1.
BMP S6
Les principales molécules biologiques:
Protéines (présent cours)
Acides nucléiques (Bio Mol II)
MÉTHODES D’ETUDE DE BIOMOLÉCULES
1

2.
Fonctions:
Contraction musculaire (actine, myosine)
Respiration (hémoglobine)
Immunité (anticorps)
Enzymes
Définition:
Chaine d’acides aminés liés par des liaisons peptidiques (amide)
Extrémités N-terminale et C-terminale
Origine :
Transcription : ADN ARNm
Traduction : ARNm protéine
Rappels sur la structure et fonctions des protéines
2

3.
La liaison peptidique
Il y a 21 acides aminés, mais un seul type de liaison utilisé pour les relier
entre eux: c'est la liaison peptidique.
La liaison peptidique est formée durant l'étape de traduction par une
liaison covalente entre un groupement α-aminé d'un acide aminé et le
groupement carboxylique d'un autre acide aminé. Une molécule d'eau
est éliminée. 3

4.
Les grands types d'interactions régissant le repliement de
la chaîne polypeptidique
L'effet hydrophobe Liaisons ioniques Liaisons hydrogène Ponts disulfure
4

5.
Les structures Primaire et Secondaire
Hélice Alpha
Liaison H: CO-NH
Le feuillet β
Structure secondaire
Structure primaire
Les hélices α : L'hélice α est caractérisée par une translation le long de l'axe central parallèle au grand
axe de l'hélice de 5,4 Å par tour d'hélice. Il y a environ 3,6 résidus par tour d'hélice
Les feuillets β : Les résidus acides aminés sont placés face à face dans 2 chaînes qui peuvent se
déployer, soit en sens contraire (chaînes antiparallèles), soit dans le même sens (chaînes parallèles)
5

6.
Les structures Tertiaire et Quaternaire
La structure quaternaire
La structure tertiaire
6

7.
1- Extraction:
Solubilisation
Centrifugation
Précipitation (sulfate d’ammonium, (TCA….)
2- Séparation : Chromatographie
Filtration sur Gel (exclusion par taille)
Echange d’ions (cations ou anions)
affinité
HPLC
Techniques de purification des protéines
7

8.
3-Caractérisation : analyse et détection :
Electrophorèse:
Milieu dénaturant Gel SDS
Milieu non dénaturant
Electrophorèse 2D
Iso électrophorèse
Transfert (élctroblotting)
Marquage froid et radioactif
Concentration
(Amicon, lyophilisation, …)
Quantification:
Dosage en UV
Méthodes colorimétriques (biuret, Bradford, …)
Techniques de purification des protéines
8

9.
4- Etude structurale: (notions générales)
Centrifugation analytique
Cristallographie
RMN
Séquençage
Spectroscopie de Masse
5- logiciels d’étude: (notions générales)
Prédiction de séquence
Recherche
Recherche et comparaison de séquences
Prédiction de la conformation et des séquences
Techniques de purification des protéines
9

10.
10m
Procédure générale de la
Purification et étude des protéines
Caractérisation
Centrifugation
Dialyse
Extraction
Purification
Tissu
brut
Etude structurale

11.
Protéines du sang
(hémoglobine)
1- Préparation des
hématies
lavage du culot
2- Lyse des hématies
A- Extraction
Protéines musculaires
(Myosine, Actine)
1- Homogénéisation
Le tissu (muscle) est mis
dans un tampon donné
puis broyé dans un
blender
Centrifugé : culot
cellulaire
2- Lyse cellulaire
Les membranes des cellules sont cassées pour libérer le contenu
de la cellule contenant notre protéine.
Cultures
bactériennes
(Protéines
recombinantes)
1- Centrifugation de
la culture
Le culot cellulaire
est suspendu dans
un tampon donné
2- Lyse des bactéries
Techniques de purification des protéines
11

12.
Méthodes de lyse cellulaire
A- Extraction
1- Choc osmotique :
Application : hémolyse
Processus : Les cellules sont
incubées dans un tampon de
concentration saline plus faible
(hypo osmotique).
L’entrée d’eau dans les cellules pour
rétablir l’équilibre de concentration
saline va éclater la paroi
membranaire.
Une petite agitation mécanique peut
aider le processus.
Techniques de purification des protéines
12

13.
Méthodes de lyse cellulaire
A- Extraction
2- Broyage :
Application : muscle
Processus : Le muscle est coupé en
petits morceaux puis repris dans un
tampon.
Le broyage se fait :
- Mixeur de cuisine (blender) : cassure
des membranes cellulaires par la lame
du mixeur et libération des protéines
musculaires.
- Billes de verre : cassure des membranes
cellulaires par la rotation des billes de
verre et libération du contenu cellulaire.
Techniques de purification des protéines
13

14.
3- Sonication:
Application : générale
Processus :
La destruction des membranes cellulaires
par les ultrasons.
Les vibrations ultrasoniques causent une
augmentation locale de la pression et de la
température entrainant la cassure des
membranes cellulaires.
la sonication doit se faire très rapidement et
en mettant le tube dans un bac de glace
(refroidissement).
Méthodes de lyse cellulaire
A- Extraction
Techniques de purification des protéines
14

15.
4- Détergents :
Application : réduite
Processus :
Alternative à la technique mécanique. les détergents détruisent la
barrière lipidique
Les détergents non ioniques (comme le Triton, CHAPS) entrainent moins
de dénaturation protéique et sont donc le premier choix quand il est
nécessaire de maintenir les fonctions et les interactions protéiques.
Les détergents ioniques (SDS) sont de bons solubilisateurs mais
augmentent les chances de dénaturations des protéines.
Méthodes de lyse cellulaire
A- Extraction
Techniques de purification des protéines
15

16.
Méthodes de lyse cellulaire
A- Extraction
Techniques de purification des protéines
16
5- autres processus de lyse : cycles de congélation-décongélation
Précautions à prendre pendant ou après la lyse cellulaire :
- Utiliser si nécessaire des inhibiteurs de protéase juste après lyse
- Ajouter des DNAses pour réduire la viscosité dûe à l’ADN
- Faire la centrifugation rapidement
- Garder l’extrait au froid

17.
Filtration ou centrifugation du lysat cellulaire
A- Extraction
Techniques de purification des protéines
17

18.
18
Forces s’exerçant sur une particule en suspension dans un
liquide soumis à centrifugation. La force de gravité et la
poussée d’Archimède sont augmentées au contraire de
l’agitation moléculaire, et elle ne sont plus négligeables
Forces s’exerçant sur une particule en suspension dans
un liquide. La force de gravité et la poussée d’Archimède
sont faible comparées à l’agitation moléculaire
Poussé d’Archimèdes
Gravité
Agitation moléculaire
On peut donc d’augmenter le pouvoir séparateur du champ de pesanteur vertical en
lui substituant un champ centrifuge radial.
On observe que les particules des molécules ou toutes substances solide qui repose
dans une phase liquide, se trouvant sous l'action de la pesanteur et de la poussée
d'Archimède (et parfois agitation moléculaire), tendent à tomber vers le fond
(sédimentation) ou à remonter vers la surface, selon leur densité et leur taille.
Principe
Techniques d’analyse des Biomolécules
La centrifugation

19.
19
Une centrifugeuse est constituée de une chambre de
centrifugation dans laquelle sort l’axe de rotation, qui est relié
au moteur. Sur l’axe on fixe le rotor et dans les emplacements
du rotor on met les éprouvettes contenants l’échantillon à
centrifuger.
L’accélération centrifuge ou champ centrifuge, généré par le
mouvement circulaire uniforme, est dirigé radialement vers
l'extérieure et dépend de la vitesse angulaire (ω) et de distance
(r en m) de l’axe de rotation, selon l'équation:
ω = 2π rpm/60
f = ω2 r avec ω = 2πn
r rayon moyen du rotor (m)
n = nombre de rpm (rotation par minute) soit n
rpm/60 ( rotation par seconde)
on a donc : f = (2 π rpm/60 )2 r
Appareillage et force de centrifuge
La centrifugation
Techniques d’analyse des Biomolécules

20.
20
La force centrifuge relative
La force centrifuge (Fc) qui agit sur l’échantillon dépend de sa masse (m), de la vitesse
angulaire (ω) et de distance (r) de l’axe de rotation, selon l'équation:
Etant donné que tout les corps sur terre sont soumis à la force de gravité on peut définir le
Champ Centrifuge Relative (RCF, relative centrifugal field) comme le rapport entre la force
centrifuge appliquée par la centrifugeuse sur la particule et la force de gravité (Fg = mg où g =
9.81m sec-2 ).
Le Champ Centrifuge Relatif est exprimé en nombre de g et il n’a pas de dimension (NB. le rad
n’a pas de dimension). Il nous indique le nombre de g nécessaire pour sédimenter ou séparer
une particule. Si l’on exprime la vitesse angulaire en tours par minute (rpm) et on substitue à g
sa valeur (9.81 m sec-2), on obtient:
Le Champ Centrifuge Relatif nous dit donc de combien de fois le champ d’accélération
centrifuge doit être multiplé de l’accélération gravitationnelle, il est donc une valeur absolue à
laquelle je soumet la particule pour la séparation. Par la formule nous mettons cette valeur en
relation avec la vitesse de la centrifugeuse (vitesse de rotation en rpm) et le rayon du rotor.
RCF = (2π rpm/60)2 r/9.81 = 1.118 x 10-3 x rpm2 x r
RCF = Fc/Fg = m ω2 r/mg = ω2 r/g
Fc = m ω2 r
La centrifugation
Techniques d’analyse des Biomolécules

21.
21
Bien que il soit possible de calculer facilement
la valeur de RCF avec la formule:
RCF = 1.118 x 10-3 x rpm2 x r r en m
Il est possible d’utiliser un nomogramme pour
calculer la valeur de RCF en g en connaissant le
rayon de rotation d’un déterminé rotor et la
vitesse de rotation en rpm.
Ex. rayon de rotation 9 cm = 0.09 m; vitesse de
rotation
12000 rpm
Réponse :
RCF = 15000 g
Le nomogramme de la centrifugation
La centrifugation
Techniques d’analyse des Biomolécules

22.
Processus : précipitation / concentration
Altération des conditions du solvant qui changent la solubilité des protéines
par rapport aux autres macromolécules de l’extrait.
Conversion des molécules/protéines d’un état soluble vers un état insoluble
puis séparation.
Mécanisme :
- Les protéines se lient entre elles divers types de liaisons
- Le mode de liaison le plus commun : liaisons hydrophobes
- La solubilité des protéines va dépendre des facteurs qui vont interagir sur
ces liaisons (liaisons hydrophobes) et donc sur la solubilité des protéines
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Agents de précipitation :
Sels : sulfate d’ammonium
Solvants organiques : éthanol, acétone
Techniques de purification des protéines
22

23.
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Technique de choix:
Réversible
Non dénaturante
Grande solubilité (3.6 M)
Mécanisme :
La solubilité des protéines peut être modifiée en altérant la concentration
de sel dans l’extrait;
• Les sels ajoutés prendront la place de l’eau autour de la protéine;
• Les sels neutraliseront les charges des chaînes latérales de la
protéine;
• Ces deux évènements favoriseront l’agrégation et la précipitation
des protéines;
Sulfate d’ammonium ((NH4)2SO4 )
Contact entre les surfaces hydrophobes des protéines : précipitation
des protéines (salting out)
Techniques de purification des protéines
23

24.
24
Salting out
Le degré de solubilité d’une protéine dépend du nombre d'acide amines hydropihliques à la
surface de la protéine
Le principe de la précipitation des protéines par le sel est basé sur la suppression/compétition
des interactions entre ces acides aminés hydrophiliques dans la protéine d’une part et les
molécules d’eau d’autre part
Donc de façon générale : les faible concentrations en sels favorisent la dissolution (non
précipitation) des protéines
la solubilité des protéines dimunie avec l’augmentation de la concentration en sels.
On peut donc séparer une protéine d’un mélange protéique par précipitation sélective à l’aide
des sels.

25.
Précautions: Addition lente et sous agitation ; Connaitre la
concentration requise pour chaque protéine ; Travailler à basse
température (4°C)
Les protéines généralement solubles à une concentration
similaire à celle du cytoplasme :
0.15 - 0.25 M (eucaryotes) 0.3 - 0.6 M (bactéries)
Les protéines insolubles à très faible concentrations :
précipitation par dessalage (dialyse ou gel filtration)
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Sulfate d’ammonium ((NH4)2SO4 )
Techniques de purification des protéines
25

26.
• Mécanisme similaire à l’effet du (NH4)2SO4 : l’éthanol s’associe plus
fortement avec les molécules d’eau que les protéines: déshydratation
des surfaces des protéines :
• Augmente l’interaction entre les groupements chargés à la surface
des protéines : L’enlèvement des molécules d’eau libère les
groupements chargés favorisant les interactions entre les groupes de
charges opposées .
• Précaution : Faible concentration de sels
Basse température (0 à -20°C) pour éviter la
dénaturation
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Solvants organique : éthanol, acétone...
Techniques de purification des protéines
26

27.
La variation du pH du tampon peut conduire à la précipitation des protéines :
pH inférieur à pHi : les protéines ont une charge nette globale positive
pH supérieur à pHi : les protéines ont une charge nette globale négative
pH=Phi la charge nette est = 0 : réductions d’interactions entre les protéines
donc réduction de solubilité : précipitation)
On ne laisse solubles que les protéines dont leur pHi sont > ou < au pH
Précautions :
Certaines protéines dénaturent à leur pI
B - Précipitation des protéines du surnageant :
L’effet du pH
Techniques de purification des protéines
27

28.
28
Effet du pH sur la précipitation des protéines

29.
29

30.
C - Dialyse :
Parce que le sel ajouté pour le « salting out » inhibe l’activité des protéines,
il doit être enlevé avant de continuer la purification. Ceci est fait par
dialyse;
La solution de protéine est simplement introduite dans un sac fabriqué
d’une membrane semi-perméable:
– Perméable aux petites molécules (e.g. sels);
– Imperméable aux protéines;
Heures
Techniques de purification des protéines
30

31.
D - Filtration:
La filtration est fréquemment employée en biochimie pour un grand
nombre d'applications : stérilisation, isolement de précipité, élimination
de sels de solutions, concentration de macromolécules,
Techniques de purification des protéines
Membrane de type « en profondeur »
Membrane de type « écran »
31

32.
32
PURIFICATION DES
PROTEINES
Apres extraction , précipitation et dialyse, on obtient en
général un mélange protéique qui contient plusieurs
protéines de caractéristiques biochimique différentes. La
purification de la protéine recherchée peut alors
commencer. Plusieurs techniques dites de
chromatographies (séparation) peuvent être utiisées.

33.
• Aussi appelé chromatographie par tamisage moléculaire
• Consiste en de petites billes contenant des pores d’une taille spécifique :
o Les billes sont composées de dextran (Séphadex), d'agarose (Sépharose)
ou de polyacrylamide (Séphacryl).
o La taille des pores des billes est voisine des macromolécules à séparer.
o Les protéines plus grosses que les pores n’entrent pas dans les billes, ont
moins de volume à traverser et vont éluer en premier;
o Les protéines plus petites que les pores vont entrer dans les billes de leur
élution sera retardée: elles élueront donc plus tard.;
• Les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire;
Chromatographie
Chromatographie d’exclusion de taille (gel-filtration)
Techniques de purification des protéines
33

34.
34

35.
Chromatographie
Chromatographie d’exclusion de taille (gel-filtration)
Techniques de purification des protéines
35

36.
Ve est le volume nécessaire de phase mobile pour éluer un composé de la
colonne après son dépôt sur le gel.
V0 est déterminé par mesure du Ve d'un composé dont la masse moléculaire
est supérieure à la limite d'exclusion du gel.
Vt est déterminé par mesure du Ve d'un composé dont la masse moléculaire
est inférieure à la limite d'exclusion du gel. V0< Ve < Vt
Si la molécule peut entrer dans les pores du gel, sa répartition entre la
phase interne et la phase externe est donnée par le coefficient de partage
entre la phase liquide et la phase gel noté Kav :
Kav= (Ve - V0 ) / (Vt – V0 ) log MM = f (Kav)
Avec 0 ≤ Kav ≤ 1
Chromatographie
Chromatographie d’exclusion de taille (gel-filtration)
Techniques de purification des protéines
36

37.
37
On définit les volumes suivants :
Vo : volume d’exclusion du gel : volume d’élution d’une molécule non retardée par le
gel. Le Mr de cette molécule est inferieur à la limite inferieure de la gamme d’exclusion du
gel. Il représente volume entre les billes.
Vt : volume total du gel. Volume d’élution d’une molécule retardée par le gel et qui
diffuse complètement dans le gel. Le Mr de cette molécule est supérieur à la limite
supérieure de la gamme d’exclusion du gel. Il représente le volume des billes du gel + le
volume entre les billes du gel.
Ve : volume d’élution de chaque protéine du mélange. On donne les Ve de P1-P7 selon
le tableau suivant :

38.
38

39.
39
On donne la courbe suivante qui représente log (masse molaire) en fonction KD sur une
échelle semi-logarithmique.
En utilisant la partie linéaire de la courbe, on peut déterminer la masse moléculaire de la protéine X.

40.
40
Le choix du type de gel de purification est important car il tient compte de la
taille (Mr) des protéines à fractionner

41.
Principes:
• A un pH donné chaque protéine a sa propre charge globale en fonction
de sa structure primaire ;
• La protéine est chargée (-) dans un tampon de pH supérieur à son pHi ;
• La protéine est chargée (+) dans un tampon de pH inférieur à son pHi ;
• La C.E.I. repose sur l’interaction entre les protéines de l’échantillon et
la charge immobilisée sur la résine.
Deux types de chromatographies d’échange d’ions :
- Chromatographie d’échange de cations C.E. C :
La charge immobilisée est (-) : et les ions (ici des protéines) sont (+)
- Chromatographie d’échange d’anion C.E.A :
La charge immobilisée est (+) : et les ions (ici des protéines) sont (-)
Chromatographie
Chromatographie d’échange d’ions
Techniques de purification des protéines
41

42.
• Les échangeurs d'ions sont des groupements chargés liés de façon covalente
à une matrice-support (résine).
– L'échangeur d'anions cellulosique le plus utilisé est le (DEAE)-cellulose
– L'échangeur de cations cellulosique le plus utilisé est le (CM)-cellulose
Chromatographie d’échange d’ions
Techniques de purification des protéines
• Les composés qui n'interagissent pas avec l'échangeur d'ions ne sont pas
retenus.
• Plus les composés interagissent avec l'échangeur d'ions, plus ils sont
retenus par la colonne.
• Une fois que les composés non voulus sont élués de la colonne, ceux voulus
peuvent être élués plus facilement en remplaçant le tampon d'élution par
un autre de concentration saline supérieure et/ou de pH convenable. 42

43.
Anion exchange
column = + charged
+
+
+
+
+
+ -
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
Na
+
Na
+
Na
+ Na
+
Na
+
Na
+
+
+
+
+
+
+Cl-
Cl- Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
+
+
+
+
+
+ -
-
-
-
-
-
Na
+
Na
+
Na
+
Si le pH de la phase mobile =7.2
Donc, la charge des protéines sera : (-) (-) (+) (+)
Application de
l’échantillon
Lavage
Chromatographie d’échange d’ions
Techniques de purification des protéines
Exemple
Elution (par augmentation de la concentration du sels ou gradient de pH)x 43

44.
Chromatographie
Chromatographie d’affinité (ou d’adsorption)
Techniques de purification des protéines
1- Incubation des protéines avec le support immobilisé sur la colonne
2- Lavage pour enlever les molécules qui s’accrochent sur support avec des liaisons non spécifiques
3- Elution avec un tampon qui contient une molécule qui a une affinité plus importante avec le support
• Cette méthode repose sur la spécificité et la réversibilité de l’interaction entre une
macromolécule (protéine) et son substrat
• Le support contient un ligand spécifique de la macromolécule à purifier lié par une
liaison covalente
• Seule la macromolécule fixant le ligand est retenue
• En général, l’élution se fait par un excès de ligand
1 2 3
44

45.
45
Le solvant est la phase liquide mobile qui
entraine les molécules à travers la
colonne
La pompe
pousse le
solvant travers
la colonne
La colonne contient le
gel de séparation
Le détecteur est un
spectrophotomètre qui
lit la DO des molécules
à la sortie de la colonne
Collecteur des fractions
protéiques
Enregistreur qui affiche les pics de DO sur écran pour impression
Le système de
chromatographie

46.
Chromatographie
Appareillage HPLC
Chromatographie en phase Liquide à Haute Performance
Techniques de purification des protéines
46

47.
Électrophorèse
Techniques de caractérisation des protéines
Le déplacement de l'ion dans un champ électrique sera soumis à deux forces :
 La force électrique, Félectrique, qui s'exerce sur un ion porteur d'une charge
q dans un champ électrique de potentiel E est : Félectrique = qE
 La force de friction s'oppose au déplacement électrophorétique:
Ffriction = vf
• v est la vitesse de déplacement de l'ion et f est son coefficient de
friction.
• f: dépend de la taille, de la forme et de l'état de solvatation de l'ion
ainsi que de la viscosité de la solution.
Principe : une molécule chargée placée dans un champs électrique migre vers
le pole (+) ou (-) selon sa charge.
47
Les protéines sont des molécules amphotères/chargées

48.
Électrophorèse
Techniques de purification des protéines
 Dans un champ électrique constant, les forces qui s'exercent sur l'ion
s'équilibrent :
qE = vf
o Ainsi la vitesse de l'ion est équivalente à : V =
𝒒𝑬
𝒇
o La mobilité Mr d'un ion se définit par:
Mr =pHe – pHi / MM
 Des protéines différentes se déplacent à des vitesses différentes en
raison de de leurs charges (proportionnelle à pHe – pHi) et de leurs
coefficients de friction (inversement proportionnelle à MM).
48

49.
49
Application de l’électrophorèse
Les protéines sont des molécules amphotères/chargées. Deux paramètres sont importants
dans l’électrophorèse et peuvent être utilisés dans les différentes applications de cette
technique :
- Déterminer le degré de pureté d’une protéine : présence ou non d’autres
protéines non désirées
- Déterminer la taille d’une protéine et le nombre de sous unités dans cette
protéine (structure quartenaire).
- Séparer et identifier des protéines par western blott
Techniques de purification des protéines

50.
Supports d’électrophorèse
Techniques de purification des protéines
• papier filtre ou acétate de cellulose
• champ électrique: env. 20 V/cm
• cathode (-): attire les cations (+)
• anode (+): attire les anions (-)
Électrophorèse sur papier
• Dans l'électrophorèse sur papier: Les
molécules sont séparés en fonction de
leurs masses molaires et leurs charges
50

51.
Électrophorèse
Techniques de purification des protéines
 Gels avec pores de dimensions moléculaires de taille variable
• Polyacrylamide: petite taille des pores
• Agarose: grande taille des pores
• La taille des pores varie aussi avec la concentration des gels
Plus la concentration , plus la taille 
 La séparation des molécules repose sur:
• Gel-filtration (grosses molécules ralenties par rapport aux petites)
Électrophorèse sur Gel
51

52.
Électrophorèse
Techniques de purification des protéines
 Les bandes du gel peuvent être détectées par:
• Coloration des protéines par complexation avec un
colorant (bleu de Coomassie)
• Précipitation Ag/Ac (immunoblotting)
• Comptage radioactif
Appareillage et détection des protéines en électrophorèse:
Tampon
Petit
fragment
Grand
fragment
Cuve
Puits protéines
Electrophorèse verticale
52

53.
• PAGE en conditions non dénaturante: séparation des
protéines natives (non dénaturées) en fonction de leur
charge nette et de leur PM.
• PAGE en conditions dénaturante ou réductrice (PAGE-
SDS/β mercaptoéthanol):
o le SDS (sodium dodécyl sulfate) : c’est un composé
capable de venir se fixer sur la périphérie des chaines de
protéines tout en leur conférant une charge négative.
Ainsi les protéines recouvertes par le SDS auront donc
toutes une charge négative. Influencées ainsi par le SDS,
elles migreront donc toutes vers l’anode (+): la charge
réelle des protéines n’est donc plus mise en jeu et donc
seule leur masse moléculaire influencera leur migration.
o le β mercaptoéthanol : composé qui exerce une action
dénaturante sur les protéines oligomériques en rompant
les ponts disulfures ce qui désorganise leur structure
tridimensionnelle. Les sous unités des protéines sont
Électrophorèse
Techniques de purification des protéines
PAGE native et PAGE -SDS dénaturante
53

54.
54
Application de l’électrophorèse
Les conditions dénaturantes : SDS-PAGE sont les plus utilisées en particulier pour :
- Déterminer la taille dune protéine et le nombre de sous unités dans cette protéine
(structure quartenaire). On utilise des marqueurs de poids
- Séparer et identifier des protéines par western blott
Techniques de purification des protéines

55.
55
Application de l’électrophorèse
Détermination du PM d’une protéine inconnue et le nombre de sous unités dans cette
protéine (structure quartenaire). On utilise des marqueurs de poids

56.
56
Application de l’électrophorèse
Détermination du PM d’une protéine inconnue et le nombre de sous unités dans cette
protéine (structure quartenaire). On utilise des marqueurs de poids
P + SDS et ans mercapto
P + SDS et mercapto

57.
57
L’électrophorèse dans un gel d’acrylamide en milieu SDS d’un mélange protéique (puits 1) et une protéine tétramérique
Px (puits 2) donne le profil suivant :
Définir brièvement le rôle de l’acrylamide et du SDS.
Déterminer le poids moléculaire de la protéine PX dans le puits 2..
Comment pouvez vous expliquer la présence d’une seule bande pour P2 dans le profil electrophorétique
ci-dessus.
Proposer une action pour éclaircir cette situation.

58.
Électrophorèse
Techniques de purification des protéines
• Repose sur les différences de pI entre protéines.
o Une première électrophorèse est effectuée avec une solution de molécules
amphotères à travers un gel. La migration de ces molécules dans un champ
électrique crée un gradient de pH au niveau du gel. Les molécules
amphotères vont se répartir en fonction de leurs pI:
o les plus acides se rassemblent vers l'anode (+)
o les plus basiques se positionnent vers le cathode (-)
o Ainsi, le pH  de l'anode vers le cathode.
o La solution de protéines est ensuite déposée sur le gel pour effectuer une
seconde électrophorèse. Les protéines se déplacent dans le gradient de pH
du gel, jusqu'à ce qu'elles arrivent à une zone correspondant à leur pI
respectif.
o À ce pI, les protéines n'auront plus de charge nette, elles vont donc
arrêter de migrer.
o Chaque protéine se trouve donc concentrée sous forme d'une bande
étroite autour de son point isoélectrique à ± 0.01 unités de pH.
Focalisation isoélectrique ou Isoélectrophorèse
58

59.
Électrophorèse
Techniques de purification des protéines
 Électrophorèse en gel:
• Migration des molécules dans un champ électrique
• Les grosses molécules sont ralenties par rapport aux petites
 Différents types d’électrophorèse :
• Milieu non dénaturant : PAGE-natif (polyacrylamide gel electrophoresis)
• La migration se fera selon la taille et la charge.
• Milieu dénaturant : PAGE – SDS : La migration se fera selon la taille seule.
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60.
Électrophorèse
Techniques de purification des protéines
Électrophorèse en 2D
Complexes protéiques séparés selon le pHi et le PM. En 2 Etapes :
1D : Electrophorèse PAGE ou IEF => Séparation par charge ou PHi
2D : Electrophorèse SDS => Séparation par PM
Protéines
Point
isoélectrique
PHi
pHi décroissant
1ère
dimension
PM
décroissant
2ème
dimension
+
-
-
pH =9 pH =3
60

61.
61
Les techniques de révélation des PAGE
Détermination de la séquence des protéines
-Révélation au bleu de coomassie
-révélation par l'activité (natif-PAGE)
-révélation au nitrate d'argent
-révélation avec des anticorps (western-blot)

62.
Western Blot
• Les anticorps ne vont pas se diffuser librement dans le gel. Par conséquent on
fait sortir les protéines du gel et on les fixe sur une feuille de nitrocellulose ou de
polyVinyldene Fluoride (PVDF).
cathode
- - - -
Papier imbibée de tampon
PAGE
proteines
PVDF ou nitrocellulose
Papier imbibée de tampon
+ + + +
anode
• Si les protéines sont en SDS, elle sont chargées négativement, elles vont migrer
vers l'anode et se fixer sur la membrane de nitrocellulose ou de PVDF.
• Si gel natif, on travaille à pH basique, (protéines chargées négativement)
Détermination de la séquence des protéines

63.
révélation des western blot
(similaire à ELISA)
1°) On sature la membrane avec des protéines (lait en poudre). Pour éviter que les
anticorps se fixe non spécifiquement sur la membrane.
2°) On incube la membrane avec les anticorps spécifique
3) On incube la membrane avec les anticorps anti anticorps (anticorps secondaires)
qui sont couplés avec une enzyme (alcaline phosphatase ou peroxidase)
4°) on révèle la membrane pour localiser les protéines reconnues par l'anticorps
protéine
membrane
Attention, il faut que l'anticorps
reconnaisse la protéine sous
une forme dénaturée (SDS)
Western Blot
Détermination de la séquence des protéines

64.
64
Enzyme Acide aminé Site de coupure
Trypsine Arg/Lys C-ter
Chymotrypsine Phe/Trp/Tyr C-ter
Protéase V8 Asp/Glu C-ter
Pepsine Phe/Trp/Tyr N-ter
Thermolysine Leu/Ile/Trp/Tyr/ Val/Ala/Phe N-ter
Carboxypeptidase A Tous les a.a. en C-ter., sauf Pro, Arg/Lys - Libère l’acide aminé C-ter
- Ne coupe pas si Pro est
l’avant dernier acide aminé.
Carboxypeptidase B Seulement Arg/Lys quant C-ter.
• HCl 6M à 105°C pendant 24H : hydrolyse totale des liaisons peptidiques : permet de
connaître la composition en acides aminés. Les traitements enzymatiques par des
peptidases (hydrolysent les liaisons peptidiques) est plus doux.
• Basé sur la propriété de réactifs chimiques/enzymes de couper le lien peptidique à un
endroit très précis;
NOTE: Trypsine, Chymotrypsine, protéase V8, pepsine et thermolysine ne COUPENT PAS si Pro
fait partie du lien peptidique.
Outils enzymatiques
Détermination de la séquence des protéines

65.
65
Identifier le résidu N-terminal. La protéine est traitée avec du 1- fluoro-2,4-dinitrobenzène
(FDNB) dans des conditions alkalines pour produire une protéine dont le résidu N-terminal est
modifié. L’hydrolyse en milieu acide produit les acides aminés libres et l’aminoacide DNP. Cet
aminoacide marqué est identifié par chromatographie.
Une procédure basée sur la même stratégie de marquage du résidu N-terminal utilise le chlorure
de dansyl (1-diméthyl-amino-naphtalène-5- sulfonyl chlorure).
Méthode de Sanger
Détermination de la séquence des protéines

66.
• Basé sur l’utilisation du phényl isothiocyanate (PTC; réactif d’Edman);
• Le PTC réagit avec et marque l’acide aminé en N-terminal du peptide;
• L’acide aminé marqué au PTC est libéré du peptide et identifié par chromatographie;
• Plusieurs cycles de marquage et libération permettent de déterminer la séquence du.
Méthode ou dégradation d’Edman
Détermination de la séquence des protéines

67.
67
Centrifugeuses: types et caractéristiques
Les centrifugeuses peuvent être subdivisées en deux grands groups: les centrifugeuses de
paillasse et les centrifugeuses de sol.
• Les centrifugeuses de paillasse petites (petits, moyens volumes) basse et moyenne
vitesse. Elle peuvent ou pas être réfrigéré ;
• Les centrifugeuses de sol grandes (moyens et grands volumes) basse, moyenne et haute
vitesse, réfrigérés. Les ultracentrifugeuses (vitesse supérieure à 100000g) sont équipées
de pompes à vide
La centrifugation
Techniques d’analyse des Biomolécules

68.
68
La spectrométrie de masse
Techniques d’analyse des Biomolécules
• Technique à la mode très puissante, permettant d’identifier et de séquencer les
protéines;
• Les protéines sont vaporisées en fragments ionisés à l’aide d’un rayon laser ;
• Même des protéines coupées d’une gel PAGE-SDS peuvent être utilisées!!!
• Les fragments sont séparés et leur masse moléculaire déterminée ;
• À partir de la masse moléculaire, le peptide peut être identifié ;

69.
69
• Détermination de la structure d’une protéine. La position précise de chaque atome
d’une molécule peut être déterminée seulement si la molécule est cristallisée.
• Lorsque les rayons X frappent une molécule cristallisée, les électrons entourant
chaque atome courbent ou diffractent le faisceau rayon X; ce phénomène permet
de déduire un modèle de diffraction.
• Un ordinateur interprété alors mathématiquement ce modèle et reconstruit la position des
atomes pour finalement donner un modèle quasi exact de la structure de la mol écule.
La cristallographie au rayon X
Techniques d’analyse des Biomolécules
Synchrotron ESRF
Le site de Grenoble (cristallographie en Europe)

70.
• Les noyaux des éléments peuvent être divisés en deux catégories: d’une part qui
possèdent un spin et d’autre part ceux qui n’en possèdent pas;
• Les noyaux 1H, 13C, 19F et de beaucoup d’atomes possèdent un spin parce qu’ils
portent une charge +, ils se comportent donc comme de petits barreaux aimantés
Le principe de l’RMN
La résonance magnétique nucléaire RMN
Techniques d’analyse des Biomolécules
Comment ça marche
• Un échantillon est placé dans un tube de verre entre les 2 pôles d’un puissant
aimant.
• L’échantillon est exposé à une radiofréquence constante dans un champ
magnétique d’intensité variable.
• Lorsque le champ magnétique atteint une intensité spécifique, certains noyaux
absorbent de l’énergie et la résonance se manifeste.
• Cette absorption induit un très faible courant électrique, qui circule dans la
bobine réceptrice entourant l’échantillon et un pic apparaît.

71.
• L’appareil envoie sur l’échantillon une radiofréquence de très courte durée (~ 10-5 s).
• Cette impulsion rf excite tous les noyaux en même temps.
• Un ordinateur procède ensuite à un calcul mathématique appelé transformation de
Fourier et un spectre RMN est produit.
Comment ça marche (suite)
La résonance magnétique nucléaire RMN
Techniques d’analyse des Biomolécules
Exemple : les spectres d’une protéine de 150 aa.
L’appareil RMN
Spectre 1D
Spectre 2D

72.
72
La bioinformatique: Traitement des informations biologiques par des méthodes
informatiques et/ou mathématiques.
interdisciplinaire par nature, la bioinformatique est fondée sur les acquis de la
biologie, des mathématiques et de l'informatique. En cela, elle constitue une
branche nouvelle de la biologie : c'est l'approche in silico, qui vient compléter les
approches classiques in situ (dans le milieu naturel), in vivo (dans l'organisme
vivant) et in vitro (en éprouvette) de la biologie traditionnelle.
Analyses de données de la biologie fonctionnelle (structures, fonctions, localisations,
et interactions entre les biomolécules). Archivage des données et utilisation des
banques de données et des logiciels, qui permettent de traiter de manière puissante
les données biologiques générées par l’émergence de nouvelles biotechnologies
(bases de données, logiciels de traitement de séquence, outils de prédiction, logiciels
statistiques).
Définition
La bioinformatique
Techniques d’analyse des Biomolécules
Utilisation

73.
73
Requête de BLAST sur Internet : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
séquence requête
choix de la base de données
Exemple logiciel de recherche de similarité entre les séquences BLAST
La bioinformatique
Techniques d’analyse des Biomolécules

74.
74
Exemple logiciel de recherche de similarité entre les séquences BLAST
La bioinformatique
Techniques d’analyse des Biomolécules
Résultats de BLAST sur Internet : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
Fenêtre 1 Fenêtre 3
Fenêtre 2 Fenêtre 4

75.
1 - Quel est le type de chromatographie utilisé ? Expliquer le principe en une demi-page.
2 - Commenter le gel SDS-PAGE. Déterminer la masse moléculaire de la protéine éluée.
La figure représente un gel SDS-PAGE coloré par le bleu
de Coomassie, où l'on a séparé les échantillons suivants:
1 - Lysat brut de bactéries transfectées par le plasmide
pET-15 contenant un insert d'ADNc
2 - Protéines non retenues sur la colonne
3 - Lavage
4 - Protéine éluée
Techniques de purification des protéines
Entrainement: L'expression d'une protéine dans une bactérie (Escherichia coli le plus
souvent) permet l'obtention d'un taux élevé de protéines pures. Le plasmide pET-15 de la
société Novagen permet l'expression inductible de protéines recombinantes porteuses d'une
extension N-terminale de 6 résidus histidine (His).
Cette séquence poly-His est capable de se lier à des ions nickel divalents (Ni2+) immobilisés sur
un gel de cellulose ou d'agarose. Un extrait bactérien brut, après induction de l'expression de
la protéine recombinante, peut être chargé directement sur une colonne contenant ce type de
résine, et après une étape de lavage, la protéine retenue peut être éluée par de l'imidazole.
Cette résine peut être régénérée et réutilisée.
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76.
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