1. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA
Mg EN GERENCIA DE SERVICIOS DE SALUD
LIMA – PERÚ
2010

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PROLOGO
La Universidad Inca Garcilaso de la Vega, está empeñada en realizar importantes
innovaciones en la concepción y práctica educativa con el propósito de brindar a sus
alumnos una formación profesional más competitiva, que haga posible su ingreso
con éxito al mundo laboral, desempeñándose con eficacia y eficiencia en las
funciones que les tocará asumir.
El marco referencial está dado por los cambios significativos de la sociedad
contemporánea, expresados en la globalización y los nuevos paradigmas del
conocimiento, de la educación y la pedagogía así como los retos del mundo laboral.
Uno de los medios para el logro de nuestros propósitos lo constituye el MANUAL DE
PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA el cual ha sido concebido como un material
educativo que va ha servir para afianzar conocimientos, desarrollar habilidades y
destrezas, así como orientar la autoeducación permanente. por ello se ubica como
un material de lectura independiente, sirve de información y recreación, desempeña
un papel motivador, se orienta a facilitar la lectura comprensiva, a ampliar
conocimientos en otras fuentes, crear hábitos y actitudes, así como a desarrollar
destrezas para el procesamiento de información, adquisición y generación de
conocimientos.
El presente Manual, constituye material de apoyo al desarrollo de la asignatura y
está organizado en dos unidades: Unidad I: Microbiología Generalidades, Unidad II:
Microbiología Aplicada comprende: Microbiología Clínica, Microbiología Alimentaria,
Microbiología en la Industria Farmacéutica y Cosmética y de un Trabajo de Campo.
Los alumnos deben leer detenidamente cada práctica, antes de su realización, para
una mejor comprensión en la observación del fenómeno biológico de cada
microorganismo en estudio. Además debe realizar diagramas de flujo de lo
observado el cual será revisado por el profesor responsable de cada grupo de
práctica.
El autor agradece anticipadamente la(s) crítica(s) o sugerencia(s) que puedan tener
los lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo.
Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA
DOCENTE DE MICROBIOLOGÍA
1 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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INDICE
PRÓLOGO 01
INDICE 02
INTRODUCCIÓN 04
INSTRUCCIONES GENERALES 06
MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS A LAS PRÁCTICAS 08
SISTEMA DE EVALUACIÓN 09
PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO 10
UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERALIDADES 12
PRACTICA N°01
Bioseguridad, Toma de Muestra y Acondicionamiento de Materiales. 13
PRACTICA N°02
Métodos de Esterilización y Desinfección (Antisépticos y Desinfectantes). 20
PRACTICA N°03
Medios de cultivo: Preparación de Medios de Cultivo. 32
PRACTICA N°04
Coloración Gram y Coloración de Bacterias Ácido Alcohol Resistentes. 39
PRACTICA N°05
Análisis Cualitativo y Cuantitativo Bacteriano. 59
PRACTICA N°06
Metabolismo Bacteriano. 70
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REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 79
ANEXO I: Flora Microbiana del Cuerpo Humano Normal 80
ANEXO II: Fundamentos e Interpretación de Agares y Caldos 83
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INTRODUCCIÓN
La Microbiología es la ciencia encargada del estudio de los organismos
microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos
(ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Son
considerados Microbios todos los seres vivos microscópicos consistentes en una
sola célula, es decir unicelulares, así como aquellos que forman agregados celulares
en los cuales todas las células son equivalentes. Los microorganismos pueden ser
Eucariotas (Las células poseen núcleo), tales como los hongos y los protistas, o
Procariotas (células carentes de núcleo), como las Bacterias y los Virus (Aunque los
virus no son considerados seres vivos estrictamente hablando).
El Químico Farmacéutico y Bioquímico, es el profesional universitario de las Ciencias
Médicas con formación científica, tecnológica y humanística, con capacidad
gerencial, ejecutiva y de liderazgo. Así mismo altamente capacitado para poder
ejercer profesionalmente en los campos de la Industria Farmacéutica e Industria
Cosmética siendo Jefe de Control de Calidad, del Laboratorio de Análisis
Clínicos y Bioquímicos ejerciendo la Microbiología Clínica y del Laboratorio de
Bromatología realizando los Controles Microbiológicos a los Alimentos.
Hoy en día el Profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico es el profesional
responsable de la producción de los medicamentos y de los cosméticos de calidad,
seguros y eficaces y para lograr este objetivo el control microbiológico se considera
de gran importancia, ya que en estos productos se pueden presentar las condiciones
necesarias para la multiplicación de microorganismos capaces de deteriorar al
producto o, lo que es peor, afectar la salud del consumidor.
El cuidado de los alimentos y la industrialización de los mismos se ha convertido en
una ciencia y cada vez más se estudia e investiga la forma de mejorar la calidad. Día
a día surgen nuevas técnicas, nuevos tipos de envases, nuevos aditivos, nuevos
conservadores, etc. Esto ha llevado al establecimiento de normas, al desarrollo de
métodos y sistemas de control, que aseguren la inocuidad de los mismos. Para
lograr este objetivo el Químico Farmacéutico y Bioquímico, realiza los Controles
Microbiológicos donde cuantifica e identifica los microorganismos presentes en los
alimentos.
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Las infecciones intrahospitalarias cada vez más constituyen un serio problema de
salud pública, ya sea por su efecto sobre la salud de los pacientes, como por los
costos que este problema implica. Esto hace, que en el país se estén aunando
esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevención y control, orientados
a enfrentar este problema. Por lo que el Medico debe basar su diagnóstico en
evidencias disponibles, como son los aspectos epidemiológicos, y la importante
contribución del Laboratorio de Microbiología, que además de permitir el
diagnóstico etiológico, orienta el manejo clínico terapéutico del paciente.
El estudiante de Microbiología de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y
Bioquímica de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega, en el futuro será el
profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico, quien con los conocimientos
presentes en este manual estará en la capacidad de poder afrontar y resolver con
criterio los problemas presentados ya sea en la Jefatura de Control de Calidad de
una Industria Farmacéutica ó Cosmética, como en un Laboratorio Clínico
Microbiológico ó un Laboratorio Bromatológico.
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INSTRUCCIONES GENERALES
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
PRINCIPIOS GENERALES
1. La señal internacional de riesgo biológico debe colocarse en las puertas de
los locales en que se manipulan microorganismos del Grupo de Riesgo
2,3,4.
2. En la zona de trabajo del laboratorio o aula de prácticas no se permitirá al
personal: comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicar cosméticos.
3. No pipetear con la boca.
4. Mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando del mismo cualquier
material que no tenga ninguna relación con el trabajo.
5. Las superficies de trabajo se descontaminarán al terminar la práctica y en
caso derramamiento de sustancias potencialmente peligrosas.
6. El personal de laboratorio y/o alumnos se lavarán las manos después de
haber manipulado material infeccioso, así como al abandonar el
laboratorio.
7. Todos los procedimientos de siembra se practicarán de manera que no se
produzca la formación de aerosoles.
8. En el laboratorio se utilizarán obligatoriamente: mandiles, batas, uniformes
u otras prendas apropiadas, esta no se llevará fuera del laboratorio.
9. Utilizar guantes en todos los trabajos con riesgo de contaminación como
sangre, material infeccioso o productos infectados.
10. Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales o potenciales
a material infeccioso se notificarán inmediatamente al profesor.
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RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO DEL MICROSCÓPIO
En microbiología el manejo del microscopio es de gran ayuda para el
reconocimiento de los microorganismos, por lo que es necesario conocer su
correcto manejo.
Las preparaciones coloreadas necesitan el uso de objetivos de inmersión, en las
cuales se utiliza aceite de cedro en la interfase objetivo – portaobjetos, el
condensador próximo a la platina y el diafragma abierto para permitir una buena
iluminación. Antes y después de su uso limpie los objetivos con papel para lentes.
DE CÓMO MANIPULAR LOS CULTIVOS Y EL MATERIAL CONTAMINADO
- Siempre trabajar cerca de la llama de un mechero de gas o alcohol.
- Nunca dejar tubos ni placas destapadas.
- Colocar las placas Petri en posición invertida para evitar que caiga el
agua de condensación la cual puede estar contaminada.
- Mantener los tubos con caldo en posición vertical para evitar que se
mojen los tapones.
- Abrir los tubos en forma adecuada, flamear la boca del tubo antes y
después de efectuarse el trabajo. No dejar el tapón del tubo sobre la
mesa. Las placas deben ser cubiertas cuidadosamente para evitar que se
contaminen.
- Esterilizar las asas de alambre antes e inmediatamente después de
usarlas. Si se ha empleado para trabajar un material que crepita como el
caso del esputo, previamente al flameado introducir el asa en un frasquito
de vidrio que contenga arena y alcohol. Nunca dejar asas sobre la mesa
de trabajo sino en frascos especiales y en posición vertical con el alambre
hacia arriba.
- Aprender a usar las pipetas adecuadamente: para el trabajo
bacteriológico éstas vienen estériles y envueltas en papel. Manipularlas
exclusivamente por su extremo posterior, desenvolviéndolas en el
momento de usarlas. No quitar el algodón que llevan, por ser un elemento
de protección para el que la usa. Emplear micropipetas para realizar la
succión. No pipetear con la boca
- Eliminar pipetas, láminas y todo el material contaminado en un recipiente
con solución desinfectante.
- En caso de accidentes como, ruptura de una placa o un tubo con
materiales infectante, contaminación del mandil o de la mesa, etc.
Durante el trabajo, avisar inmediatamente al profesor.
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DE CÓMO TERMINAR EL TRABAJO DE PRACTICA
1. Todos los cultivos que se incuben deben tener las siguientes anotaciones:
nombres ó iniciales de los estudiantes, nombre del microorganismo, grupo
de práctica y fecha de siembra.
2. En caso de las placas, todas deben incubarse invertidas a menos que sean
dadas instrucciones contrarias por el profesor.
3. Los tubos deben estar bien tapados y colocados en gradillas de metal.
4. Los alumnos se responsabilizarán de colocar estos cultivos en estufas a
37° por 24 horas
C
TERMINADA LA PRACTICA, AL FINALIZAR EL TRABAJO
1. Limpiar la mesa de trabajo con algodón embebido en desinfectante.
2. Comprobar que las llaves de gas estén cerradas.
3. Lavarse prolijamente las manos con jabón germicida.
4. Se llevará un cuaderno de laboratorio donde se apuntará todos los
diagramas de flujo.
MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS PARA LAS PRACTICAS
- Dos pliegos de papel kraft (Por alumno).
- Un asa de siembra (Por alumno).
- Aguja de siembra (03 Unidades) (Por alumno).
- Papel Toalla y Encendedor a Gas (Por grupo de práctica).
- Jabón Germicida (Por Grupo de Practica).
- Desinfectante para limpiar las mesas trabajo (Por Grupo de Práctica).
- Plumón Marcador (Por alumno).
- Guantes para cada laboratorio (Por alumno).
- Mascarilla para cada laboratorio (Por alumno).
- Gorro para cada laboratorio (Por alumno).
- Mandil blanco (Por alumno).
- Baja - lengua (04 Unidades) (Por alumno).
- Torundas (04 Unidades) (Por alumno).
- Algodón industrial (No hidrófilo 500 gramos (Por grupo de práctica).
- Un rollo de pavilo (Por grupo de práctica).
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SISTEMA DE EVALUACIÓN
Habrá tres evaluaciones como se describe a continuación:
1. La Primera Evaluación es Escrita después de la sexta práctica de Laboratorio.
2. La Segunda Evaluación es Práctica, al finalizar las prácticas programadas.
Comprenderá de un trabajo de campo y la elaboración de un Protocolo de
Análisis Microbiológico; y
3. La Tercera Evaluación es la exposición de sus respectivos resultados. Los
temas del trabajo de campo y el orden de las exposiciones son las siguientes:
a. Microbiología Clínica: Coprocultivo y Antibiograma.
b. Microbiología Clínica: Urocultivo y Antibiograma.
c. Microbiología Alimentaria: Análisis Microbiológico de productos
lácteos Ejemplo: Leche, queso, etc.
d. Microbiología Alimentaria: Análisis Microbiológico de Salsas Ejemplo:
Mayonesa, tomate, Mostaza, etc.
e. Microbiología en la Industria Farmacéutica y/o Cosmética:
Monitoreo de Ambiente, Superficies y Personal. Ejemplo: Laboratorio
N°06 de la Facultad, etc.
f. Microbiología en la Industria Farmacéutica y/o Cosmética: Análisis
Microbiológico de Envases. Ejemplo: Cápsulas, Tapas, Potes, Frascos,
etc.
PONDERACIÓN DE LAS EVALUACIONES
1. Primera Evaluación 1A
2. Segunda Evaluación: Protocolo de Análisis Microbiológico 1B
3. Tercera Evaluación: Exposición de los Resultados 1C
PROMEDIO FINAL = 1A + 1B + 1C
3
TIPO DE CALIFICACIÓN: La calificación es vigesimal, de cero a veinte.
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PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
PROTOCOLO DE ANÁLISIS DE ENVASES O EMPAQUE
PROTOCOLO N°
CÓDIGO DE ENVASE: ----------------------------------------------------
FORMA: ----------------------------------------------------
LOTE: ----------------------------------------------------
FECHA DE ANÁLISIS: ----------------------------------------------------
ENSAYO ESPECIFICACIONES RESULTADOS TÉCNICA ANALÍTICA
ENSAYO TÉCNICA
ESPECIFICACIONES RESULTADOS
MICROBIOLÓGICO ANALÍTICA
OBSERVACIONES: -------------------------------------------------------------------------------------
FECHA: -----------------------------------------------------------------------------------------------------
ANALISTA JEFE DE CONTROL DE CALIDAD
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CONTROL MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES
AREA: ________________ N°ANALISIS: ____________
MAPA DE PLAQUEO
A1
A2
Puerta de Ingreso
Leyenda:
A1: Placa en el Piso
A2: Placa sobre la mesa o equipo
FECHA: _____________________
RESULTADOS: ___________________________________________________
OBSERVACIONES:___________________________________________________
___________________________________________________________________
REALIZADO POR: ______________ VERIFICADO POR: _____________
Especificaciones: Máximo 500 microorganismos viables permitidos
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UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERALIDADES
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PRACTICA N°01
BIOSEGURIDAD, TOMA DE MUESTRA Y ACONDICIONAMIENTO DE
MATERIALES.
Para trabajar en un laboratorio de Microbiología se requieren técnicas específicas y
diferentes a las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en
condiciones asépticas: el material e instrumental que se va a utilizar, así como los
medios de cultivo, deben ser sometidos con algunas excepciones (Caldo Selenito,
Agar XLD) a procedimientos de esterilización, eliminándose de ellos posibles
microorganismos contaminantes. Para mantener las condiciones de esterilidad,
debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un
mechero Bunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse
utilizando cultivos axénicos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola
especie microbiana. La posibilidad de contaminación está siempre presente porque
los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: en el aire, en el agua,
en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos. Para evitar las
contaminaciones hemos de observar las siguientes normas:
• El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estériles.
• Los tubos o matraces deben ser tapados con algodón hidrófobo estéril o
cubiertos con un capuchón metálico, para impedir la entrada de
microorganismos. Si se usan placas Petri deben mantenerse tapadas
mientras no se estén manipulando.
• Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con
los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de
siembra, pipetas, etc.) deben ser previamente esterilizados.
MATERIALES EMPLEADOS Y FORMA DE USO
ASA E HILO DE SIEMBRA: Antes de su utilización, se esterilizan sometiéndolos a
la acción de la llama de un mechero hasta que el filamento quede incandescente,
luego se flameará la parte inferior del filamento. Una vez utilizados, deben flamearse
de nuevo para eliminar los microorganismos que quedan en ellos.
PIPETAS GRADUADAS DE VIDRIO O PLÁSTICO
Se suministran ya estériles a los alumnos, dentro de estuches metálicos o bien
empaquetadas de forma individual (envueltas en papel Kraft o aluminio para
mantener su esterilidad), en cualquier caso deben abrirse cerca de la llama del
mechero. La pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada, debe flamearse
ligeramente antes de ser usada. Las pipetas llevan un algodón en la boquilla, que
actúa como filtro, para evitar la contaminación y para impedir la llegada de líquido al
sistema de succión. Dicho algodón debe permanecer en la boquilla durante el uso.
Bajo ningún concepto se debe pipetear con la boca una muestra microbiológica.
Para pipetear suspensiones de microorganismos se utilizan propipetas o bombillas
que permitan controlar la succión y el dispensado de los líquidos o los dispositivos
semejantes a jeringas en los que se coloca la pipeta y que operan por medio de un
émbolo. También se pueden utilizar micropipetas o pipetas automáticas.
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TUBOS DE ENSAYO CON CULTIVOS PROBLEMA Y PLACAS PETRI
Se destapan cerca de la llama del mechero utilizando para ello sólo los dedos que
quedan libres en la mano que sostiene el asa de siembra. Se flamea la boca del
tubo, se toma una pequeña muestra del cultivo con asa de siembra estéril,
previamente atemperada, y tras flamear de nuevo la boca del tubo colocamos el
tapón. Todo el proceso se realiza cerca de la llama. Si el medio es líquido, se debe
agitar el tubo antes de tomar la muestra, porque los microorganismos tienden a
sedimentar. En el caso de que el medio sea sólido (tubos de agar inclinado y placas
Petri), la muestra se obtendrá rozando ligeramente con el asa la zona en la que se
aprecia masa microbiana. Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el
menor tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones.
INSTRUMENTOS PARA SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
A.- Asa de Siembra C.- Pipeta de Pasteur.
B.- Hilo de Siembra D.- Cayado.
PIPETAS
A.- Pipeta automática de 0,2 - 1mL. C-- Pipeta de vidrio de 10mL.
B.- Pipeta automática de 0,02 - 0,2mL. D.- Pipeta de vidrio de 1mL.
MANEJO DEL ASA
DE SIEMBRA DURANTE
UNA INOCULACIÓN
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PROCEDIMIENTOS DE BIOSEGURIDAD
La BIOSEGURIDAD es una combinación de procedimientos técnicos uso de
equipos, materiales e infraestructura que se debe practicar diariamente y que no
debe olvidar el personal de laboratorio.
Los procedimientos de BIOSEGURIDAD tienen por finalidad:
- PROTEGER: Al personal de laboratorio contra la exposición innecesaria e
injustificada a microorganismos infecciosos.
- EVITAR: La contaminación de las muestras que puede echar a perder el
trabajo del laboratorista con resultados falsos.
- MANTENER (Contención): Los microorganismos infecciosos dentro del
ambiente del laboratorio.
MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGOS
Es IMPORTANTE conocer los tipos de microorganismos infectantes con los que
trabajamos, para tomar las medidas de BIOSEGURIDAD respectivas.
- La capacidad infectante del microorganismo.
- Los modos de transmisión (por Ej: aerosoles).
- Si son prevenibles por medio de inmunización (vacuna contra la Hepatitis B,
Fiebre amarilla, etc.).
- Si se dispone de medidas eficaces para el tratamiento contra el microorganismo
infectante (por ejemplo: uso de Antibióticos).
Alerta de Riesgo
Biológico
Alerta de Ondas Alerta de Peligro
Radiales Tóxico
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MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO
GRUPO DE RIESGO MICROORGANISMO INFECTANTE
RIESGO 1
Agrupa microorganismos que tienen escaso
o nulo riesgo de provocar enfermedades Ej: Plasmodium, helmintos intestinales, etc.
humanas.
RIESGO 2
Agrupa microorganismos que pueden
provocar enfermedades humanas de riesgo
Ej: Entamoeba histolytica, Leishmania,
moderado. Si provoca una infección al
Salmonella typhi, Staphylococcus, etc.
personal de laboratorio, ésta tiene
tratamiento y cura.
RIESGO 3
Agrupa microorganismos que pueden
Ej: Mycobacterium tuberculosis, Taenia
provocar enfermedades humanas graves.
solium, Yersinia pestis, etc.
Tiene tratamiento, cura y se limita.
RIESGO 4
Agrupa microorganismos que provocan
Ej: Virus de la Inmunodeficiencia humana
enfermedades graves en el ser humano. No
(VIH), etc.
hay tratamiento para su cura.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Grupo de
Nivel de Ejemplos de Equipos de
Microorganismo
Bioseguridad Laboratorio Seguridad
Infectante
Laboratorio de Ninguna.
Laboratorio Básico Enseñanza.
RIESGO 1 Sólo mesas de
Nivel de Bioseguridad 1. Laboratorio Laboratorio al
Universitario descubierto.
Mesa de
Servicio de Atención
Laboratorio al
Laboratorio Básico. Primaria de Salud.
descubierto o
RIESGO 2
Cámara de
Nivel de Bioseguridad 2. Hospital de nivel
Seguridad
primario, diagnóstico.
Biológica.
Cámara de
Seguridad
Laboratorio de
Biológica o
Contención. Diagnóstico
RIESGO 3 Contención
Especial.
Primaria para
Nivel de Bioseguridad 3.
todas las
actividades.
Cámara de
Laboratorio de Seguridad
Contención Máxima. Unidades Patógenas Biológica Clase III
RIESGO 4
Peligrosas. o Ropa de Presión
Nivel de Bioseguridad 4. Especial, Aire
Filtrado.
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LABORATORIOS BÁSICOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1 y 2
- Las Reglas Más Importantes:
- Del Ambiente:
- Del Personal:
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TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA
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Recepción de los pacientes
- Nombres y apellidos
- Tipo de muestra
- Tipo de análisis
Recepción de la orden de análisis
- Toma de muestra
- Orina, sangre, otros
Preparación del paciente para la
toma de muestra
Colocar la ligadura, limpiar la zona de
aplicación, indicar al paciente que
haga puño. Introducir la aguja
Aspirar, retirando suavemente el
émbolo. El ingreso de sangre a la
jeringa nos indicará que estamos en
vena.
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PRACTICA N°02
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
En Microbiología se define Esterilización como el proceso por el que se destruye o
elimina de un objeto o de una sustancia todos los microorganismos vivos: virus,
bacterias, esporas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de
esterilidad.
OBJETIVO
Conocer la importancia de la Esterilización y Desinfección familiarizarse con el
manejo de los procedimientos más frecuentemente utilizados para llevarla a cabo.
MATERIAL
Mechero Bunsen, horno, autoclaves, equipos de filtración y materiales a tratar.
TÉCNICAS
El método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el
calor, entre otras razones porque es el más económico y el más fácil de controlar. El
calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor
húmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se
requieren temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos
a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los
puentes de hidrógeno responsables de la estructura tridimensional de las proteínas,
haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.
En el laboratorio clínico, la esterilización y la desinfección se logra con los siguientes
métodos:
- Calor húmedo: Vapor saturado a presión, olla de presión, ebullición, vapor
fluente
- Calor seco: Horno de aire caliente, flameado.
- Desinfección intensiva por inmersión en productos químicos: Lejía.
- Desinfección por frotación con un producto químico.
- Filtración.
MECHERO DE
BUNSEN
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CALOR SECO
FLAMEADO
Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra,
pinzas, espátulas, etc. Consiste en someter
directamente a la acción de la llama de un mechero
Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar.
Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin
embargo no se puede aplicar a objetos
termolábiles.
ESTERILIZACIÓN POR AIRE CALIENTE
Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se
van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez
esterilizados, en el interior de un horno. Este procedimiento se utiliza para esterilizar
material de vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. U otros materiales
termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy
elevadas (180ºC durante 2 horas). Estas temperaturas no pueden utilizarse para
esterilizar líquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100ºC
comenzarían a hervir y continuarían hirviendo sin elevar su temperatura por encima
del punto de ebullición del agua a presión atmosférica, y a esta temperatura las
endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en muestras
en las que supiésemos que no existen endosporas, esta metodología puede
implicar cambios en la concentración de los componentes del medio, a causa de la
fuerte evaporación sufrida.
CALOR HUMEDO:
EBULLICIÓN: El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada
durante 10 – 20 minutos va a destruir las formas vegetativas de los
microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a
tratamientos prolongados.
21 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

24. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
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Se podría utilizar el baño María o baño de agua hirviente
(sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando
no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se
dispone de otros métodos mejores, tanto para material
(pinzas, tijeras, escalpelos, etc.) como para medios de
cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave.
VAPOR FLUENTE
Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se
puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que pierdan alguna de sus
propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presión
atmosférica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100ºC, y se realiza el
proceso durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los
intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100ºC)
durante 30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero
no las endosporas termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la
muestra germinan después del calentamiento y estas formas vegetativas serán
destruidas en los siguientes ciclos. Este método de esterilización se denomina
también Esterilización Fraccionada o Tindalización.
VAPOR SATURADO A PRESIÓN
La esterilización por esta técnica utiliza vapor de
agua saturado que se somete a una atmósfera extra
de presión sobre la presión atmosférica normal,
elevándose con ello el punto de ebullición del agua
de 100ºC a 121ºC y consiguiéndose la destrucción
de todos los microorganismos en un tiempo de 15
minutos. Esta temperatura es también necesaria
para la destrucción de las endosporas bacterianas,
que presentan una alta resistencia térmica y que
pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100ºC
durante horas. El vapor de agua difunde por ósmosis
a través de las membranas de las esporas,
coagulando su protoplasma, fenómeno que se
acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión.
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Esta técnica de esterilización requiere el uso del Autoclave.
FILTRACIÓN
Es el paso de un líquido o gas a través de un material
filtrante, con poros lo suficientemente pequeños como
para retener células microbianas. Los filtros que se
utilizan en la actualidad son, generalmente, los
denominados filtros de membrana y están integrados por
pequeñas piezas de material sintético, generalmente
Acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener
poros con tamaños de 0,22 y 0,45 µm, diseñados para
retener bacterias. La acción combinada de los poros, la
trama del filtro y la naturaleza química del material
utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido.
ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO
En Microbiología es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada
limpieza del material. Asimismo, es muy importante la recuperación del material
reciclable y la eliminación del material desechable. Todos los objetos sucios o
contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos de tapa. El
material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material
recogiéndose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solución
desinfectante, como por ejemplo una solución diluida de lejía, en la que
permanecerá antes de su lavado durante 24 horas. Como los objetos contaminados
contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia orgánica (procedente
de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes físicos
o químicos utilizados en la descontaminación de los mismos, no puede asegurarse
la total destrucción de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por
ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos
más largos de tratamiento que para la desinfección o la esterilización de material
limpio.
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Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminación de instrumentos,
equipos y material que sean estables al calor, así como de material desechable. A
tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el
autoclave sometiéndolos a la acción del vapor de agua a una atmósfera de
sobrepresión (121º C) en ciclos más prolongados de lo habitual (1 hora en lugar de
30 minutos). Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para
eliminar toda materia extraña, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o
utilizando detergentes, mezcla sulfocrómica o cualquier otro procedimiento enérgico,
tanto mecánico como químico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir
y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes de ser lavadas,
debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales, el trozo de algodón
que tienen en la boquilla. Algunos de los objetos sucios y contaminados
(portaobjetos, pipetas, etc), después de lavados, se sumergen en una mezcla
sulfocrómica donde se dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavan con agua y se
dejan escurrir.
Los portas se secan con un paño de hilo limpio, procurando que no queden hilazas
sobre la superficie. El material que contiene colorantes se trata, según las
condiciones del material, durante un tiempo variable con una solución que puede ser
de ácido clorhídrico, nítrico o mezcla sulfocrómica. El resto del material (tubos de
plástico, jeringas, etc) se trata con distintas soluciones desinfectantes como
hipoclorito sódico, formol, etc, pero debe recordarse que se utilizan a
concentraciones superiores a las utilizadas con otros fines.
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MANEJO DEL AUTOCLAVE
PROCEDIMIENTO:
− Cerciorarse que el agua desionizada o
destilada cubra la rejilla (aproximadamente 6
litros de agua).
Colocar cuidadosamente en la bandeja el
material a autoclavar (para el caso de placas
colocarlas como si fuera a plaquear y para el
caso de tubos se pueden colocar con sus
gradillas); si es necesario utilizar las dos
bandejas.
− Luego colocar encima de la bandeja la cubierta
protectora.
− Bajar la tapa y colocar todas las manoplas,
después realizar en forma simultanea el ajuste
de las mismas, en forma diagonal o en (cruz).
− Encender el equipo (llave principal – pared)
“ON” y posteriormente girar la perilla
AUTOMATICO en “HI” y la perilla RELOJ
hasta 50 minutos.
− Cuando el equipo se encuentre aproximadamente entre 90° C – 100° C
cerciorarse si por la espita ya no sale aire y que en su lugar salga “VAPOR” se
puede corroborar colocando un pedazo de papel a la salida de la espita si se
humedece entonces cerrar la espita.
− Simultáneamente el equipo empezará a elevar la presión y cuando se
encuentre entre 15 a 17 libras de presión, entonces girar la perilla
AUTOMÁTICO a “3” para mantener la presión constante a partir de ese
momento controlar 15 minutos (121°C por 15 libras por 15 minutos).
− Terminado el equipo apagarlo y girar la perilla AUTOMÁTICO en “OFF” y la
perilla RELOJ “O” y finalmente la llave principal – pared “OFF”.
− Esperar que la presión comience a disminuir por si sola y cuando llegue a
“CERO” entonces proceder a abrir por completo la llave de la espita,
posteriormente aflojar las manoplas y retirarlas: como precaución mantenerse
atrás del autoclave para la apertura de la tapa (cuidándose del vapor).
− Retirar el material autoclavado.
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DESINFECCIÓN INTENSIVA POR INMERSIÓN EN PRODUCTOS QUÍMICOS
DESINFECTANTES QUÍMICOS: Las fórmulas de los
productos desinfectantes presentan grandes diferencias.
Es esencial, por lo tanto, que las diluciones se hagan de
acuerdo con lo recomendado por los fabricantes.
HIPOCLORITO DE SODIO: Es un agente químico barato
y fácil de adquirir, mata bacterias y virus. Tiene dos
inconvenientes importantes: se deteriora y es corrosivo.
CLORAMINA: Es más estable que el hipoclorito de sodio.
Sin embargo, debe protegerse de la humedad, la luz y el
calor excesivo. Puede obtenerse en forma de polvo o de
tabletas.
DESINFECCIÓN POR FROTACIÓN CON UN PRODUCTO QUÍMICO
La frotación con un desinfectante adecuado es un procedimiento aceptable en el
caso de superficies (mesas, etc.) y de salpicaduras de sangre. Cuando éstas son
visibles, se empezará por derramar desinfectante sobre la superficie; luego se
retirará la mezcla de sangre y desinfectante. El hipoclorito de sodio (lejía) es el
desinfectante más indicado.
AGENTES QUÍMICOS
La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actúan:
- Concentración: Varía con el tipo de agente y de
microorganismo, pues una misma concentración del agente
puede producir un efecto diferente en distintos
microorganismos.
- Tiempo: Los microorganismos no son susceptibles a un
agente en la misma forma, por lo que no todos los
microorganismos mueren al mismo tiempo.
- PH: Afecta tanto a los microorganismos como a los
agentes químicos.
Alcoholes
Yodo
Antisépticos Agentes catiónicos,
aniónicos y anfóteros
Órgano mercuriales
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Cloro y compuestos
clorados
Desinfectantes y/o Aldehídos
Esterilizantes Oxido de etileno
Compuestos fenólicos
Ácidos y álcalis
CLASIFICACION DE DESINFECTANTES
Basados en las diferencias existentes entre los desinfectantes en uso, se estableció
tres niveles de acción microbicida, cuyo reconocimiento servirá de fundamento para
establecer los procedimientos de desinfección efectiva en cada laboratorio.
Los términos que se define son: alto nivel, nivel intermedio y bajo nivel de
desinfección.
A. DESINFECCIÓN DE ALTO NIVEL
Algunos instrumentos o materiales no resisten la exposición al calor y es
necesario someterlos a desinfección utilizando agentes químicos. Los
desinfectantes de alto nivel se diferencian de los demás por su capacidad
esporocida, siendo su principal desventaja el largo tiempo de exposición que
debe tener el material (hasta 24 horas). Este método requiere de técnicas de
limpieza rigurosa para reducir al máximo la contaminación microbiana de los
instrumentos y eliminar residuos orgánicos que inactivan los desinfectantes.
B. DESINFECCIÓN DE NIVEL INTERMEDIO
Los desinfectantes de nivel intermedio no son capaces de destruir las esporas
bacterianas, pero tienen la capacidad de inactivar el bacilo tuberculoso, que
es más resistente a los germicidas en solución acuosa que las bacterias
vegetativas comunes. También son efectivos contra los hongos (esporas
asexuadas, pero no siempre clamidosporas secas o esporas sexudas) y
contra los virus con cubierta lípidica de tamaño mediano y algunos virus sin
cubierta lípidica de tamaño pequeño.
C. DESINFECCIÓN DE BAJO NIVEL
Los desinfectantes de bajo nivel son aquellos que no tienen capacidad para
actuar sobre las esporas bacterianas, el Mycobacterium tuberculosis, o los
virus no lipídicos de tamaño pequeño. Pueden ser útiles en la práctica por
tener una acción rápida sobre las formas vegetativas comunes de las
bacterias y varios tipos de hongos, así como sobre los virus de tamaño
mediano y con cubierta lipídica.
Algunos de estos desinfectantes, a mayor concentración, pueden elevar su
acción microbicida al nivel intermedio, como los yodóforos y fenoles. En
cambió, otros no tienen esta propiedad.
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CARACTERÍSTICAS DE ALGUNOS DESINFECTANTES
CLASE CARACTERÍSTICAS
Glutaraldehído Solución Esporocida, bactericida, tuberculicida, tóxico, solución
Acuosa activada activada inestable. Fecha de expiración 14 días desde
su activación.
Peróxido de Hidrógeno Esporocida, sol. En uso estable hasta 6 semanas,
estabilizado tóxico para ojos y vía oral, menos tóxico para piel.
Escasa inactivación por materia orgánica.
Formaldehído + Alcohol Esporocida, tóxico, volátil. Emanaciones nocivas.
Yodo + Alcohol Acción rápida, corrosivo, inflamable. Irrita la piel,
mancha
Alcohol Acción microbicida rápida, excepto esporas
bacterianas y algunos virus resistentes. Volátil,
inflamable. Seca e irrita la piel.
Compuestos de Cloro Acción rápida, inactivado por materia orgánica.
Corrosivo, irrita la piel.
Compuestos de Fenol Estable, corrosivo, irritante para la piel. Escasa
inactivación por materia orgánica.
Yodóforos Algo inestables, escasa irritación de la piel. Corrosivo.
Poco irritante, inactivado por jabón y compuestos
Compuestos Amonio aniónicos, absorbido por telas. Soluciones diluidas o
Cuaternario antiguas permiten el crecimiento de Bacterias Gram
Negativas.
Poco irritante, muy inactivadas por materia orgánica,
Compuestos Mercuriales débilmente bactericidas.
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NIVEL DE AGENTES QUÍMICOS
Clase Concentración Nivel de Actividad
Glutaraldehído Sol. acuosa 2% Alto
Peróxido de hidrógeno 6 – 10% Alto
Formaldehído + Alcohol 8% + 70% Alto
Formaldehído Sol. Acuosa 3 – 8% Alto a Inter.
Yodo + Alcohol 0.5 – 1% + 70% Intermedio
Alcohol 70% Intermedio
Compuestos de Cloro 0.1% Intermedio
Compuestos de Fenol 0.5 – 3% Inter. a Bajo
Yodo, Sol. Acuosa 1% Intermedio
Yodóforos 0.007 – 0.015%** Intermedio
Compuestos Amonio Cuaternario 0.1 – 0.2% Bajo
Hexaclorofeno 1% Bajo
Compuestos Mercuriales 0.1% - 0.2% Bajo
LAVADO DE MANOS
PROCEDIMIENTO CORRECTO
1. Acercarse al lavatorio, sin permitir que el
uniforme toque el lavadero durante el método
de lavado.
2. Quítese los anillos, reloj, pulsera o
acostumbrarse a usar bien arriba de la
muñeca.
3. Abrir la llave del agua, regular el flujo (para
que no se disperse) y temperatura (tibia).
4. Mójese las manos, tomar la pastilla de jabón,
enjabonarse bajo el chorro de agua
frotándose vigorosamente con el jabón las
manos, muñecas, hasta la parte media del
antebrazo; manteniendo las manos bajas en
relación al antebrazo y codo, con las manos
enjabonadas lavar la llave del agua.
5. Enjuagar el jabón y guardar sin tocar la
jabonera.
6. Por medio del frotamiento enérgico produzca espuma, realizar frotamiento
firme y movimientos circulares de: antebrazo, muñeca, palmas, dorso, cada
dedo, cada área interdigital. Limpiar las uñas, mínimo una vez al día antes de
comenzar a trabajar.
7. Enjuagarse en sentido distal: antebrazo, muñeca y manos; manteniendo las
manos por debajo del antebrazo. Enjuagar la llave del caño al tocarla.
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8. Repetir los pasos 4, 5 y 6 (volver a repetir según el
grado de contaminación).
9. Enjuáguese en sentido proximal
individualmente dejando correr el agua
de los dedos a la muñeca y antebrazo,
quedando con la mano y antebrazo por
encima del codo. Con una toallita se
secará con golpecitos suaves las manos
muñecas y antebrazos.
10. Cerrar la llave del caño.
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CONCEPTOS BÁSICOS
Asepsia: Ausencia de microorganismos patógenos.
Microorganismos Patógenos: Es causante de enfermedad.
Contaminación: Presencia de agentes infecciosos vivos en la superficie del cuerpo,
prendas de vestir o artículos sucios (no constituye infección).
Infección: penetración y desarrollo o multiplicación de un agente infecciosos en el
organismo de una persona o animal.
Enfermedad infecciosa: Enfermedad clínicamente manifiesta del hombre
resultados de una infección.
Asepsia médica: Normas ideadas para reducir el número de transmisión de
microorganismos patógenos, ej: lavado de manos.
Desinfección: proceso por el que se da muerte a microorganismos patógenos pero
no necesariamente a sus esporas, aplicado sobre un objeto inanimado (inerte).
Desinfectante: Sustancia empleada para la desinfección, ej: alcohol yodado,
sablón.
Antisepsia: Proceso de lisis o inhibición del crecimiento bacteriano sobre la
superficie de tejidos vivos.
Antiséptico: Sustancia empleada para la antisepsia. Por lo general su uso es
inocuo en las personas ej: alcohol 70° agua oxigen ada.
,
Espora: Microorganismos que en determinadas circunstancias producen una
especie de cápsula que le permite pasar por una fase de inactividad, que más tarde
en situaciones adecuadas recuperan su actividad, ej: Clostridium tetan, causante del
tétanos.
Limpieza: Es la remoción mecánica de toda materia extraña en el ambiente, en
superficies y objetos utilizando para ello el lavado manual o mecánico. Normalmente
se usa agua y detergente para este proceso. El propósito de la limpieza es disminuir
el número de microorganismos a través de arrastre mecánico y no asegura la
destrucción de éstos.
Bactericida: Sustancia química que elimina todas las bacterias, patógenas y no
patógenas, pero no necesariamente las esporas bacterianas.
Bacteriostático: Sustancia química que previene el crecimiento de bacterias, pero
no necesariamente las destruye. En muchas ocasiones la diferencia entre
bactericida y bacteriostático únicamente depende de las condiciones de aplicación:
tiempo, temperatura, pH.
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PRACTICA N°03
MEDIOS DE CULTIVO: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIÓN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores
de crecimiento y otros componentes, preparados en el
laboratorio, que suministran los compuestos necesarios
para el desarrollo de los microorganismos. Algunas
bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi
cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan
medios especiales y existen algunas que no pueden crecer
en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los
distintos tipos de medios de cultivo varían según las
necesidades de los microorganismos objeto de estudio,
pero todos han de cumplir los siguientes requisitos:
- Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del
microorganismo que se siembra.
- Han de mantenerse estériles hasta el momento de