: 399-403. - Bates S. (1973). Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant and Soil., 39: 205-207. -Beyer W.F., Fridovich I. (1987). Assaying for superoxide dismutase activity: some large consequences of minor changes in conditions. Analytical Biochemistry., 161(2), 559-566. -Boucelha L. (2015). Compréhension des mécanismes régissant l’endurcissement des graines de Vigna unguiculata (L) Walp. Thèse de Doctorat 3° Cycle, Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene (USTHB), Alger. -Boucelha L., Djebbar R. (2015). Influence de différents traitements de prégermination des graines de Vigna unguiculata (L.) Walp. sur les performances germinatives et la tolérance au stress hydrique. Biotechnol. Agron. Soc. Environ., 19(2): 132-144. -Boucelha L., Djebbar R., Abrous-Belbachir O. (2019a). Vigna unguiculata (L.) Walp. seed priming is related to redox status of plumule, radicle and cotyledons. Functional Plant Biology., DOI: 10.1071/FP18202. -Boucelha L., Djebbar R., Abrous-Belbachir O. (2019b). The involvement of guaiacol peroxidase in embryo development of Vigna unguiculata (l.) walp. during germination. Analele Universităţiidin Oradea, Fascicula Biologie, 26(2). -Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry., 72: 248-254. -Calatayud P.A., Garrec J.P., Nicole M. (2013). Adaptation des plantes aux stress environnementaux. In book: Interactions Insectes-Plantes, Chapter 14, Publisher: IRD & Quae, Editors: Sauvion N., Calatayud P.-A, Thiéry D., Marion-Poll F., pp.229-245. -Clarke J.M., McCaig T.M. (1982). Evaluation of techniques for screening for drought resistance in wheat. Crop. Sci., 22 : 1036-1040. -Davis W.J., Tardieu F., Trejo C.L. (1994). How do chemical signals works in plants that grow in drying soil. Plant Physiol., 104 : 309-314. -Despinasse Y. (2015). Diversite chimique et caracterisation de l’impact du stress hydrique chez les lavandes. Thèse de Doctorat, Université des Sciences et Techniques de Saint Etienne, France, 181p. -Djebbar R. (2012). Effet du stress hydrique sur le métabolisme cellulaire de plantes de tabac sauvage (Nicotiana sylvestris) et d’un mutant mitochondrial (CMSII). Thèse de Doctorat d’état, Université Houari Boumediene, Alger, Algérie, 233 p.
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