1. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA
MANUAL
MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
APLICADA
Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA
Mg. EN GERENCIA DE SERVICIOS DE SALUD
LIMA – PERÚ
2010

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA
PROLOGO
La Universidad Inca Garcilaso de la Vega, está empeñada en realizar importantes
innovaciones en la concepción y práctica educativa con el propósito de brindar a sus
alumnos una formación profesional más competitiva, que haga posible su ingreso
con éxito al mundo laboral, desempeñándose con eficacia y eficiencia en las
funciones que les tocará asumir.
El marco referencial está dado por los cambios significativos de la sociedad
contemporánea, expresados en la globalización y los nuevos paradigmas del
conocimiento, de la educación y la pedagogía así como los retos del mundo laboral.
Uno de los medios para el logro de nuestros propósitos lo constituye el MANUAL DE
PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA el cual ha sido concebido como un material
educativo que va ha servir para afianzar conocimientos, desarrollar habilidades y
destrezas, así como orientar la autoeducación permanente. por ello se ubica como
un material de lectura independiente, sirve de información y recreación, desempeña
un papel motivador, se orienta a facilitar la lectura comprensiva, a ampliar
conocimientos en otras fuentes, crear hábitos y actitudes, así como a desarrollar
destrezas para el procesamiento de información, adquisición y generación de
conocimientos.
El presente Manual, constituye material de apoyo al desarrollo de la asignatura y
está organizado en dos unidades: Unidad I: Microbiología Generalidades, Unidad II:
Microbiología Aplicada comprende: Microbiología Clínica, Microbiología Alimentaria,
Microbiología en la Industria Farmacéutica y Cosmética y de un Trabajo de Campo.
Los alumnos deben leer detenidamente cada práctica, antes de su realización, para
una mejor comprensión en la observación del fenómeno biológico de cada
microorganismo en estudio. Además debe realizar diagramas de flujo de lo
observado el cual será revisado por el profesor responsable de cada grupo de
práctica.
El autor agradece anticipadamente la(s) crítica(s) o sugerencia(s) que puedan tener
los lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo.
Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA
DOCENTE DE MICROBIOLOGÍA
1 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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INDICE
PRÓLOGO 01
INDICE 02
INTRODUCCIÓN 04
RESULTADO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO 06
UNIDAD II: MICROBIOLOGÍA APLICADA 07
2.1 MICROBIOLOGÍA CLÍNICA 08
PRACTICA N°
07
Aislamiento e Identificación de Staphylococcus y Streptococcus. 08
PRACTICA N°
08
Bacilos Gram Negativos de Importancia Medica 24
PRACTICA N°
09
Hemocultivo y Coprocultivo 36
PRACTICA N°
10
Urocultivo, Recuento de Colonias, Antibiograma. 44
2.2 MICROBIOLOGÍA ALIMENTÁRIA 53
PRACTICA N°
11
Análisis Microbiológico de Productos Lácteos 54
- Preparación y Dilución de las Muestras de Alimentos
- Numeración de Microorganismos Aerobios Mesófilos Viables.
- Identificación de Patógenos.
PRACTICA N°
12
Análisis Microbiológico de una Muestra de Agua 61
- Preparación y Dilución de la Muestra
- Numeración de Coliformes - Determinación del Numero Más Probable (NMP).
- Identificación de Patógenos.
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2.3 MICROBIOLOGÍA EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA Y COSMÉTICA 65
PRACTICA N°
13
Monitoreo de Ambientes Superficies y Personal. 66
PRACTICA N°
14
Control Microbiológico de Crema de Baba de Caracol 70
PRACTICA N°
15
Control Microbiológico de Envases. 73
PRACTICA N°
16
Control Microbiológico de Lápices Labiales 74
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 77
ANEXO III: ESQUEMA DE RESULTADOS DE MICROBIOLOGÍA APLICADA 79
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INTRODUCCIÓN
La Microbiología es la ciencia encargada del estudio de los organismos
microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos
(ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Son
considerados Microbios todos los seres vivos microscópicos consistentes en una
sola célula, es decir unicelulares, así como aquellos que forman agregados celulares
en los cuales todas las células son equivalentes. Los microorganismos pueden ser
Eucariotas (Las células poseen núcleo), tales como los hongos y los protistas, o
Procariotas (células carentes de núcleo), como las Bacterias y los Virus (Aunque los
virus no son considerados seres vivos estrictamente hablando).
El Químico Farmacéutico y Bioquímico, es el profesional universitario de las Ciencias
Médicas con formación científica, tecnológica y humanística, con capacidad
gerencial, ejecutiva y de liderazgo. Así mismo altamente capacitado para poder
ejercer profesionalmente en los campos de la Industria Farmacéutica e Industria
Cosmética siendo Jefe de Control de Calidad, del Laboratorio de Análisis
Clínicos y Bioquímicos ejerciendo la Microbiología Clínica y del Laboratorio de
Bromatología realizando los Controles Microbiológicos a los Alimentos.
Hoy en día el Profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico es el profesional
responsable de la producción de los medicamentos y de los cosméticos de calidad,
seguros y eficaces y para lograr este objetivo el control microbiológico se considera
de gran importancia, ya que en estos productos se pueden presentar las condiciones
necesarias para la multiplicación de microorganismos capaces de deteriorar al
producto o, lo que es peor, afectar la salud del consumidor.
El cuidado de los alimentos y la industrialización de los mismos se ha convertido en
una ciencia y cada vez más se estudia e investiga la forma de mejorar la calidad. Día
a día surgen nuevas técnicas, nuevos tipos de envases, nuevos aditivos, nuevos
conservadores, etc. Esto ha llevado al establecimiento de normas, al desarrollo de
métodos y sistemas de control, que aseguren la inocuidad de los mismos. Para
lograr este objetivo el Químico Farmacéutico y Bioquímico, realiza los Controles
Microbiológicos donde cuantifica e identifica los microorganismos presentes en los
alimentos.
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Las infecciones intrahospitalarias cada vez más constituyen un serio problema de
salud pública, ya sea por su efecto sobre la salud de los pacientes, como por los
costos que este problema implica. Esto hace, que en el país se estén aunando
esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevención y control, orientados
a enfrentar este problema. Por lo que el Medico debe basar su diagnóstico en
evidencias disponibles, como son los aspectos epidemiológicos, y la importante
contribución del Laboratorio de Microbiología, que además de permitir el
diagnóstico etiológico, orienta el manejo clínico terapéutico del paciente.
El estudiante de Microbiología de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y
Bioquímica de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega, en el futuro será el
profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico, quien con los conocimientos
presentes en este manual estará en la capacidad de poder afrontar y resolver con
criterio los problemas presentados ya sea en la Jefatura de Control de Calidad de
una Industria Farmacéutica ó Cosmética, como en un Laboratorio Clínico
Microbiológico ó un Laboratorio Bromatológico.
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RESULTADO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
Nombre: _______________________ Código: ___________________
Lote: __________________________ Fecha de Análisis: ___________
Fecha de Ingreso: ____________________ N° An álisis: ______________
de
Resultados:
Microorganismos Aeróbios
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
24 Horas
48 Horas
72 Horas
Microorganismos Patógenos
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
24 Horas
48 Horas
72 Horas
Resultado:
Hongos y Levaduras
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
3er Día
5to Día
Resultado:
Observaciones:
Fecha
___________________ ________________________
Analista Jefe de control de Calidad
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UNIDAD II: MICROBIOLOGÍA APLICADA
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2.1 MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
PRACTICA N°07
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS Y
STREPTOCOCCUS
STAPHYLOCOCCUS
Los estafilococos constituyen un grupo de microorganismos esféricos, Gram
positivos, agrupados en forma de racimos, tetradas o aisladas, inmóviles no
esporulados. El género Staphylococcus pertenece a la familia Micrococcaceae. La
especie patógena del género es Staphylococcus aureus. Este microorganismo
puede formar parte de la flora nasal del hombre y también es causante de diversos
procesos infecciosos tales como impétigo, forunculosis, abscesos, intoxicaciones
alimentarias e infecciosas particularmente graves como bacteriemias. La especie
patógena produce una enzima llamada coagulasa, que puede estar libre (free-
coagulase) o ligada (clumping factor).
Algunas especies de Staphylococcus coagulasa negativas, tales como
Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus considerados
hasta hace relativamente poco tiempo como no patógenos, vienen teniendo un papel
relevante en cuadros infecciosos bacteriémicos y urinarios.
MATERIALES
- Placas petri con agar sangre de carnero.
- Placas petri con agar Dnasa.
- Placas petri con agar manitol salado.
- Placas petri con agar tripticasa soya agar.
- Tubos con caldo plasma.
- Asas de platino.
- Juego de colorantes para Gram.
- Láminas portaobjetos simples.
- Caldo nutritivo en tubo.
- H2O2 al 3%.
- Lápiz graso
- Aceite de inmersión.
PROCEDIMIENTO
- Hacer un frotis en las láminas portaobjetos limpios y desengrasados a
partir de la muestra problema, realizar la coloración de Gram.
- Observar con el microscopio utilizando objetivos de inmersión, destacando
la forma de agrupación y la coloración que toma la bacteria.
- Realizar la siembra en estría de la muestra problema en los siguientes
medios de cultivo: Agar sangre de carnero, agar manitol salado y agar
TSA. Llevar a la Incubadora a 37ºC durante 24 – 48 horas.
- Realizar una siembra en forma circular o elíptica en la placa que contiene
agar Dnasa. Llevar a la Incubadora a 37ºC durante 24 – 48 horas.
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PRUEBA DE LA CATALASA
Determina la presencia de la enzima catalasa, esta enzima descompone el peróxido
de hidrógeno en agua y oxígeno.
PROCEDIMIENTO
- Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas
y colocar sobre un portaobjetos limpio.
- Agregar una gota de H2O2 al 3% usando un gotero o una pipeta pasteur.
- No es necesario mezclar el cultivo con el H2O2.
- Observar una inmediata efervescencia (formación de burbujas) lo que indica
una prueba positiva, de lo contrario se considera la prueba negativa.
- Desechar el portaobjetos colocándolo en un desinfectante.
NOTA: Al coger la colonia con el asa de siembra tener cuidado de no llevar algo del
medio de agar sangre debido a que la catalasa presente en los eritrocitos, puede
dar resultados falsos positivos. No invertir el orden del método porque pueden
producirse resultados de falsos positivos.
PRUEBA DE LA COAGULASA
Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por
acción de la enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulación del
plasma. El resultado final es la formación de un coágulo de fibrina.
- Prueba en lámina (detecta factor de aglutinación o coagulasa ligada).
- Prueba en tubo (detecta coagulasa libre y ligada).
La prueba de coagulasa en tubo es definitiva, y la prueba de coagulasa en lámina
puede ser usada como una técnica de tamizaje rápida para la identificación de S.
aureus. Todas las pruebas negativas en lámina deben repetirse utilizando la
técnica en tubo.
NOTA: El plasma humano no debe ser usado a menos que haya sido
cuidadosamente probado de no contener algún agente infeccioso, capacidad de
coagulación e inhibidores.
PRUEBA EN LÁMINA
La prueba de la coagulasa en lámina es un método únicamente presuntivo. Por esa
razón todos los resultados negativos o retardados (más de 20 segundos) deben ser
confirmados por la prueba en tubo.
PROCEDIMIENTO
- Preparar una suspensión densa de la colonia en agua destilada o
solución fisiológica mezclando bien para homogenizar.
9 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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- Si hubiera autoaglutinación no continuar y realizar la prueba en tubo.
- Agregar una gota de plasma y mezclar con movimientos circulares.
- Observar la formación de aglutinación o precipitado dentro de 20
segundos.
- Todas las pruebas negativas y positivas retardadas (20 a 60 segundos)
debe confirmar-se con la prueba en tubo.
NOTA
Es una prueba bastante rápida y económica pero del 10 a 15 % de S. aureus
pueden dar un resultado negativo, por eso, todos los resultados negativos deben
repetirse utilizando la técnica en tubo.
PRUEBA EN TUBO
PROCEDIMIENTO
- Transferir una colonia aislada del agar sangre de carnero a 0,5 mL de
plasma reconstituido (en un tubo de vidrio estéril de 13 x 100).
- Girar el tubo suavemente para lograr la suspensión del organismo. No
agitar.
- Incubar la mezcla a 35 – 37° (en baño maría de p referencia) por 4
C
horas; observar si hay formación de coagulo inclinando lentamente el
tubo.
- Observar cuidadosamente si hay formación de coagulo inclinando
lentamente el tubo (sin agitar) en intervalos hasta 4 horas. Cualquier
grado de coagulación es una prueba positiva.
- La mayoría de los S. aureus formarán coagulo dentro de una hora.
- Si es negativa a las 4 horas seguir incubando hasta el día siguiente a
temperatura ambiente. Esto es recomendado porque un pequeño número
de cepas de S. aureus pueden requerir más de cuatro horas para la
formación del coágulo. Considerar que Staphylococcus produce
fibrinolisina, la cual puede lisar el coagulo.
- Si son estafilococos coagulasa negativos, realizar las pruebas de
resistencia a la polimixina B y novobiocina (disco de 5ug) para tener una
identificación presuntiva. S. saprophyticus es resistente a la novobiocina y
S. epidermidis es resistente a la polimixina B.
10 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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STAPHYLOCOCCUS
Aislamiento e identificación: Staphylococcus aureus
COLONIAS:
MEDIOS A. S. A. M. S. T. S. A. DNASA
TAMAÑO
FORMA
PIGMENTO
HEMÓLISIS
MANITOL
DNASA
CATALASA
COAGULASA
GRAM
Aislamiento e identificación: Staphylococcus epidermidis
COLONIAS:
MEDIOS A. S. A. M. S. T. S. A. DNASA
TAMAÑO
FORMA
PIGMENTO
HEMÓLISIS
MANITOL
DNASA
CATALASA
COAGULASA
GRAM
Aislamiento e identificación: Staphylococcus saprophyticus
COLONIAS:
MEDIOS A. S. A. M. S. T. S. A. DNASA
TAMAÑO
FORMA
PIGMENTO
HEMÓLISIS
MANITOL
DNASA
CATALASA
COAGULASA
GRAM
11 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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INTERPRETACIÓN
COLORACIÓN GRAM
Gram positivos en racimos
Estructura pared celular Gram positivo
AGAR SANGRE DE CARNERO
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
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AGAR MANITOL SALADO
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus (+)
AGAR DNASA
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
13 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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PRUEBA DE LA COAGULASA
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
PRUEBA DE LA CATALASA
Staphylococcus aureus: catalasa positivo
Staphylococcus epidermidis: catalasa positivo
Staphylococcus saprophyticus: catalasa positivo
Streptococcus: catalasa negativo
Micrococcus: aerobio estricto, presenta colonias amarillas anaranjadas, catalasa
positivo, oxidan, no fermenta. Los micrococos son muy abundantes en la naturaleza,
viéndose aislado más frecuentemente del polvo y agua. A menudo se encuentra en
utensilios y equipos usados en alimentación que no han sido adecuadamente
limpiados e higienizados.
14 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE LAS ESPECIES DE
STAPHYLOCOCCUS COMÚNMENTE AISLADOS EN INFECCIONES
PIGMENTO DE HEMOLISINA ESTAFILO FACTOR DE
COLONIA (*) COAGULASA AGLUTINACIÓN
S. aureus
Subespecies aureus
+ + + +
S. epidermidis - (d) - -
S. haemolyticus d (+) - -
S. lugdunensis d (+) - (+)
S. saprophyticus
Subespecies d - - -
saprophyticus
S. schleiferi, Schleiferi - (+) - +
S. warmeri d (d) - -
RESISTENCIA A RESISTENCIA A ORNITINA ACIDEZ DE
NOVOBIOCINA POLIMIXINA B DESCARBOXILASA MANITOL
S. aureus
Subespecies aureus
- + - +
S. epidermidis - + (d) -
S. haemolyticus - - - d
S. lugdunensis - d + -
S. saprophyticus
+ - - d
Subespecies saprophyticus
S. schleiferi, Schleiferi - - - -
S. warmeri - - - d
+ 90% o más especies o cepas positivas.
- 90% o más especies o cepas negativas.
d 11% - 89% de especies o cepas positivas
(+) Reacción retardada
(*) En agar sangre de carnero
+ Zona amplia de hemólisis dentro de 24 – 36 horas
(+) Hemólisis retardada, de una zona moderada a amplia dentro de las 48 – 72 Horas
(d) No hay hemólisis o es retardada
- No hay hemólisis o hay una zona muy angosta (≤ 1mm) dentro de las 72 horas.
Algunas de las cepas pueden producir in ligero color verdusco o marrón en agar
sangre de carnero.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué factores son los qué condicionan la patogenicidad del
Staphylococcus aureus, en comparación con otras especies de
estafilococos?
2. ¿Qué enfermedades produce el Staphylococcus epidermidis y
Staphylococcus saprophyticus?
15 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS
INTRODUCCIÓN
Constituye un grupo de microorganismos esféricos o lanceolados, gram positivos,
inmóviles no esporulados, en cadena cortas o largas. En el género Streptococcus
están comprendidas especies patógenas para el hombre tales como Streptococcus
pyogenes y Streptococcus pneumoniae, existen portadores asintomáticos de ambas
especies.
Streptococcus pyogenes es causante de faringitis, amigdalitis, otitis, escarlatina,
erisipela e impétigo, la fiebre reumática y la glomérulo nefritis pueden ser secuelas
de la infección. En placas de agar sangre produce hemólisis tipo beta y puede ser
identificada mediante su sensibilidad a la bacitracina. La especie Streptococcus
pneumoniae se presenta en forma de diplococo, posee una cápsula nítida asociada
con la virulencia del germen, en medio enriquecido como el agar sangre, las cepas
encapsuladas de neumococos forman colonias mucoides y son virulentas para los
ratones se identifican por su solubilidad en sales biliares, por metabolizar la inulina y
por su sensibilidad a la optoquina. Produce hemólisis tipo alfa, carácter que
comparte con los Streptococcus alfa hemolíticos o Streptococcus viridans.
Son los agentes causales más frecuentes de neumonía lobar, sinusitis y meningitis.
Las especies del género Enterococcus son bacterias que se encuentran en el
intestino y algunas veces pueden producir infecciones fuera del intestino. Se
identifican por su crecimientros en medios de concentración alta de cloruro de sodio.
MATERIALES
- Placas petri con agar sangre de carnero.
- Asas de platino.
- Juego de colorantes para Gram.
- Láminas portaobjetos simples.
- Caldo nutritivo en tubo.
- H2O2 al 3%.
- Lápiz graso
- Aceite de inmersión.
- Bajalengua.
- Hisopos de algodón estéril.
PROCEDIMIENTO
1. Tome un hisopo estéril y un bajalengua.
2. Pida al compañero que se eligió para la práctica que mire hacia arriba, abra la
boca y saque la lengua.
3. Con el bajalengua deprima la lengua para tener una mejor visión de la faringe
4. Con el hisopo, toque a manera de raspado la parte posterior de la faringe, las
amígdalas y el pilar posterior del velo del paladar.
5. Retire el bajalengua y el hisopo con el exudado de la faringe.
16 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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6. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen de esterilidad
inocule con el hisopo el material del exudado faríngeo en una placa con agar
sangre y siembre con una asa con la técnica de estría múltiple.
7. Queme por la parte de en medio su hisopo para que no sea nuevamente
utilizado
8. Incube a 37ºC durante 24 horas.
9. Transcurrido las 24 horas, saque las cajas de la incubadora y encienda el
mechero
10. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar sangre
11. Tiña con la técnica de Gram
12. Observe con aceite de inmersión el frotis
13. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis realice las pruebas
correspondientes.
Para cocos Grampositivos en cadena de acuerdo a la hemólisis
- Tomar la cepa sospechosa de estreptococos e inocular la en una placa de
agar sangre en un cuadro de aproximadamente 1.5 cm por 1.5 cm por
estriación masiva.
- En medio del cuadro estriado con la cepa colocar el disco con la Bacitracina
Incubarlos a 37ºC durante 24 horas.
- En las placas de agar sangre observar las colonias pequeñas y rodeadas de
hemólisis, sin destapar la placa observar al microscopio con objetivo de 5X la
zona de hemólisis tipo beta (destrucción total de los hematíes) y la hemólisis
tipo alfa.
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE (NEUMOCOCO) Y ENTEROCOCCUS
MATERIALES
- Cultivo de neumococos en caldo nutritivo
- Cultivo de neumococo en agar sangre y discos de Optochin
- Cultivo de enterococcus sp. En agar sangre
- Cultivo de enterococcus sp. En caldo con NaCL 6.5%
- Láminas portaobjetos simples.
- Solución de sales biliares al 10%
- Caldo esculina.
PROCEDIMIENTO
- Hacer frotices a partir de las colonias en agar sangre, colorearlos con gram.
- Observar con lentes de inmersión la morfología del diplococo lanceolado gram
positivo, típico del neumococo.
- Observar la discreta y uniforme turbidez en el medio líquido.
- En la placa de agar sangre observar la colonia pequeña aplanada y rodeada de
un color verdoso por la hemólisis alfa.
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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA
- En las placas de agar sangre con discos de optoquina, observar halo de
ausencia de desarrollo con el neumococo.
- En el medio con inulina constatar la formación de acidez por metabolismo de
este carbohidrato.
- Observar el aclaramiento ión del cultivo líquido al añadirse sales biliares al
10%.
STREPTOCOCCUS
Aislamiento del estreptococo beta hemolítico del grupo A.
MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE
Tamaño
Forma
Hemólisis
gram
Tipificación:
MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE
Bacitracina
Hemólisis
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Aislamiento
MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE
Tamaño
Forma
Hemólisis
gram
Tipificación:
MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE
Optoquina
Sales biliares
Inulina
Gram (tinta china)
* Para Enterococcus, interpretar el desarrollo en el caldo con NaCL 6.5%
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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA
PRUEBA DE LA ESCULINA EN MEDIO CON BILIS
Para determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucósido esculina en
esculetina y glucosa, en presencia de bilis.
PROCEDIMIENTO
- Inocular el cultivo en estudio haciendo estrías sobre la superficie del pico de
flauta o de la placa de agar bilis esculina.
- Incubar a 35 – 37° hasta 72 horas.
C
- Se puede controlar periódicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de
informar como negativo.
LECTURA
Positivo: En tubo: Ennegrecimiento difuso en el agar inclinado.
En placa: Se observa un halo negro o marrón alrededor de las colonias en la
placa.
Negativo: No se produce ennegrecimiento del medio o ennegrecimiento de
menos de la mitad del tubo después de 72 horas de incubación.
TOLERANCIA AL CLORURO DE SODIO
Para determinar la facultad de un organismo de desarrollar en presencia de una
concentración de 6.5 % de cloruro de sodio.
PROCEDIMIENTO
- Inocular en el caldo TSB con cloruro de sodio un cultivo de 18 - 24 horas de
incubación.
- Incubar a 35 – 37° por 24 horas.
C
- Se puede controlar periódicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de
informar como negativo.
LECTURA
Positivo: Hay desarrollo bacteriano
Negativo: No se observa crecimiento en el caldo
Observar el oscurecimiento del agar indicando si hubo hidrólisis de la esculina y el
crecimiento en el caldo con cloruro de sodio. Con estas pruebas tenemos dos
identificaciones presuntivas posibles: así todos los enterococos (95%) son esculina
positivos y crecen en medios con 6.5% de cloruro de sodio produciendo acidez. 5%
– 10% de Streptococcus del grupo viridans son bilis esculina positivos.
19 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

22. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA
INTERPRETACIÓN
COLORACIÓN GRAM
Cocos gram positivos en cadena
AGAR SANGRE
Beta hemólisis Alfa hemólisis
Estreptococo pneumoniae hemólisis parcial
Gama hemólisis no hay cambios
20 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

23. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
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Hisopado de las amígdalas
En la placa se observa beta hemólisis
posible streptococcus pyogenes mezclada
con la alfa normal y gama hemólisis colonias
de los estreptococcus viridans que viven
normalmente en la garganta.
Estreptococo pneumoniae
Estreptococo pyogenes
Sensibilidad a la bacitracina
Estreptococo pneumoniae
Sensibilidad a la optoquina
21 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

24. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
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Enterococo faecalis Caldo S F
Los enterococos en presencia de azida de sodio crecen, fermentan la dextrosa
formando acido el cual vira el indicador de pH de un violeta a un color amarillo
marrón.
Agar Bilis Esculina
Los enterococos crecen en presencia
de sales de bilis. Mientras crecen,
hidrolizan la esculina del medio de
cultivo apreciándose un color negro
en el agar.
Hidrólisis de la esculina
En medio bilis esculina
Caldo con NaCL 6.5%
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PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE COCOS GRAM
POSITIVOS, EN CADENA CATALASA NEGATIVOS
BILIS CRECIMIENTO
NACL 6.5% HEMÓLISIS
ESCULINA 10°
C 45°
C
Enterococcus + + + + α, β, η
Streptococcus -a -b - V α, β, η
Lactococcus + V + V α, η
Vagococcus + + + V α, η
a De los Streptococcus viridans 5% - 10% son bilis esculina positivas
b Algunos Streptococcus beta hemolíticos crecen en 6,5% de NaCL
n No hemolítico
+ ≥ 95% reacciones positivas
- ≤ 5% reacciones positivas
V Reacciones variables
Hisopado Faríngeo
CUESTIONARIO
1. ¿Recomendaría usted, a un paciente que presenta un cuadro de
faringoamigdalitis se haga un examen de secreción faríngea, con el fin de
descartar la presencia de Streptococcus pyogenes?
23 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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PRACTICA N°
08
BACILOS GRAM NEGATIVOS DE IMPORTANCIA MEDICA
Los bacilos Gram negativos conforman un grupo compuesto por múltiples familias
bacterianas entre las que destacan la familia Enterobacteriaceae, Vibrionaceae,
Pseudomonadaceae y otras.
La familia Enterobacteraceae constituye el conjunto mayor y más heterogéneo de
bacilos Gram negativos. Se han descrito al menos 27 géneros y 7 grupos entéricos
con más de 110 especies. Estos géneros se han clasificado en función de la
homología del ADN, propiedades bioquímicas, reacciones serológicas,
susceptibilidad a bacteriófagos específicos y patrones de sensibilidad a los
antibióticos. Son bacilos Gram negativos, facultativos que fermentan glucosa, son
oxidasa negativos, reducen nitratos a nitritos y no requieren ni su desarrollo se
acrecienta con NaCl. Pueden ser móviles o inmóviles, estas características sirven
para diferenciar miembros de esta familia de otros bacilos Gram negativos
facultativos fermentadores de glucosa pertenecientes a la familia Vibrionaceae.
Son organismos ubicuos de distribución mundial, se encuentran en el suelo, agua,
vegetación y formando parte de la microbiota normal del intestino de casi todos los
animales incluyendo al humano. Las Enterobacterias pueden dar cuenta del 80% de
los aislamientos clínicamente significativos de bacilos Gram negativos en
laboratorios de microbiología clínica y del 50% de todos los aislamientos
clínicamente significativos, así mismo pueden causar aproximadamente de un 60 a
70% de enteritis bacteriana aguda.
Si bien muchas Enterobacterias han sido implicadas en caso de diarrea solo se han
establecido claramente como patógenos entéricos miembros de los géneros
Escherichia, Salmonella, Shigella y Yersinia. Excepto las especies de Shigella, que
rara vez causan infecciones fuera del tracto gastrointestinal, la mayoría de las
Enterobacterias son capaces de producir una variedad de infecciones
extraintestinales. Sin embargo, un pequeño número de especies incluyendo
Enterobacter aerógenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoneae, Proteus mirabilis y Serratia marcescens dan cuenta de la gran
mayoría de las infecciones.
Las infecciones del tracto urinario (mas del 70%) principalmente cistitis son las más
comunes, heridas por infecciones respiratorias, de heridas, del torrente sanguíneo y
del SNC.
MATERIALES
Placas con Agar Mac Conkey Tubos con TSI
Placas con Agar EMB Tubos con LIA
Placas con Agar XLD Tubos con Caldo Triptófano
Placas con SSAgar Tubos con MIO, MR-VP
Placas con TCBS Reactivo de Kovacs
Tubos con caldo Selenito Reactivos para tinción de Gram
Tubos con citrato de Simmons Asas y aro de siembra
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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
GÉNEROS ESCHERICHIA, KLEBSIELLA ENTEROBACTER, CITROBACTER,
SALMONELLA, SHIGUELLA, YERSINIA, PROTEUS
INTRODUCCIÓN
Las enterobacterias son bacilos gram negativos no esporulados, aeróbicos y
anaeróbicos facultativos que habitan en el tracto intestinal. Algunos géneros de esta
familia son patógenos para el hombre, en cambio otros condicionan su
patogenicidad al hábitat que colonizan. La identificación de las diferentes especies
de enterobacterias se realizan estudiando la actividad metabólica del
microorganismo sobre los diversos sustratos (carbohidratos, proteínas, etc) en la
practica se estudiarán las especies de mayor importancia medica.
Comprenden muchos géneros entre ellos: Escherichia que se encuentra en la flora
normal intestinal; en ocasiones puede ser agente de diarreas (E. Coli
enteropatógenos, toxigénicos, enteroinvasivo, enterohemorrágico, etc.) y en otras,
agente de infecciones en el tracto urinario y genital. Así mismo los géneros
Klebsiella y Citrobacter se encuentran como flora normal y son patógenos
condicionales.
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
El reconocimiento de las diversas especies de enterobacterias se realiza observando
las reacciones metabólicas, por los cambios de color del medio sobre los substratos
contenidos en dichos medios diferenciales.
SALMONELLA, SHIGELLA, YERSINIA
El género Salmonella constituye un amplio grupo de bacterias patógenas como por
ejemplo: Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A y B, que producen la fiebre
tifoidea y fiebres paratíficas: Salmonella enteritidis que se encuentra en los
animales, al infectar al hombre produce gastroenterocolitis.
El género Shigella produce disentería bacilar que se caracteriza por diarrea con
moco y sangre. Esta bacteria sólo afecta al hombre. En el género Yersinia, una
especie importante es Yersinia enterocolítica que es causante de adenitis aguda e
ileítis terminal (simulando apendicitis), y diarrea en niños. Por una enterotoxina
termoestable se cree que es la causa de la diarrea; el reservorio de este género son
los roedores y el ganado porcino.
Estos tres géneros tienen la misma característica morfológica (bacilos Gram
negativos) la Shigella carece de flagelos por lo cual es inmóvil en cambio la
Salmonella presenta flagelos lo mismo que la Yersinia.
Los tres géneros son anaerobios facultativos, desarrollan en medios como en el agar
Mac Conkey, y SSagar a una temperatura de 37° exc epto la Yersinia que
C,
desarrolla mejor a 28°
C.
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Yersinia pestis es la causa de la peste bubónica que es primariamente una
enfermedad de los roedores. El hombre se infecta al ser picado por la pulga de los
roedores infectados, desarrollándose una infección primaria ganglionar y hay una
forma neumónica más grave porque el contagio es directo de persona a persona.
Esta bacteria es de forma coco bacilar, desarrolla a 30° en la fase lisa produce
C,
una cápsula y forma colonias viscosas.
PROCEDIMIENTO
- Hacer un frotis en las láminas portaobjetos limpios y desengrasados a
partir de la muestra problema, realizar la coloración de Gram.
- Observar con el microscopio utilizando objetivos de inmersión, destacando
la forma de agrupación y la coloración que toma la bacteria.
- Realizar la siembra en estría de la muestra problema en los siguientes
medios de cultivo: Agar Mac Conkey, SSAgar, EMB, XLD. Llevar a la
Incubadora a 37ºC durante 24 – 48 horas.
- Realizar la siembra en tubos de diferenciación bioquímica: Agar citrato,
TSI, LIA, Indol, Movilidad, Medio MR – VP. Llevar a la Incubadora a 37ºC
durante 24 – 48 horas.
DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA
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INTERPRETACIÓN
COLORACIÓN GRAM
Gram negativos bacilos Estructura pared celular Gram negativo
Flagelos en peritrico propio del Proteus
Flagelos en peritrico propio de la
Salmonella.
Proteus mirabilis swarming
TSI
1 2 3 4 5 6
1 Sin inocular
2 Pseudomona aeruginosa
3 Shiguella sonnei
4 Salmonella typhi
5 Escherichia coli
6 Proteus mirabilis
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MANERA DE REALIZAR LA LECTURA EN LAS PLACAS Y TUBOS
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31. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
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AGAR XLD
Escherichia coli Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae
Salmonella enteritidis Shiguella sp. Proteus vulgaris.
AGAR MAC CONKEY
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae
Salmonella typhi Shiguella sonnei Proteus vulgaris
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32. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
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AGAR EMB
Escherichia coli Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae
Salmonella typhi Shiguella sonnei Proteus vulgaris
SALMONELLA SHIGUELLA AGAR
Yersinia enterocolítica Salmonella Escherichia coli
Proteus vulgaris TSA
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TSI
CITRATO
SIM
VP
UREA
Proteus mirabilis Proteus vulgaris
Salmonella paratyphi - A Salmonella typhimurium
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Shiguella sonnei Klebsiella pneumoniae
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE VIBRIONES
INTRODUCCIÓN
Los vibriones tienen las siguientes características: bacilos curvos o rectos. Gram
negativos, son móviles por la presencia de flagelos polares y pueden crecer en los
medios para las enterobacterias, son oxidasa positivos y anaeróbios facultativos. En
este género la especie Vibrio cholerae es causante del cólera epidémico en el
hombre. La enfermedad más devastadora de todos los tiempos por el cuadro de
diarreas potencialmente muy severa que produce. En la séptima pandemia se
considera al Vibrio cholerae, biotipo El tor, principalmente el serotipo Ogawa. En la
octava pandemia se considera al Vibrio cholerae 0139, como el agente causal.
Otras especies de Vibrio pueden causar también diarrea y son: Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio fluviales. Las especies asociadas a infecciones
extraintestinales como Vibrio alginolyticus.
En la práctica estudiaremos al Vibrio cholerae, agente del cólera, que se adquiere
por la ingesta de alimentos y aguas contaminadas. La mortalidad es elevada si no se
restablece de inmediato el equilibrio hidroelectrolítico. Para su aislamiento se utiliza
muestras de heces o hisopados rectales.
Las muestras que llegan al laboratorio deben sembrarse de inmediato. Los
hisopados rectales pueden incluirse en el medio de transporte de Cary Blair. El
cultivo directo en el Agar TCBS (tiosulfato, citrato sales biliares y sacarosa) y como
enriquecimiento en el medio agua peptonada alcalina. Después de la incubación por
24 horas las colonias de Vibrio cholerae son circulares de borde entero, de color
amarillo (sacarosa positivas) en el agar TCBS.
La identificación bioquímica de Vibrio cholerae se realiza por las siguientes
características: en el medio TSI pico de flauta ácido en el fondo sin gas, sin H2S,
lisina positivo, indol positivo, rojo de metilo positivo, voges proskauer negativo.
Citrato positivo y ureasa negativa. Desarrolla en caldo peptonado con 0% de NaCL.
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INTERPRETACIÓN
Vibrio cholerae
Gram Negativo
Detección de especies de Vibrios potencialmente patógenas al camarón
Vibrio cholerae
Vibrio Vibrio
Agar TCBS alginolyticus parahaemolyticus
Vibrios en
TCBS Agar
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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS NO FERMENTADORES
PSEUDOMONAS
Este género comprende bacilos rectos Gram negativos con flagelo polar, no
formadores de esporas, carente de cápsula y aerobios. De las numerosas especies
de este género, las más importantes han sido relacionadas a infecciones en el
hombre, como patógenos oportunistas en huéspedes comprometidos; son
Pseudomona aeruginosa, Pseudomona mallei, Pseudomona pseudomallei,
Pseudomona cetácea y Pseudomona maltophilia. De éstas, la primera es la
especie más frecuente, se asocia con enfermedades neoplásicas o en quemaduras
severas. También pueden ser causa de infecciones oculares, osteomielitis, sepsis
post quemaduras, infecciones en vías urinarias y respiratorias.
La mayoría de cepas de Pseudomonas aeruginosa son identificadas en base a su
olor característico, morfología colonial, producción de piocianina y fluoresceína,
desarrolla fácilmente en medios como Agar Nutritivo, Agar Mac Conkey y muchas
cepas desarrollan fácilmente en medios selectivos conteniendo cloruro de
hexadeciltrimetilamonio (Agar Cetrimida).
Examen macroscópico:
Observar las características de la colonia de Pseudomona aeruginosa en Agar Mac
Conkey y Agar Nutritivo, percibir el olor y el color.
Examen microscópico:
Coloración Gram, visualizar su tamaño, forma y reacción al gram.
Características Bioquímicas:
Observar el desarrollo del microorganismo en el medio TSI, Citrato de Simmons, LIA,
Indol, Movilidad.
Reacción de la oxidasa:
Positivo: Viraje de color hacia el azul -violeta (con el reactivo N, N, N, N, tetrametil-p-
fenilenediamina) o púrpura (con el reactivo N, N, dimetil-p fenilenediamina) después
de 10 - 15 segundos. Negativo: No hay viraje de color (Foto Nº 23) Alternativamente
una solución de reactivo al 0.5% puede ser goteado directamente sobre la colonia.
Demostración del pigmento:
Con una pipeta depositar cloroformo en el tubo con caldo nutritivo con desarrollo
bacteriano, luego agitar y dejar reposar. Observar en el fondo del tubo el pigmento
azul que es soluble en el cloroformo.
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INTERPRETACIÓN
Gram Negativo Colonias en TSA
MEDIO HUGH LEIFSON
MEDIO PARA OXIDO
FERMENTACIÓN
E. coli es fermentador
Pseudomonas es oxidador
E. coli Pseudomonas
Agar Cetrimida
Pseudomonas aeruginosa en Agar
Cetrimida Colonias verde-amarillentas,
fluorescentes bajo luz UVA de 366 nm
(linterna MICROKIT VMT050).
Prueba
De la
Oxidasa
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PRACTICA N°
09
HEMOCULTIVO Y COPROCULTIVO
HEMOCULTIVO
INTRODUCCIÓN
La sangre de los individuos sanos es estéril. Una afluencia repentina de bacterias es
habitualmente eliminada del torrente circulatorio en un periodo de tiempo corto, de
minutos a horas, excepto cuando existe una infección masiva o está presente un
foco intravascular infectado. Básicamente cuando las bacterias se multiplican a
tasas que exceden la capacidad del sistema reticuloendotelial para eliminarlas se
habla de BACTERIEMIA. El término FUNGEMIA se utiliza para designar la
presencia de hongos en sangre.
La invasión del torrente sanguíneo se produce desde:
- Un foco primario, vía sistema linfático al sistema vascular.
- Entrada directa: por infecciones intravasculares (por ejemplo endocarditis),
o a través de dispositivos médicos contaminados como catéteres y agujas.
Siempre que exista una razón para sospechar una bacteriemia se debe practicar el
cultivo de la sangre, ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el
diagnóstico por este procedimiento. El aislamiento de un microorganismo en los
hemocultivos es trascendente porque establece el diagnóstico etiológico de la
bacteriemia y permite elegir el tratamiento más eficaz.
DIAGNÓSTICO
Es el aislamiento del microorganismo en la sangre mediante el cultivo de esta y
aporta una valiosa información a la hora de elegir el tratamiento antimicrobiano
adecuado.
INDICACIONES
- Fiebre alta, aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar
con hipotermia y deterioro general.
- Shock no explicado.
- Infecciones localizadas.
- Leucopenia, leucocitosis o trombopenias no relacionadas con procesos
hematológicos.
MÉTODOS
- Cuantitativos, nos daría el número de bacterias por mililitro de sangre.
- Cualitativo, indica simplemente la presencia de bacterias en sangre, es el
que se realiza de forma rutinaria.
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OBTENCION DE MUESTRA DE SANGRE PARA CULTIVO
- El momento óptimo de obtención de la muestra para hemocultivo es justo antes
del pico mas alto de fiebre, sin embargo esta situación ideal no es frecuente.
Alternativamente las muestras pueden obtenerse de acuerdo con el caso. Por Ej.
- BACTEREMIAS CONTINUAS: En cualquier momento, Ej. Endocarditis.
- BACTEREMIAS INTERMITENTES: Una hora antes del pico febril, Ej.
Brucelosis.
- Guía para la cronología y el número de cultivos de sangre en adultos:
- En sepsis: Se debe tomar dos a tres muestras de lugares diferentes en un
lapso de diez minutos.
- En endocarditis aguda: Obtener tres muestras de tres lugares diferentes
en un lapso de 1 a 2 horas.
- En endocarditis subaguda: Obtener tres muestras de tres lugares
diferentes a intervalos de al menos quince minutos. Si el cultivo es
negativo a las 24 horas, obtener tres muestras más.
- En fiebre de origen desconocido: Obtener dos o tres muestras de lugares
diferentes con diferencia de una hora o más entre una y otra muestra. Si el
cultivo es negativo a las 24 horas, obtener dos a tres muestras más.
- Obtención de muestra de sangre mediante uso de jeringa: ver Practica N° del
01
Manual de Microbiología.
La proporción entre el volumen de sangre obtenida y el volumen del caldo de cultivo
debe estar en una relación de 1:5 - 1:10. El volumen de sangre dependerá de la
edad del paciente; por cada venopunción se recomienda:
- Adultos: 10 - 30 ml
- Niños: 1 - 5 ml
- Lactantes: 1 - 2 ml
- Neonatos: 0.5 - 1 ml
INOCULACIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE AL MEDIO DE CULTIVO
- Utilizar un medio bifásico o monofásico para este procedimiento.
- Desinfectar el diafragma del frasco de hemocultivo con alcohol de 70% ó
alcohol yodado.
- Inocular la muestra de sangre al frasco con medio de cultivo a través de
diafragma. Debe realizarse inmediatamente de obtenida la muestra para
evitar que se coagule.
- Mezclar el contenido del frasco inclinándolo suavemente dos o tres veces. En
caso que se use el medio bifásico, bañar la fase sólida con la sangre.
- Descartar la aguja y la jeringa en un contenedor resistente a las punturas. No
volver a introducir la aguja en su funda.
- Limpiar la tapa del frasco. Etiquetar el frasco apropiadamente indicando
además el número de hemocultivo.
37 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

40. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
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SIEMBRA PRIMARIA DE MUESTRA DE HEMOCULTIVO
OBJETIVO
Describir la técnica de siembra primaria de hemocultivo para el aislamiento de
bacterias causantes de infecciones del torrente sanguíneo.
CAMPO DE APLICACIÓN
Se aplica para el aislamiento bacteriano a partir de hemocultivos en el
diagnóstico bacteriológico de infecciones del torrente sanguíneo.
MATERIALES Y EQUIPOS
a) Estufa de 35 – 37°
C
b) Mechero Bunsen o Cabina de Flujo laminar
c) Jeringa estéril
d) Guantes de látex
e) Alcohol al 70%
f) Contenedor de material contaminado
g) Medios de cultivo