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Informe de Técnica de

Inmunodifusión
Radial (IDR).

por

Miguel Angel Figueroa Núñez
Inmunología Clínica
TM. Marcelo Ramirez Sandoval
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN

2

¿QUÉ ES LA INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA?
¿PRINCIPIO DE LA TECNICA?
SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA
OBJETIVOS

2
2
3
3

MATERIALES Y METODOS

4

MATERIALES UTILIZADOS
METODO OCUPADO
DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO
PROCEDIMIENTOS
CONTROL DE CALIDAD
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
RESUMEN DE LA TECNICA

4
4
4
5
6
7
7

INTERPRETACIÓN

8

RESULTADOS OBTENIDOS
LECTURA DE LOS RESULTADOS
VALORES DE REFERENCIA
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
SIGNIFICADOS CLÍNICOS
DISCUSIÓN Y CONCLUCIÓN
BIBLIOGRAFÍA

1

8
11
12
12
13
13
13
INTRODUCCION
¿QUE ES LA INMUNODIFUSIÓN RADIAL?
Desde hace mucho tiempo que las tecnicas de una seccion de laboratorio no son exclusivas,
y este es el mejor ejemplo de como ocupamos el ingenio para el uso de tecnicas
inmunologicas.
La interacción de antígenos solubles macromoleculas (polivalentes) y anticuerpos
específicos llevan a la formación de complejos variables de Ag o Ac, que frecuentemente
llegan a ser insolubles y precipitan en solución. Este se conoce reacción de precipitación
que es dependiente de la relación de concentración Ag y Ac.

PRINCIPIO DE LA TECN ICA
El procedimiento consiste en una inmunoprecipitación en agarosa entre un Antígeno a
cuantificar y su Anticuerpo homólogo. Se realiza incorporando uno de los 2 reactivos
inmunes (generalmente Anticuerpo) uniformemente en una capa de Agarosa y luego
introduciendo el otro reactivo en pocillos cavados en el gel.
El antígeno difunde radialmente en la mezcla gel-Anticuerpo y se forma un disco o anillo
visible en un punto que depende de la relación estequiométrica antígeno-anticuerpo. A
medida que más antígeno difunde, el anillo se redisuelve y reaparece en una distancia
mayor del pocillo. Este aumento en el diámetro de precipitación continúa hasta que
Antígeno y Anticuerpo reacciona completamente.
Mientras que el precipitado se está expandiendo (16 – 20 horas) la relación entre el
diámetro del anillo y el logaritmo de la concentración de antígeno es aproximadamente
lineal.
Al completarse la reacción, la relación entre el diámetro al cuadrado y la concentración es
lineal.

2
SU UTILIDAD EN LA IN MUNOLOGÍA CLÍNICA
La detección de autoanticuerpos en
autoinmunes como:








el diagnóstico de diferentes enfermedades

Lupus Eritematoso Sistémico.
Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo.
Síndrome de Sjogren.
Esclerosis Sistemática Progresiva.
Síndrome de CREST.
Cirrosis Biliar Primaria.
Artritis Reumatoide

OBJETIVOS




3

Cuantificar las inmunoglobulinas (IGG, IGA, IGM) y Complemento (C3 y C4)
mediante la técnica de inmunodifusión radial.
Identificar los requerimientos técnicos que debemos considerar al realizar esta
técnica
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES UTILIZADO S
INSUMOS












Placas IDR anti-IGG
Placas IDR anti-IGM
Placas IDR anti-IGA
Placas IDR anti-complemento C3
Placas IDR anti-complemento C4
Micropipeta de 10uL-100uL
Micropipeta de 1 a 10 uL
Puntas desechables amarillas 10 a 100 uL
Puntas desechables blancas 1 a 10 uL
Tubos de Khan 75x13 mm
Guantes.

EQUIPOS




Cámara de incubación
Refrigerador
Vortex

DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO
PROCEDIMIENTO
1
2
3

Abrir la placa (el agar contiene Ag o Ac) para permitir que se evapore el exceso
de humedad, si lo hubiera.
Sembrar las muestras problemas para determinar los niveles de IGG, IGA, IGM,
C3, C4 en sus respectivas placas.
Sembrar en orificio de la placa: 5 uL de controles y cada una de las muestras
problema utilizando micropipeta de precisión.
NOTA: debe tenerse suma precaución al sembrar, evitando
derramar muestra fuera del pocillo, romper los bordes del
mismo o introducir burbujas de aire.

4

4

Registre en su hoja de trabajo la Posición en que sembró.
5
6
7

Colocar Algodón o papel filtro humedecido en el centro de la placa, para mantener
la humedad del agar.
Cerrar firmemente la tapa.
Incubar en posición invertida en cámara húmeda (en este caso refrigerador) por
16-20 hr.

CONTROL DE CALIDAD
En esta prueba los controles de calidad se colocaran en el los primeros 2 posillos de cada
gel y se rotularán como A y B.
Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control deCalidad interno, así
como procedimientos de corrección en el caso de que los controles no cumplan con las
tolerancias aceptables.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Al día siguiente DEBEN MEDIR LOS DIAMETROS DEL HALO DE DIFUSIÓN con
una precisión 1 mm.
El punto final de la reacción está indicado por la aparición de un anillo de bordes netos.
El mismo se alcanza una vez cumplido el tiempo de incubación.
A partir de ese momento puede efectuarse la lectura, ya que el halo no aumentará de
tamaño.
Interpolar la concentración en la tabla que se adjunta en el inserto de las placas de IDR
“Mientras más lejano sea el anillo de precipitación al sitio
de la siembra, mayor será su concentración”
a) Informe el valor obtenido para el antígeno en estudio.
b) Explique la relevancia clínica del resultado obtenido. En cada una de las muestras
problemas
c) Sugiera en relaciona la interpretación de resultados que patologías podrían estar
cursando los pacientes de quienes provienen las muestras en estudio

5
INTERPRETACIÓN
RESULTADOS OBTENIDO S
Los dos primeros 2 pocillos son los controles positivo y negativo respectivamente. Cada
uno puesto en una de las tres placas y con una determinada medición en sus halos.

Control A Ig A (6 mm): 231,9 mg/dL

6

Control B Ig A (5 mm): 125,8 mg/dL
Control A Ig G (8 mm): 262,3 mg/dL

7

Control B Ig G (6 mm): 1131,8 mg/dL
Control A Ig M (10 mm): >356,9 mg/dL

8

Control B Ig M(5 mm): 66,1 mg/dL
A continuación presento los resultados de mis dos sueros, 1.1 y 1.2 de las correspondientes
tres placas en el mismo orden.

PLACA IG A
Suero 1.1 (8 mm): 502.2 mg/dL

Suero 1.2 (6 mm): 231.9 mg/dL

9
PLACA IG G
Suero 1.1 (5.5 mm): 865,6 mg/dL

Suero 1.2 (6 mm): 1131,8 mg/dL

10
PLACA IG M
Suero 1.1 (6 mm): 121.4 mg/dL

Suero 1.2 (5 mm): 66.1 mg/dL

11
LECTURA DE LOS RESULTADOS
PLACA IG A:
Control A: 231,9 mg/dL
Control B: 125,8 mg/dL
Suero 1.1: 502.2 mg/dL
Suero 1.2: 231.9 mg/dL

PLACA IG G:
Control A: 262,3 mg/dL
Control B: 1131,8 mg/dL
Suero 1.1: 865,6 mg/dL
Suero 1.2: 1131,8 mg/dL

PLACA IG M:
Control A: >356,9 mg/dL
Control B: 66,1 mg/dL
Suero 1.1: 121.4 mg/dL
Suero 1.2: 66.1 mg/dL

VALORES DE REFERENCIA
Ig A: 220 mg/dL
Ig G: 1190 mg/dL
Ig M: 130 mg/dL

INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS
Se observa el halo formado y se mide en milímetros (mm) luego se compara con la tabla
adjuntas dentro de cada placa para finalmente expresar un resultado en mg/dL. Estos son
comparados con los valores de referencia provistos en el mismo inserto.

12
SIGNIFICADOS CLÍNICOS
Se utiliza para estimar la concentración de inmunoglobulinas en plasma. Por ejemplo IgG,
IgM, IgA en pacientes sospechosos de poseer alguna gammaglobinopatía o mieloma
multiple respectivamente.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN
Después de pasar los controles y validar sus resultados (A: Normal) (B: Patológico), ambos
fueron pasados por mí y los dos estaban dentro de los resultados esperados.
Con respecto a los sueros problemas, en el análisis de la placa con Ig A mostro un aumento
sobre el valor de referencia para el suero 1.1 y normalidad en el suero 1.2 estando dentro
del rango de referencia.
En los controles de la Placa de Ig G los controles están invertidos, sobre el valor de
referencia, lo que valida la placa. Ambos sueros problemas están dentro del rango de
referencia, por lo tanto no se ve alteración de estos sueros (1.1 y 1.2).
En el caso de Ig M fue difícil leer, pues como se aprecia en las imágenes, en el caso del
Control A solo se aprecia someramente la difusión, mientras que en el segundo se puede
apreciar claramente el halo. Control A esta como Patológico y Control B como normal.
También es importarte destacar que en la imagen de la lectura del suero 1.1 para esta
inmunoglobulina, nota una deformación. Eso está dado debido a un error de pipeteo fuera
del posillo, lo que no altero mucho el halo, pero que es importante destacar para denotar la
importancia del pipeteo en esta técnica.
Con respecto a esta última placa el suero 1.1 y el suero 1.2 están dentro del rango de
referencia esperado lo que nos dice que solo Ig A en el paciente 1.1 dio alterado.
Finalmente destacar que esto que los resultados obtenidos y el análisis es importante de
extrapolar los signos y síntomas del paciente y los valores obtenidos en este ensayo.

REFERENCIAS

1) Ramirez, Marcelo. Manual de Laboratorio de Inmunología
Clínica. Edición 2013. Santiago, Chile. Pags. 3-6.
2) Figueroa, Miguel. Fotografías prueba Inmunofluorecencia
Indirecta. 2013. Universidad Iberoamericana de Ciencias y
Tecnología, Ramo Inmunología Clínica.

13

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IDR Informe Técnica Cuantificar Inmunoglobulinas

  • 1. Informe de Técnica de Inmunodifusión Radial (IDR). por Miguel Angel Figueroa Núñez Inmunología Clínica TM. Marcelo Ramirez Sandoval
  • 2. TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN 2 ¿QUÉ ES LA INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA? ¿PRINCIPIO DE LA TECNICA? SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA OBJETIVOS 2 2 3 3 MATERIALES Y METODOS 4 MATERIALES UTILIZADOS METODO OCUPADO DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO PROCEDIMIENTOS CONTROL DE CALIDAD INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS RESUMEN DE LA TECNICA 4 4 4 5 6 7 7 INTERPRETACIÓN 8 RESULTADOS OBTENIDOS LECTURA DE LOS RESULTADOS VALORES DE REFERENCIA INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS SIGNIFICADOS CLÍNICOS DISCUSIÓN Y CONCLUCIÓN BIBLIOGRAFÍA 1 8 11 12 12 13 13 13
  • 3. INTRODUCCION ¿QUE ES LA INMUNODIFUSIÓN RADIAL? Desde hace mucho tiempo que las tecnicas de una seccion de laboratorio no son exclusivas, y este es el mejor ejemplo de como ocupamos el ingenio para el uso de tecnicas inmunologicas. La interacción de antígenos solubles macromoleculas (polivalentes) y anticuerpos específicos llevan a la formación de complejos variables de Ag o Ac, que frecuentemente llegan a ser insolubles y precipitan en solución. Este se conoce reacción de precipitación que es dependiente de la relación de concentración Ag y Ac. PRINCIPIO DE LA TECN ICA El procedimiento consiste en una inmunoprecipitación en agarosa entre un Antígeno a cuantificar y su Anticuerpo homólogo. Se realiza incorporando uno de los 2 reactivos inmunes (generalmente Anticuerpo) uniformemente en una capa de Agarosa y luego introduciendo el otro reactivo en pocillos cavados en el gel. El antígeno difunde radialmente en la mezcla gel-Anticuerpo y se forma un disco o anillo visible en un punto que depende de la relación estequiométrica antígeno-anticuerpo. A medida que más antígeno difunde, el anillo se redisuelve y reaparece en una distancia mayor del pocillo. Este aumento en el diámetro de precipitación continúa hasta que Antígeno y Anticuerpo reacciona completamente. Mientras que el precipitado se está expandiendo (16 – 20 horas) la relación entre el diámetro del anillo y el logaritmo de la concentración de antígeno es aproximadamente lineal. Al completarse la reacción, la relación entre el diámetro al cuadrado y la concentración es lineal. 2
  • 4. SU UTILIDAD EN LA IN MUNOLOGÍA CLÍNICA La detección de autoanticuerpos en autoinmunes como:        el diagnóstico de diferentes enfermedades Lupus Eritematoso Sistémico. Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo. Síndrome de Sjogren. Esclerosis Sistemática Progresiva. Síndrome de CREST. Cirrosis Biliar Primaria. Artritis Reumatoide OBJETIVOS   3 Cuantificar las inmunoglobulinas (IGG, IGA, IGM) y Complemento (C3 y C4) mediante la técnica de inmunodifusión radial. Identificar los requerimientos técnicos que debemos considerar al realizar esta técnica
  • 5. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES UTILIZADO S INSUMOS            Placas IDR anti-IGG Placas IDR anti-IGM Placas IDR anti-IGA Placas IDR anti-complemento C3 Placas IDR anti-complemento C4 Micropipeta de 10uL-100uL Micropipeta de 1 a 10 uL Puntas desechables amarillas 10 a 100 uL Puntas desechables blancas 1 a 10 uL Tubos de Khan 75x13 mm Guantes. EQUIPOS    Cámara de incubación Refrigerador Vortex DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO PROCEDIMIENTO 1 2 3 Abrir la placa (el agar contiene Ag o Ac) para permitir que se evapore el exceso de humedad, si lo hubiera. Sembrar las muestras problemas para determinar los niveles de IGG, IGA, IGM, C3, C4 en sus respectivas placas. Sembrar en orificio de la placa: 5 uL de controles y cada una de las muestras problema utilizando micropipeta de precisión. NOTA: debe tenerse suma precaución al sembrar, evitando derramar muestra fuera del pocillo, romper los bordes del mismo o introducir burbujas de aire. 4 4 Registre en su hoja de trabajo la Posición en que sembró.
  • 6. 5 6 7 Colocar Algodón o papel filtro humedecido en el centro de la placa, para mantener la humedad del agar. Cerrar firmemente la tapa. Incubar en posición invertida en cámara húmeda (en este caso refrigerador) por 16-20 hr. CONTROL DE CALIDAD En esta prueba los controles de calidad se colocaran en el los primeros 2 posillos de cada gel y se rotularán como A y B. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control deCalidad interno, así como procedimientos de corrección en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias aceptables. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Al día siguiente DEBEN MEDIR LOS DIAMETROS DEL HALO DE DIFUSIÓN con una precisión 1 mm. El punto final de la reacción está indicado por la aparición de un anillo de bordes netos. El mismo se alcanza una vez cumplido el tiempo de incubación. A partir de ese momento puede efectuarse la lectura, ya que el halo no aumentará de tamaño. Interpolar la concentración en la tabla que se adjunta en el inserto de las placas de IDR “Mientras más lejano sea el anillo de precipitación al sitio de la siembra, mayor será su concentración” a) Informe el valor obtenido para el antígeno en estudio. b) Explique la relevancia clínica del resultado obtenido. En cada una de las muestras problemas c) Sugiera en relaciona la interpretación de resultados que patologías podrían estar cursando los pacientes de quienes provienen las muestras en estudio 5
  • 7. INTERPRETACIÓN RESULTADOS OBTENIDO S Los dos primeros 2 pocillos son los controles positivo y negativo respectivamente. Cada uno puesto en una de las tres placas y con una determinada medición en sus halos. Control A Ig A (6 mm): 231,9 mg/dL 6 Control B Ig A (5 mm): 125,8 mg/dL
  • 8. Control A Ig G (8 mm): 262,3 mg/dL 7 Control B Ig G (6 mm): 1131,8 mg/dL
  • 9. Control A Ig M (10 mm): >356,9 mg/dL 8 Control B Ig M(5 mm): 66,1 mg/dL
  • 10. A continuación presento los resultados de mis dos sueros, 1.1 y 1.2 de las correspondientes tres placas en el mismo orden. PLACA IG A Suero 1.1 (8 mm): 502.2 mg/dL Suero 1.2 (6 mm): 231.9 mg/dL 9
  • 11. PLACA IG G Suero 1.1 (5.5 mm): 865,6 mg/dL Suero 1.2 (6 mm): 1131,8 mg/dL 10
  • 12. PLACA IG M Suero 1.1 (6 mm): 121.4 mg/dL Suero 1.2 (5 mm): 66.1 mg/dL 11
  • 13. LECTURA DE LOS RESULTADOS PLACA IG A: Control A: 231,9 mg/dL Control B: 125,8 mg/dL Suero 1.1: 502.2 mg/dL Suero 1.2: 231.9 mg/dL PLACA IG G: Control A: 262,3 mg/dL Control B: 1131,8 mg/dL Suero 1.1: 865,6 mg/dL Suero 1.2: 1131,8 mg/dL PLACA IG M: Control A: >356,9 mg/dL Control B: 66,1 mg/dL Suero 1.1: 121.4 mg/dL Suero 1.2: 66.1 mg/dL VALORES DE REFERENCIA Ig A: 220 mg/dL Ig G: 1190 mg/dL Ig M: 130 mg/dL INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS Se observa el halo formado y se mide en milímetros (mm) luego se compara con la tabla adjuntas dentro de cada placa para finalmente expresar un resultado en mg/dL. Estos son comparados con los valores de referencia provistos en el mismo inserto. 12
  • 14. SIGNIFICADOS CLÍNICOS Se utiliza para estimar la concentración de inmunoglobulinas en plasma. Por ejemplo IgG, IgM, IgA en pacientes sospechosos de poseer alguna gammaglobinopatía o mieloma multiple respectivamente. DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN Después de pasar los controles y validar sus resultados (A: Normal) (B: Patológico), ambos fueron pasados por mí y los dos estaban dentro de los resultados esperados. Con respecto a los sueros problemas, en el análisis de la placa con Ig A mostro un aumento sobre el valor de referencia para el suero 1.1 y normalidad en el suero 1.2 estando dentro del rango de referencia. En los controles de la Placa de Ig G los controles están invertidos, sobre el valor de referencia, lo que valida la placa. Ambos sueros problemas están dentro del rango de referencia, por lo tanto no se ve alteración de estos sueros (1.1 y 1.2). En el caso de Ig M fue difícil leer, pues como se aprecia en las imágenes, en el caso del Control A solo se aprecia someramente la difusión, mientras que en el segundo se puede apreciar claramente el halo. Control A esta como Patológico y Control B como normal. También es importarte destacar que en la imagen de la lectura del suero 1.1 para esta inmunoglobulina, nota una deformación. Eso está dado debido a un error de pipeteo fuera del posillo, lo que no altero mucho el halo, pero que es importante destacar para denotar la importancia del pipeteo en esta técnica. Con respecto a esta última placa el suero 1.1 y el suero 1.2 están dentro del rango de referencia esperado lo que nos dice que solo Ig A en el paciente 1.1 dio alterado. Finalmente destacar que esto que los resultados obtenidos y el análisis es importante de extrapolar los signos y síntomas del paciente y los valores obtenidos en este ensayo. REFERENCIAS 1) Ramirez, Marcelo. Manual de Laboratorio de Inmunología Clínica. Edición 2013. Santiago, Chile. Pags. 3-6. 2) Figueroa, Miguel. Fotografías prueba Inmunofluorecencia Indirecta. 2013. Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnología, Ramo Inmunología Clínica. 13