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MEDICINA VETERINARIA UNIPAZMICROBIOLOGÍA GENERALMic. Sandra Carolina BermúdezTECNICAS DE SIEMBRA1. OBJETIVO Aplicar los f...
se repite hasta obtener una dilución apropiada en esteejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml auna placa ...
Del tubo uno sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 2, agitar. Del tubo dos sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 3, agitar. De cad...
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Tecnicas de siembra

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Tecnicas de siembra

  1. 1. MEDICINA VETERINARIA UNIPAZMICROBIOLOGÍA GENERALMic. Sandra Carolina BermúdezTECNICAS DE SIEMBRA1. OBJETIVO Aplicar los fundamentos básicos correspondientes a lastécnicas de siembra usadas en el cultivo demicroorganismos.2. MATERIALES Y EQUIPOS Cofia Tapabocas Guantes quirúrgicos Bata de laboratorio Asa de inoculación Medios de Cultivo Servilletas Pipeteador Tijeras Mechero de alcohol Alcohol Antiséptico Cabina de flujo laminar Incubadora Balanza3. MARCO TEORICOUno de los elementos importantes para el estudio demicroorganismos, consiste en aislarlos y purificarlos a partir deltejido o material en estudio. Para que se lleve a cabo esteproceso existen diferentes metodologías y la elección decualquiera de ellas dependerá del tipo de tejido, ya sea animal ovegetal y del equipo que se dispone en el laboratorio.3.1 TÉCNICAS DE RECUENTO BACTERIANOPara el recuento demicroorganismos presentes en unamuestra de agua, suelo, aire,alimento, cultivos, entre otros,existen diferentes métodos otécnicas: Algunas técnicas sondirectas y permiten un recuento detodas las células, tanto las vivascomo las muertas. Las medidasdirectas incluyen los recuentosdirectos al microscopio o recuentoelectrónico, el recuento en placa, oel cálculo del número más probable(NMP).Otras son medidas indirectas y miden una propiedad de la masade las células como son la turbidez, el peso seco, o unaactividad metabólica.La técnica de siembra varia con el estado físico de la muestra esimportante considerar este aspecto en el momento de aplicar elrespectivo procedimiento:a. Recuento de colonias o recuento estándar en placa. Sebasa en contar las colonias de microorganismos que sedesarrollan después de inocular en un medio de cultivoadecuado e incubar a una temperatura y tiempodeterminados un volumen determinado de muestra. Seutiliza para determinar el número de células aisladas omicroorganismos unicelulares viables como bacterias,levaduras, también se utiliza para el conteo de esporasfúngicas presentes en la muestra.La muestra a inocular debe ser homogénea y no contenerconglomerados de células. Después de la incubación cadamicroorganismo o célula viable formará una masa visible deorganismos, o sea una colonia. De esta manera el númerode colonias permitirá a su vez determinar el número deorganismos viables en la muestra sembrada. Se puedenutilizar sistemas de siembra en superficie, o en profundidad.Generalmente la muestra original se diluye para que elnúmero de colonias desarrolladas en la placa se encuentrenentre 30 y 300 colonias y así permitir un óptimo crecimientoy facilitar la lectura. En primer lugar, la muestra se diluyeseriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml demedio estéril y se mezclan adecuadamente. Este proceso
  2. 2. se repite hasta obtener una dilución apropiada en esteejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml auna placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en lasuperficie de la misma (método de extensión en placa) omezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Lasplacas se incuban y se recuentan las colonias que sedesarrollan. Debido a razones estadísticas, las placasdeben contener entre 30 y 300 colonias.Cuando la muestra se diluye el cálculo del resultado se realizacontando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y300, se promedia y se multiplica por el factor de dilución. Losresultados se expresan en colonias por ml. Los resultadostambién pueden expresarse en unidades formadoras de colonias(UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el númerorelativo de microorganismos de un taxón determinado en unvolumen de un metro cúbico de muestra.En el caso de alimentos el resultado se considera como unindicador de las características higiénicas generales del alimentoContador de ColoniasPara el recuento de colonias se emplean equipos que consisteen una pantalla iluminada la cual posee una gran lente deaumento; pueden ser: contadores de colonias en los cuales lacaja de Petri se ajusta en una plataforma y se ilumina por debajoy al mismo tiempo la lente aumenta 1.5 veces el tamaño delobjeto. También existe un contador electrónico de colonias en elcual la caja de Petri se ubica en una platina iluminada, luego sepresiona la varilla de cuenta y el número exacto de colonias seproyecta instantáneamente en una pantalla digital.Conteo celular directoRecuento celular microscópico directo: Se basa en colocar unvolumen determinado de células sin fijar y realizar el conteoutilizando microscopía de fase. Para ello se utiliza la cámara derecuento de Petroff-Hauser o de Neubauer consistente en unportaobjetos con una excavación de 0.02 mm de profundidad enun área de 1 milímetro cuadrado, con una rejilla dividida en 25cuadrados grandes los cuales a su vez se subdividen en 16cuadrados de 4X4 o sea que la muestra se distribuye en 400celdillas.La muestra, se coloca en la excavación del portaobjeto y secubre con el cubreobjetos se deja reposar sobre la platina delmicroscopio durante unos minutos, y se procede a contar elnúmero de células en varias celdillas (generalmente en 16,equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el númeron de células observadas en esas 16 celdillas. El recuento celularse calcula así: n x 25 x 50 x 1000 = concentración de células/ml.Es un método muy rápido y sencillo pero no permite distinguircélulas vivas inmóviles de células muertas. Se utiliza ensuspensiones concentradasRecuento de células bacterianas utilizando sistemaselectrónicos del tipo Coulter Counter. El método consiste encolocar en una cámara del contador un volumen determinadodel cultivo (suspensión bacteriana) luego se hace pasar a travésun tubo capilar entre dos polos de una corriente eléctrica a otracámara. El poro un pequeño orificio de unos 15 µm de diámetroforma parte de un circuito eléctrico, de manera que cada vezque pasa una célula a través del mismo, la conductividad delcircuito disminuye y la presencia de la célula es detectadaelectrónicamente en el contador.TurbidezSe basa en la medida de la turbidez de los medios de cultivo enlos que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez esproporcional a la masa de las células en suspensión y sumedida nos permite estimarla. Para ello se utiliza unespectrofotómetro que mide la cantidad de luz que transmite unasolución o un cultivo líquido de células microbianas. A mayormasa de células en un cultivo, mayor será su turbidez, y menorla cantidad de luz que se transmitirá de manera que la lectura enel espectrofotómetro será mayor. Se utiliza en cultivos densos.Permite medir el crecimiento de poblaciones. Para medir lamasa o el número de células con un espectrofotómetro, se debepreparar una curva patrón, o gráfica en la que se relacionan lasmedidas del espectrofotómetro con la masa celular o el númerode células en un cultivo de un determinado y se expresa enunidades de absorbancia.4. METODOLOGÍA1. DILUCIONES SERIADAS Pese 10 gr de la muestra que va analizar y deposítela en elerlenmeyer con 90 ml de agua peptona. Homogenice. Tome 1 ml de la suspensión suministradaRealice las diluciones: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 consolución salina estéril o agua peptona estéril.
  3. 3. Del tubo uno sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 2, agitar. Del tubo dos sacar 1 ml y adicionarlo al tubo 3, agitar. De cada dilución tome 0.1 ml y agréguelos a la caja de petri Realizando un movimiento circular, homogenice en sentidode las agujas de reloj para dispersar todo el contenidoagregado. Incube por 24 - 48 horas a 37 +/- 2°C Observe la morfología de las colonias a nivel microscópico ydescríbalas según: Tamaño, color y forma.2. SIEMBRA EN PLACAa. Siembra en Superficie o Siembra en placa con asaDigralsky: Esta técnica suele utilizarse para el recuento deviables. Adicione al medio sólido un inóculo de 0.1 ml, con lapipeta graduada estéril. Homogenice seguidamente con el asa Digralsky.b. Siembra en profundidad o por vertido en placa:c. Siembra por agotamiento en estría:Se toma con el asa de siembra previamente flameada unacantidad adecuada de la muestra problema depositando elinóculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partirde ahí se realizarán movimientos en zig-zag desde un extremode la placa al otro, ojo! no tomar en ningún momento un nuevoinóculo y no levantar el asa hasta acabar de sembrar toda laplaca.d. Siembra por agotamiento:Tome de la muestra problema con el asa de siembrapreviamente flameada el inóculo, deposítelo en el extremosuperior de la placa, extendiéndose de un extremo al otro sólode la parte superior.Gire ligeramente la placa y se vuelve a repetir el mismoprocedimiento hasta el otro extremo de la placa arrastrando lamuestra como en el caso anterior siguiendo la misma direcciónhasta repetir la operación unas 4 o 5 veces que son las quetiene cavidad la placa, haciendo que el último tramo se efectuaráhacia el interior de la placa. El resultado será que las coloniasestarán cada vez mas separadas como consecuencia de quecada vez se va arrastrando y separando mas la muestra. Esimportante que para separar estas colonias se realice unflameado en cada estría.e. Técnica de los cuatro cuadrantesCon un rotulador en la base de la placa, dibuje dos líneasperpendiculares que secrucen en el centro de laplaca de tal forma que sedivida en cuatrocuadrantes iguales.Tome con el asa desiembra una cantidad deinóculo y se adiciona en
  4. 4. el extremo superior de uno de ellos extendiéndose por todo esecuadrante en forma de zig-zag. La diferencia con la técnica deagotamiento es que aquí no hay que flamear el asa a la hora depasar por cada cuadrante. Seguir un orden de tal forma que seirá arrastrando el microorganismo problema, observando en elúltimo las colonias más separadas.3. SIEMBRA EN TUBOSa. Siembra en tubo por estríasTome con el asa de siembra una cantidad de muestra, se añadeal tubo desde el fondo en zig-zag hasta completar toda susuperficie. Se utiliza para conservar muestras durante largosperiodos.b. Siembra por punciónTome con asa de hilo de siembra, e introduzca el asa en elmedio de cultivo que hay en el tubo hasta el fondo y en posicióncentral. Esta técnica se utiliza para medios de cultivosemisólidos.Siembra por punción y estría: Consiste en dos tipos desiembras en una sola. Primero se realiza la siembra porpicadura y luego la siembra por estría.

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