ENZIMAS
Las enzimas son proteínas   Catalizan reacciones químicas necesarias    para la sobrevivencia celular   Sin las enzimas ...
La enzima disminuye la energía deactivación                             Sin enzima                             Con enzima ...
Enzima - Catalizador   Tanto la enzima como el catalizador    aceleran la velocidad de una reacción    química.   Una en...
   Las enzimas se unen a los reactivos    (sustratos) reduciendo la energía de    activación   Cada enzima tiene una for...
Las enzimas cumplen su papel catalítico gracias a:• Fijación estereoquímicamente complementaria  del substrato• Transforma...
Los siguientes hechos: Especificidad de la reacción enzimática Carácter heterogéneo de la catálisis enzimáticaNos llevan...
Enzima                Sustrato Sitio activo
La unión del sustrato es muy             específica   Complementariedad geométrica   Complementariedad     de   cargas, ...
Teorías de la acción enzimática, 1Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)Substrato y enzima se acoplan de forma estereo...
Teorías de la acción enzimática, 2Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)Tanto la enzima como el substrato sufren unaalteraci...
Teorías de la acción enzimática, 3Estabilización del Estado de TransiciónLa teoría del Ajuste Inducido se amplía en la act...
Una enzima puede unir dos sustratos         en su sitio activo
Clasificación ynomenclatura de enzimas
Clasificación y nomenclaturaNombre sistemático:     Grupo transferido   ATP: hexosa fosfotransferasaDonador   Aceptor     ...
Clasificación y nomenclaturaClasificación de enzimas por Grupos    EC 1.x ⇒ Oxidorreductasas    EC 2.x ⇒ Transferasas    E...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 1: Oxidorreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción, en que átomos de oxigeno ó ...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 1: Oxidorreductasas     Nombre: Dador:Aceptor oxidorreductasa   β-D-Glucosa : O2 1-oxido...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 1: Oxidorreductasas  Nomenclatura del subgrupo en oxidorreductasas:                     ...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 2: Transferasas  Catalizan reacciones de transferencia de átomos ó  grupo de átomos entr...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 2: Transferasas Clasificación de subgrupo de las transferasas:               EC 2.1.x   ...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 3: Hidrolasas Catalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Son las más comun...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 3: HidrolasasClasificación de las hidrolasas:  3.1.-.-   Esterasas (carboxilesterasas, f...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 3: HidrolasasCaso particular ⇒ Péptido hidrolasas: clasificación común (no              ...
Clasificación y nomenclatura Grupo 4: Liasas     Catalizan reacciones reversibles de remoción de grupo de     átomos del s...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 4: LiasasClasificación de las liasas:     4.1.x - Actúan sobre enlaces C-C     4.2.x - A...
Clasificación y nomenclatura Grupo 5: Isomerasas       Catalizan reacciones de isomerización moleculares                 A...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 5: IsomerasasClasificación de las isomerasas:         5.1.x - Rasemasas y Epimerasas    ...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 6: Ligasas    Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensas    de la hidrólisis d...
Clasificación y nomenclaturaGrupo 6: LigasasClasificación de las ligasas:          6.1.x   - Forman enlaces C-O          6...
Cinética Enzimática
Cinética Enzimática La cinética enzimática es el análisis cuantitativo del efecto de  cada uno de los factores que interv...
   Ella está basada en la medición de la velocidad de reacción. Así en la reacción:                                      ...
Bajaconcentraciónde sustratoALTAconcentraciónde sustratoSATURACION
. . .            Efecto de la concentración de substratov                    . .             .        .    .              ...
Concepto de velocidad inicial              d[P][ ]       v = dt , t   0                                      p            ...
Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante: Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar substrato;...
El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinámicadel sistema                 k+1               k+2  E+S     ...
Hipótesis de Michaelis - Menten                   k+1              k+2    E+S                    ES               E+P     ...
Hipótesis deMichaelis-Menten                               [ E ][ S ] e s ( e 0 − x ) s                          Km =     ...
Hipótesis de estado estacionarioSegún veíamos en la simulación numérica, hay un tiemporelativamente prolongado en el curso...
dx   = 0 = k +1e s − (k                     −1   + k   +2   )xdtk +1e s = k             +1   (e   0   − x )s = (k         ...
A partir de las suposiciones de Michaelis-Menten y      Estado estacionario, llegamos a la ecuación                       ...
Significado de la constante Km   1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES      (en condiciones de equilib...
Significado de la constante Vmax = k+2 e01. Velocidad asintótica para s2. Directamente proporcional a la concentración de ...
Relación entre Km y Vmax                                             Michaelis y Menten  Velocidad de la reacción (v)   Vm...
Vmax     Velocidad de la reacción (v)                                    Vmax/2                                           ...
Representación directav    100                                                                               Vmax    80   ...
Representación Lineweaver-Burke  1/Vmax                      1   Km 1   1-1/Km                   =    ⋅ +                 ...
Representación Hanes                   x                 ma           1/V                       s   1        K m          ...
Representación de Eadie-Hofstee   Vmax                                     v                       v = −K   m   ⋅ +V   m x...
Métodos de linealización para determinación          parámetros cinéticosMétodo        Eje Y   Eje X   Intercepto   Interc...
Definición Actividad Enzimática   Es el número de moles de sustrato que    reaccionan para formar producto, por mol de   ...
 A fin de normalizar la medición de la actividad, se ocupa el valor de  la velocidad inicial de reacción, donde eses fact...
Cálculo de Actividad Enzimática   La velocidad de reacción catalizada por 0,1ml    de una dilución 1:100 de Fosfatasa Alc...
Número o Índice deRecambio   Es útil definir una constante de velocidad más    general, k cat , para describir la velocid...
Efecto del pH en la ENZIMACada enzima tiene un pH óptimo para su actividadEl pH afecta las interacciones iónicas
Efecto del pH 1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:        - Grupos disociables de la enzima        - Grupo...
En el efecto de la temperatura hay dos componentes:    1. Aceleración de la reacción según la ecuación       de Arrhenius ...
Efecto de la temperatura en la ENZIMA              Aumento de la   Desnaturación                velocidad       por calor ...
ORGANISMOS TERMÓFILOS   Son organismos que viven a altas tº y realizan    sus reacciones enzimáticas a estas altas tº   ...
Coenzimas Las coenzimas son pequeñas moléculas  orgánicas, que se unen a la enzima. Las coenzimas colaboran en la reacci...
El NAD es una coenzima aceptora de H                     Sustrato                     oxidado
Algunas enzimas requieren metalespara mejorar su actividad
Isoenzimas o Isozimas   Son formas moleculares diferentes de una    misma enzima   Catalizan la misma reacción   Ejempl...
 Así esta actividad corresponde al máximo potencial  catalítico que las enzimas poseen para un determinado  conjunto de c...
Inhibición enzimática
Inhibidor:Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través deinteracciones con el centro activo u otros centro...
Inhibición enzimática      isostérica
Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,c...
Inhibición reversible(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,    impidiendo la fijación del substrato...
Inhibición Competitiva
Inhibidores Competitivos Compiten    con el sustrato por el sitio  activo de la enzima Se une solo a la enzima libreV  ...
Inhibición competitivaAl aumentar la cantidadde      SUSTRATO       elinhibidor competitivo esdesplazado y se formaproducto
S       E             ES         E+PI                Se define una constante de            [E] [I]                equilibr...
En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentracióndel complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemo...
Por tanto, en la inhibición competitiva,  1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la     Km, que apa...
Sin inhibidor                       Con inhibidor                        El inhibidor competitivo                        a...
Inhibición competitiva - Representación recíproca doble                         0.07                 1/v                  ...
Ejemplo Inhibidor Competitivo Ácidosuccínico + FAD == ácido fumárico + FADH2 El inhibidor competitivo es el ácido  malón...
Ácido Fólico y Sulfanilamida La sulfanilamida es un análogo estructural  del ácido p - aminobenzoico (PABA) PABA es el p...
Metotrexato y Dihidrofolato El ácido fólico en sus formas de dihidro y  tetrahidrofolato es coenzima de la reacción  cata...
Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato                            No se forma producto
Inhibición No Competitiva
Inhibidor No Competitivo Se  une a un lugar diferente del sitio  activo la enzima Se une a la enzima libre y también al ...
Inhibición NO competitiva
Inhibidor NO competitivoEl inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un             sitio diferente del sitio activo
S           E              ES         E+P      I               I           Inhibición                S               No Co...
Inhibición Anticompetitiva      o Incompetitiva
Inhibidor IncompetitivoEn este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centroactivo pero solo después de que el sustr...
Inhibidor Incompetitivo Se  une a un lugar diferente del sitio  activo de la enzima Se une sólo al complejo enzima-sustr...
SE           ES       E+P        I                      Inhibición                    Anticompetitiva            ESIEl inh...
Determinación de parámetros cinéticos de                   inhibiciónModelo                 Kap             VapInh comp   ...
Inhibición Irreversible  - Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo    químico de la enzima, modificándola co...
Inhibidores Irreversibles Producen   inactivación permanente de la  actividad enzimática Se interfiere con el normal des...
Algunos tipos de inhibidores irreversibles        1. Reactivos de grupos -SH        2. Organofosfóricos        3. Ligandos...
Inhibición enzimática      alosterica
Enzimas Alostéricas   Son enzimas cuya estructura proteica está formada    de varias subunidades   No se rigen por la ci...
Enzimas alostéricas   Las enzimas alostéricas    presentan        estructura    cuaternaria.   Tienen diferentes sitios ...
Concepto de Cooperatividad La unión de los sustratos al sitio activo de  una subunidad produce un cambio  conformacional ...
Moduladores Alostéricos También   reciben el nombre de efectores  y pueden ser positivos o negativos Se unen al sitio al...
Aspartato Transcarbamilasa Ác  L-asp + Carbamil-P === Carbamil-  asp + Pi . Primera reacción en la síntesis  de pirimidin...
RESUMEN Las  enzimas son proteínas que catalizan  las reacciones biológicas Presentan especificidad por su sustrato Cad...
RESUMEN La    actividad enzimática puede ser  inhibida, por inhibidores competitivos  (similares al sustrato) o por inhib...
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    1. 1. ENZIMAS
    2. 2. Las enzimas son proteínas Catalizan reacciones químicas necesarias para la sobrevivencia celular Sin las enzimas los procesos biológicos serían tan lentos que las células no podrían existir. Las enzimas pueden actuar dentro de la célula , fuera de ésta, y en el tubo de ensayo. E + S ES EP  E + P E E E E
    3. 3. La enzima disminuye la energía deactivación Sin enzima Con enzima • La Ea de la hidrólisis de la urea baja de 30 a 11 kcal/mol con la E+S acción de las enzimas, acelerando la reacción 1014 x • El aumento de temperatura necesario para producir la reacción E+P no catalizada seria de 529ºC Tiempo de la reacción
    4. 4. Enzima - Catalizador Tanto la enzima como el catalizador aceleran la velocidad de una reacción química. Una enzima puede transformar 1000 moléculas de sustrato/ segundo Las enzimas tienen 3 propiedades que los catalizadores NO tienen • Especificidad por el sustrato • Se inactivan por desnaturación • Pueden ser reguladas
    5. 5.  Las enzimas se unen a los reactivos (sustratos) reduciendo la energía de activación Cada enzima tiene una forma única con un sitio o centro activo en el que se une al sustrato Después de la reacción, enzimas y productos se separan. Las moléculas enzimáticas no han cambiado después de participar en la reacción
    6. 6. Las enzimas cumplen su papel catalítico gracias a:• Fijación estereoquímicamente complementaria del substrato• Transformación catalítica del mismoEn ambas funciones participan:• Cadenas laterales de los aminoácidos• Grupos o moléculas no proteicas:  Grupos prostéticos  Iones metálicos  Cofactores
    7. 7. Los siguientes hechos: Especificidad de la reacción enzimática Carácter heterogéneo de la catálisis enzimáticaNos llevan a postular la existencia de un CentroActivo en la molécula de enzima, capaz de: Fijar específicamente al substrato Transformarlo catalíticamente.
    8. 8. Enzima Sustrato Sitio activo
    9. 9. La unión del sustrato es muy específica Complementariedad geométrica Complementariedad de cargas, uniones iónicas Modelos:  Encaje inducido  Llave – cerradura.  Estado de transición
    10. 10. Teorías de la acción enzimática, 1Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,de la misma manera que una llave se ajusta a sucerradura.Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy seconsidera insuficiente al no explicar algunos fenómenosde la inhibición enzimática
    11. 11. Teorías de la acción enzimática, 2Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)Tanto la enzima como el substrato sufren unaalteración en su estructura por el hecho físico de launión.Está mucho más de acuerdo con todos los datosexperimentales conocidos hasta el momento.
    12. 12. Teorías de la acción enzimática, 3Estabilización del Estado de TransiciónLa teoría del Ajuste Inducido se amplía en la actualidaddefiniendo la acción enzimática comoSegún lo cual, el Centro Activo enzimático es en realidadcomplementario no al substrato o al producto, sino alestado de transición entre ambos.
    13. 13. Una enzima puede unir dos sustratos en su sitio activo
    14. 14. Clasificación ynomenclatura de enzimas
    15. 15. Clasificación y nomenclaturaNombre sistemático: Grupo transferido ATP: hexosa fosfotransferasaDonador Aceptor Tipo de reacción catalizada Grupos Número Enzyme Commission: químicos Enzyme EC 2.7.1.1 Enzimas Comission Subgrupo Grupo Nombre común (sustrato+”asa”): Hexokinasa
    16. 16. Clasificación y nomenclaturaClasificación de enzimas por Grupos EC 1.x ⇒ Oxidorreductasas EC 2.x ⇒ Transferasas EC 3.x ⇒ Hidrolasas EC 4.x ⇒ Liasas EC 5.x ⇒ Isomerasas EC 6.x ⇒ Ligasas
    17. 17. Clasificación y nomenclaturaGrupo 1: Oxidorreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción, en que átomos de oxigeno ó hidrogeno son trasladados entre moléculas: Ared + Box Aox + Bred AH2 + B A + BH2 En las reacciones redox, siempre tienen que estar presentes a la vez el aceptor y el dador electrónico.
    18. 18. Clasificación y nomenclaturaGrupo 1: Oxidorreductasas Nombre: Dador:Aceptor oxidorreductasa β-D-Glucosa : O2 1-oxidorreductasa EC 1.1.3.4 Dador Aceptor Nombre común: Glucosa oxidasa
    19. 19. Clasificación y nomenclaturaGrupo 1: Oxidorreductasas Nomenclatura del subgrupo en oxidorreductasas: EC 1.1.x - Deshidrogenasas EC 1.2.x - Oxidasas EC 1.3.x - Peroxidasas EC 1.4.x - Oxigenasas EC 1.5.x - Hidroxilasas EC 1.6.x - Reductasas etc.Aplicaciones: Ensayos de diagnostico clínico (glucosa oxidasa y colesterol oxidasa Deslignificación ó Bioblanqueamiento
    20. 20. Clasificación y nomenclaturaGrupo 2: Transferasas Catalizan reacciones de transferencia de átomos ó grupo de átomos entre moléculas: A-X + B A + B-X Dador: Aceptor Grupo transferido - transferasa ATP: D-Hexosa Fosfotransferasa EC 2.7.1.1 Nombre común: hexokinasa
    21. 21. Clasificación y nomenclaturaGrupo 2: Transferasas Clasificación de subgrupo de las transferasas: EC 2.1.x - Grupos monocarbonados EC 2.2.x - Grupos aldehido o ceto EC 2.3.x - Aciltransferasas EC 2.4.x - Glicosiltransferasas EC 2.5.x - Alquil- o Ariltransferasas EC 2.6.x - Grupos nitrogenados EC 2.7.x - Grupos fosfato EC 2.8.x - Grupos sulfato EC 2.9.x - Grupos selenio Aplicaciones: Síntesis de oligosacáridos
    22. 22. Clasificación y nomenclaturaGrupo 3: Hidrolasas Catalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Son las más comunes en el dominio de la tecnología enzimática: A-B + H2O A-OH + H-B No se suelen utilizar nombres sistemáticos en las hidrolasas. Muchas de ellas conservan el nombre Primitivo. Ejemplo: Quimosina EC 3.4.23.4.
    23. 23. Clasificación y nomenclaturaGrupo 3: HidrolasasClasificación de las hidrolasas: 3.1.-.- Esterasas (carboxilesterasas, fosfoesterasas, sulfoesterasas) 3.2.-.- Glicosidasas 3.3.-.- Éter hidrolasas 3.4.-.- Péptido hidrolasas 3.5.-.- Acil anhídrido hidrolasas etc.Aplicaciones: Lipasas → Síntesis de tensioactivos Proteasas → Fabrico de quesos Glicosidasas → Clarificación de jugos; liberación de aromas en los vinos; aplicaciones textiles
    24. 24. Clasificación y nomenclaturaGrupo 3: HidrolasasCaso particular ⇒ Péptido hidrolasas: clasificación común (no sistemática) I. Según la situación del enlace atacado: - Exopeptidasas (extremos de la cadena) (Peptidasas) - Endopeptidasas (interior de la cadena) (Proteinasas) II. Según el mecanismo catalítico: - Serin proteinasas - Tiol proteinasas - Aspartil proteinasas - Metaloproteinasas
    25. 25. Clasificación y nomenclatura Grupo 4: Liasas Catalizan reacciones reversibles de remoción de grupo de átomos del sustrato (este grupo no incluye las hidrolasas): A-B A+BEjemploNombre sistemático: Histidina amonio-liasa (EC 4.3.1.3)Nombre común: Histidasa
    26. 26. Clasificación y nomenclaturaGrupo 4: LiasasClasificación de las liasas: 4.1.x - Actúan sobre enlaces C-C 4.2.x - Actúan sobre enlaces C-O 4.3.x - Actúan sobre enlaces C-N 4.4.x - Actúan sobre enlaces C-S 4.5.x - Actúan sobre enlaces C-Haluro (S-, Cl-, Br-, I- At-) 4.6.x - Actúan sobre enlaces P-O 4.99.x - Otras liasesAplicaciones: Pectato liasa – Remueve los compuestos indeseables (ceras,pectinas, proteínas) en fibras en la industria textil – “bioscouring”
    27. 27. Clasificación y nomenclatura Grupo 5: Isomerasas Catalizan reacciones de isomerización moleculares A BEjemplo:Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5)
    28. 28. Clasificación y nomenclaturaGrupo 5: IsomerasasClasificación de las isomerasas: 5.1.x - Rasemasas y Epimerasas 5.2.x - cis-Trans-Isomerasas 5.3.x - Oxidoreductasas Intramolecular 5.4.x - Transferasas Intramoleculares (mutases) 5.5.x - Liasas Intramoleculares 5.99.x - Otras Isomerasas
    29. 29. Clasificación y nomenclaturaGrupo 6: Ligasas Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensas de la hidrólisis de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.). A + B + ATP A-B + ADP + PiEjemplo: Glutationa sintasa (EC 6.2.2.3)Nombre sistémico:G-L-glutamilo-L-cisteina:glicina ligase
    30. 30. Clasificación y nomenclaturaGrupo 6: LigasasClasificación de las ligasas: 6.1.x - Forman enlaces C-O 6.2.x - Forman enlaces C-S 6.3.x - Forman enlaces C-N 6.4.x - Forman enlaces C-C 6.5.x - Forman enlaces ésteres fosfóricos 6.6.x - Actúan sobre enlaces N-metal
    31. 31. Cinética Enzimática
    32. 32. Cinética Enzimática La cinética enzimática es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la actividad enzimática, que se evalúa a través de la velocidad de la reacción catalizada. Las variables más importantes son: • Concentración de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o activadores) • pH • Temperatura
    33. 33.  Ella está basada en la medición de la velocidad de reacción. Así en la reacción: E S P Se tendrá: dp ds v= =− dt dt Como se observa en la figura, la velocidad de reacción (pendiente) disminuye continuamente a partir de un valor máximo inicial. Esto se puede deber a:  Desaturación de la enzima con sustrato, por disminución de la concentración del sustrato  Inactivación de la enzima por su inherente inestabilidad  Inhibición por el producto  Desplazamiento del equilibrio, si la reacción es reversible
    34. 34. Bajaconcentraciónde sustratoALTAconcentraciónde sustratoSATURACION
    35. 35. . . . Efecto de la concentración de substratov . . . . . [s]
    36. 36. Concepto de velocidad inicial d[P][ ] v = dt , t 0 p s t
    37. 37. Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante: Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar substrato; una vez que están ocupados todos, por mucho que aumente la concentración de substrato, la velocidad permanecerá constante tendiendo a un valor asintótico k+1 k+2 E+S ES E+P k-1
    38. 38. El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinámicadel sistema k+1 k+2 E+S ES E+P k-1Sistema No admite solución analítica. - Simulaciones numéricas - Hipótesis que lo simplifiquen
    39. 39. Hipótesis de Michaelis - Menten k+1 k+2 E+S ES E+P k-1- La primera parte del mecanismo, k+1 E+S ES k-1 Tiene lugar mucho más rápidamente que la segunda: k+2 ES E+P
    40. 40. Hipótesis deMichaelis-Menten [ E ][ S ] e s ( e 0 − x ) s Km = = =Equilibrio rápido [E S ] x x e0sx = K m + s V m ax s v = k x v = K m + s +2 k +2 e 0 sv = K m + s k +2 e 0 = V m ax
    41. 41. Hipótesis de estado estacionarioSegún veíamos en la simulación numérica, hay un tiemporelativamente prolongado en el curso de la reacción en elque la variación de complejo [ES] es prácticamente iguala cero: dx/dt = k+1es - (k-1 + k+2) x = 0A partir de esta expresión podemos llegar a obtener unaexpresión que nos da la velocidad para la concentraciónde substrato
    42. 42. dx = 0 = k +1e s − (k −1 + k +2 )xdtk +1e s = k +1 (e 0 − x )s = (k −1 + k +2 )x e0s e0sx = + k +2 = V m ax s k −1 + s Km + s v = k +1 Km + s v = k +2 x Hipótesis de estado estacionario k +2 e 0 = V m ax
    43. 43. A partir de las suposiciones de Michaelis-Menten y Estado estacionario, llegamos a la ecuación Vmax * s v= Km + sLa única diferencia radica en el significado de Km: Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M. Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.
    44. 44. Significado de la constante Km 1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES (en condiciones de equilibrio rápido) 2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato (en condiciones de equilibrio rápido) 3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido) 4. Concentración de substrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad de la máxima (s0.5) 5. Se define para una pareja enzima-substrato 6. Se mide en unidades de concentración
    45. 45. Significado de la constante Vmax = k+2 e01. Velocidad asintótica para s2. Directamente proporcional a la concentración de enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k+2)3. Mide función de transformación catalítica4. Se expresa en unidades de velocidad
    46. 46. Relación entre Km y Vmax Michaelis y Menten Velocidad de la reacción (v) Vmax Vmax/2 Km Concentración de Sustrato [S]La Km es la concentración de sustratodonde se obtiene la mitad de la Vmax
    47. 47. Vmax Velocidad de la reacción (v) Vmax/2 Km Concentración de Sustrato [S]A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustratoA menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato
    48. 48. Representación directav 100 Vmax 80 60 V s v = m x 40 K m + s 20 s 0 0 20 40 60 80 100 Km
    49. 49. Representación Lineweaver-Burke 1/Vmax 1 Km 1 1-1/Km = ⋅ + v V mx s V mx
    50. 50. Representación Hanes x ma 1/V s 1 K m = ⋅s +-Km v V mx V mx
    51. 51. Representación de Eadie-Hofstee Vmax v v = −K m ⋅ +V m x -K s m
    52. 52. Métodos de linealización para determinación parámetros cinéticosMétodo Eje Y Eje X Intercepto Intercepto Pendiente Eje Y Eje xLineweaver- 1/v 1/s 1/V -1/K K/VBurkeHanes s/v s K/V -K 1/VEadie- v v/s V V/K -KHofstee
    53. 53. Definición Actividad Enzimática Es el número de moles de sustrato que reaccionan para formar producto, por mol de enzima y por unidad de tiempo. Esto supone que la enzima está plenamente saturada con sustrato y por tanto que la reacción se efectúa con su máxima rapidez El índice de recambio muestra la eficiencia impresionante de la catálisis enzimática
    54. 54.  A fin de normalizar la medición de la actividad, se ocupa el valor de la velocidad inicial de reacción, donde eses factores son despreciables. Así,  dp   ds  a = vt →0 =   = −   dt t →0  dt t →0 Esta velocidad inicial no se espera que sea observada en un proceso enzimático donde, debido a los elevados tiempos de operación, es razonable suponer que esos factores ejercerán su influencia.
    55. 55. Cálculo de Actividad Enzimática La velocidad de reacción catalizada por 0,1ml de una dilución 1:100 de Fosfatasa Alcalina es 0,3umoles / min. de producto. ¿Cuál es su actividad enzimática? 0,1ml-------- 0,3umoles producto / min. 1,0ml------------3,0umoles producto / min. dil 1:100------------- 300umoles producto / min. Respuesta: 300U/ml
    56. 56. Número o Índice deRecambio Es útil definir una constante de velocidad más general, k cat , para describir la velocidad limitante de cualquier reacción enzimática a saturación kcat x Et= Vmáx V0 = k cat x Et x [S] / KM + [S]; Kcat es una constante de velocidad de 1er orden con unidades de tiempo-1, también llamada Número de Recambio
    57. 57. Efecto del pH en la ENZIMACada enzima tiene un pH óptimo para su actividadEl pH afecta las interacciones iónicas
    58. 58. Efecto del pH 1. Sobre la fijación del substrato al centro activo: - Grupos disociables de la enzima - Grupos disociables del substrato 2. Sobre la transformación catalítica del substrato 3. Sobre la estructura de la proteína enzimática
    59. 59. En el efecto de la temperatura hay dos componentes: 1. Aceleración de la reacción según la ecuación de Arrhenius k = A exp (-Ea/RT) 2. Desnaturalización térmica de la proteína
    60. 60. Efecto de la temperatura en la ENZIMA Aumento de la Desnaturación velocidad por calor 15º 40º 75º Temperatura Cada enzima tiene una temperatura óptima.
    61. 61. ORGANISMOS TERMÓFILOS Son organismos que viven a altas tº y realizan sus reacciones enzimáticas a estas altas tº Ejemplos son los que viven en las aguas termales Es tema de investigación el aislamiento de las enzimas de estos organismos para desarrollar procesos industriales en condiciones más extremas
    62. 62. Coenzimas Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas, que se unen a la enzima. Las coenzimas colaboran en la reacción enzimática recibiendo transitoriamente algún grupo químico: H+ , OH, CH3 . Laenzima sin la coenzima recibe el nombre de APOENZIMA
    63. 63. El NAD es una coenzima aceptora de H Sustrato oxidado
    64. 64. Algunas enzimas requieren metalespara mejorar su actividad
    65. 65. Isoenzimas o Isozimas Son formas moleculares diferentes de una misma enzima Catalizan la misma reacción Ejemplo: Lactato deshidrogenasa Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH M4, M3H1, M2H2, M1H3 y H4 Se diferencian por su movilidad electroforética Usadas en clínica: sueros normales y sueros con alguna patología
    66. 66.  Así esta actividad corresponde al máximo potencial catalítico que las enzimas poseen para un determinado conjunto de condiciones ambientales. Luego, estas deben ser consideradas en las expresiones matemáticas representativas del proceso enzimático. Existen situaciones (sustratos heterogéneos) donde la velocidad inicial de reacción no es representativa del real potencial catalítico de la enzima. Se asume que la velocidad inicial de reacción es proporcional a la concentración de proteína enzimática.
    67. 67. Inhibición enzimática
    68. 68. Inhibidor:Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través deinteracciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimáticaDe esta forma, habrá dos tipos de inhibidores: I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.
    69. 69. Inhibición enzimática isostérica
    70. 70. Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,con el complejo enzima-substrato o con ambos: E+I EI ES + I ESI 2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima: E+I E’
    71. 71. Inhibición reversible(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva
    72. 72. Inhibición Competitiva
    73. 73. Inhibidores Competitivos Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima Se une solo a la enzima libreV máx no se altera y K M cambia
    74. 74. Inhibición competitivaAl aumentar la cantidadde SUSTRATO elinhibidor competitivo esdesplazado y se formaproducto
    75. 75. S E ES E+PI Se define una constante de [E] [I] equilibrio de disociación del Ki = [EI] EI inhibidor: Características: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato. - El inhibidor es tan específico como el substrato
    76. 76. En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentracióndel complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste-ma de ecuaciones (e0 − x − y )s K m = x De donde (e0 − x − y )i Ki = y V s v = m xQue resuelto para x nos da  i  e0s K m 1 +  + s x =  Ki  i  K m 1 +  + s  Ki
    77. 77. Por tanto, en la inhibición competitiva, 1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.
    78. 78. Sin inhibidor Con inhibidor El inhibidor competitivo aumenta la Km Km Km Sin coninhibidor inhibidor
    79. 79. Inhibición competitiva - Representación recíproca doble 0.07 1/v 0.06 0.05 0.04 0.03 1/Vmax 0.02 -1/Km 0.01 1/s 0.00 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 -1/(Km(1 + i/Ki))
    80. 80. Ejemplo Inhibidor Competitivo Ácidosuccínico + FAD == ácido fumárico + FADH2 El inhibidor competitivo es el ácido malónico Es un análogo estructuralmente parecido al ácido succínico
    81. 81. Ácido Fólico y Sulfanilamida La sulfanilamida es un análogo estructural del ácido p - aminobenzoico (PABA) PABA es el punto de partida para la síntesis de ácido fólico en las bacterias El ácido fólico es una vitamina esencial para la proliferación (división) bacteriana Sulfanilamida se usa en el tratamiento algunas infecciones
    82. 82. Metotrexato y Dihidrofolato El ácido fólico en sus formas de dihidro y tetrahidrofolato es coenzima de la reacción catalizada por la dihidrofolato reductasa Esta reacción es parte del metabolismo de los nucleótidos para la síntesis de DNA Metotrexato se usa en la terapia de algunos cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA
    83. 83. Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato No se forma producto
    84. 84. Inhibición No Competitiva
    85. 85. Inhibidor No Competitivo Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato Por acción del inhibidor disminuye la V m pero el valor de Km no se altera
    86. 86. Inhibición NO competitiva
    87. 87. Inhibidor NO competitivoEl inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un sitio diferente del sitio activo
    88. 88. S E ES E+P I I Inhibición S No Competitiva EI ESIEl inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos
    89. 89. Inhibición Anticompetitiva o Incompetitiva
    90. 90. Inhibidor IncompetitivoEn este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centroactivo pero solo después de que el sustrato lo haya hecho y,por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera,aunque todo el sustrato esté saturando la enzima y toda laenzima esté como complejo ES, el inhibidor puedeenlazarse produciendo un complejo inactivo ESI.Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y, portanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima,disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI noconduce a productos y Vm disminuye.
    91. 91. Inhibidor Incompetitivo Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima Se une sólo al complejo enzima-sustrato Los efectos que tiene: disminuye el valor de Km y también el de Vmáx
    92. 92. SE ES E+P I Inhibición Anticompetitiva ESIEl inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo
    93. 93. Determinación de parámetros cinéticos de inhibiciónModelo Kap VapInh comp Km(1+i/Ki) VmInh no comp total Km Vm/(1+i/Ki)Inh anticomp Km/(1+i/Ki) Vm/(1+i/Ki)
    94. 94. Inhibición Irreversible - Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente - Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki: E+I E’ - A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.
    95. 95. Inhibidores Irreversibles Producen inactivación permanente de la actividad enzimática Se interfiere con el normal desarrollo de una reacción o vía metabólica Ejemplos: p-cloromercuribenzoato, yodoacetato, diisopropilfluorfosfato
    96. 96. Algunos tipos de inhibidores irreversibles 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfóricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados
    97. 97. Inhibición enzimática alosterica
    98. 98. Enzimas Alostéricas Son enzimas cuya estructura proteica está formada de varias subunidades No se rigen por la cinética de M - M Además del sitio o centro activo tienen sitios alostéricos o de regulación Sitio activo/sustratos; Sitio alostérico/moduladores o reguladores La relación entre la velocidad de reacción y la concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea
    99. 99. Enzimas alostéricas Las enzimas alostéricas presentan estructura cuaternaria. Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molécula de sustrato La unión del sustrato es cooperativa la curva de velocidad presenta una forma sigmoidal
    100. 100. Concepto de Cooperatividad La unión de los sustratos al sitio activo de una subunidad produce un cambio conformacional que por contacto físico se transmite a las subunidades vecinas, facilitando las interacciones Modelos de unión: secuencial y concertado Ejemplos: unión Hb-O , enzimas alostéricas y 2 sus sustratos
    101. 101. Moduladores Alostéricos También reciben el nombre de efectores y pueden ser positivos o negativos Se unen al sitio alostérico que puede estar en la misma subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidades regulatorias Su unión produce un cambio conformacional que afecta al sitio activo
    102. 102. Aspartato Transcarbamilasa Ác L-asp + Carbamil-P === Carbamil- asp + Pi . Primera reacción en la síntesis de pirimidinas Efector positivo: CTP Efector negativo: ATP Tiene dos subunidades catalíticas para los sustratos y tres subunidades regulatorias para los efectores
    103. 103. RESUMEN Las enzimas son proteínas que catalizan las reacciones biológicas Presentan especificidad por su sustrato Cada enzima presenta dos parámetros importantes Vmax (saturación de la enzima) y la Km (medida de la afinidad por el sustrato)
    104. 104. RESUMEN La actividad enzimática puede ser inhibida, por inhibidores competitivos (similares al sustrato) o por inhibidores no competitivos. La temperatura y el pH afectan a la enzima en su actividad catalítica. Algunas enzimas requieren de coenzimas y/o cofactores para su actividad.

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