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PCR

  • 3. AGRADECIMIENTOS: INSTITUTO DEL CÁNCER (SOLCA) CUENCA Departamento de Patología Dr. Jorge Ugalde Dra. Rocío Murillo Subdepartamento de Biología Molecular
  • 4. AGRADECIMIENTOS: UNIVERSIDAD DE CUENCA Laboratorio de Biología Molecular Lcda. Lourdes Viñansaca
  • 5. MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE LAS DIANAS PCR TÉCNICAS ISOTÉRMICA S MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SONDA AMT AANBS ADH TECNOLOGÍA INVASORA/ENZI MA DE ROTURA GRCL RCL MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SEÑALES DNA RAMIFICA DO ENSAYO DE CAPTURA DE HÍBRIDOS
  • 6. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA) Es una tecnología de amplificación que permite mediante procesos in vitro mediados por enzimas generar copia ilimitadas de un segmento determinado de DNA
  • 7. Técnica de gran sensibilidad y especificidad Esperanza en el tratamiento Era de los Diagnósticos Moleculares Hito en la Biotecnología
  • 8. OBJETIVOS GENERALES: • Conocer el procedimiento a seguir para efectuar la PCR. ESPECÍFICOS: – Identificar la secuencia de acontecimientos requeridos para este fin. – Integrar la teoría con la práctica. – Valorar su utilidad.
  • 9. CONOCIMIENTOS PREVIOS • DNA • ¿Qué es? • Forma – Configuración Espacial – Configuración Óptica • Estructura – Nucleótidos • Funciones – – – – Replicación Almacenaje Expresión Variación
  • 13. PCR
  • 15. REACTIVOS Muestra de DNA dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dC TP • 20-200μM • Concentraciones equimolares de los 4 DNA Polimerasa (Taq) Catalizadores • MgCl2 Primers u Oligonucleótidos Iniciadores • 0,5-1μM por c/100μL Buffer o Tapón
  • 19. ETAPAS PREPCR • Recepción de la muestra • Procesamiento de la muestra • Purificación de la muestra • Extracción del DNA • Cuantificación del DNA PCR • Preparación del coctel • Ciclos POSTPCR • • • • Tinción de la muestra Siembra Corrida electroforética Revelado
  • 20. PRE-PCR RECEPCIÓN DE LA MUESTRA PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Purificación de la muestra Extracción del DNA Cuantificación del DNA
  • 22. FUENTES DE ADN Enfermedades Infecciosas Patologías Oncológicas Patologías Hereditarias Características propias Muestras de tejido Biopsias del tumor L.A. ó vellosidades coriónicas + ADN leucocitario de padres genéticas Células nucleadas (sangre periférica)
  • 25. CICLO [2n ó (1+e)n] CALOR • Desnaturalización FRÍO • Acoplamiento o Anillamiento CALOR • Extensión
  • 29. CUIDADOS DE LA PCR Lugar propio Instrumental exclusivo, estéril (lavado con H2O destilada) Reactivos apropiados • Conservación: -20°C • > concentración que la requerida para la reacción. Uso de guantes por el manipulador
  • 30. POST-PCR ELECTROFORESIS • Separación en placa por tamaño y carga eléctrica. • REVELADO: – Radioautografía • Bromuro de etidio – Fluorescencia • Lámpara de luz UV
  • 31. PCR PCR Clásica RT-PCR ó PCRTI PCR Anidada PCR Múltiple qPCR PCR en Tiempo Real PCR in situ Revelado Óptico por Fluorescencia TERF Guías Moleculares
  • 32. PCR TRANSCRIPATASA INVERSA (PCR-TI) RNA • TI Termolábil (VMATI)Thermus Thermophilus DNAc • DNA Polimerasa Termoestable (Taq Polimerasa)
  • 33. PCR ANIDADA (>sensibilidad y especificidad) • 2 pares de cebadores y 2 rondas de PCR. • DESVENTAJAS: Contaminación en transferencia. • SUSTIUÍDA: Hibridación del DNA con sonda.
  • 34. PCR MÚLTIPLE • Co-amplificación en mismo tubo. • REQUERIMIENTOS: un – Cebadores con temperaturas de amplificación semejantes. – Ausencia de complementariedad entre los cebadores. • VENTAJA: Determinación de múltiples dianas en una reacción. • DESVENTAJA: Baja sensibilidad.
  • 35. PCR CUANTITATIVA DETERMINANTES  Eficiencia de la Amplificación • Preparación de la muestra • Procedimientos de purificación del ácido nucleico • Presencia de inhibidores • Actuación del termociclador PCR COMPETITIVO (PCRc ) • Co-amplificación de secuencias diferentes en el mismo tubo que compartan los cebadores. • COMPETIDORES: – Tamaño similar – Composición de bases igual a la diana • CÁLCULO: – Yc=Ic(1+e)n – Yt=It(1+e)n – Yc/Yt=Ic/It
  • 36. PCR EN TIEMPO REAL • Amplificación y detección de DNA simultánea en el mismo tubo. • REQUERIMIENTOS (REVELADO ÓPTICO POR FLUORESCENCIA): – Termocicladores de precisión óptica – Colorantes fluorescentes que se unen al DNA de doble hebra – Sondas de hibridación (especificidad)
  • 37. PCR EN TIEMPO REAL • REQUERIMIENTOS [REVELADO POR TRANSFERENCIA DE • REQUERIMIENTOS (REVELADO POR RESONANCIA DE GUÍAS FLUORESCENCIA MOLECULARES) (TERF)] – 2 sondas por c/cadena de DNA: 3’: donador y 5’: aceptador [proporcional a la magnitud del producto (Y)] – Sondas marcadas con fluoróforos en forma de horquilla.
  • 38. PCR EN TIEMPO REAL • VENTAJAS: – Reducción del tiempo para la entrega de resultados. – Menor contaminación (se obvia el procesamiento Post-PCR) – Aplicación cuantitativa.
  • 40. VENTAJAS DE LA PCR A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable. El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y analizar. Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
  • 41. DESVENTAJAS DE LA PCR Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb. Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro.
  • 42. UTILIDAD INGENIERÍA GENÉTICA • Clonación • Tecnologías de DNA recombinate • Análisis y cuantificación de la expresión genética (RNAm) DIAGNÓSTICO MOLECULAR: • Genética • Inmunología • Microbiología • Oncología TERAPIA GÉNICO-MOLECULAR • Proyecto Genoma Humano • Detección de mutaciones • Dx. Prenatal y preimplantación MEDICINA LEGAL ARQUEOLOGÍA
  • 43. UTILIDAD EN INMUNOLOGÍA Determinación de mutaciones: • HLA
  • 44. UTILIDAD EN MICROBIOLOGÍA Diagnóstico etiológico y epidemiológico (gold estándar) Genotipificación: • • • • Virulencia Resistencia a fármacos Mutaciones Epidemiología: VIH, VHB, VHC, Citomegalovirus, Virus de Epstein Barr, VPH.
  • 46. BIBLIOGRAFÍA: • • • • • • Kindt, T.; Goldsby, R.; Osborne, B. Inmunología de Kuby. VI Edición. Editorial Mc GrawHill. México D.F.-México. 2007. Lodish, H. et all. Biología Celular y Molecular. 5ta. Edición. Editorial Panamericana. Buenos Aires - Argentina. 2011. Redondo, O. Conceptos generales de Biología Molecular. Extracción de DNA y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Hospital Universitario de Guadalajara. [Actualizado 25 Abr 2007. Accesado 20 May 2013] Disponible en: http://www.aebm.org/jornadas/guadalajara/EXTRACCI%D3N%20DE%20DNA%20Y%20PC R.pdf Regueiro J., López C., González S., Martínez E. Inmunología. IV Edición Revisada. Ed. Médica Panamericana. Madrid - España. 2012. Rojas, W., Anaya J., Aristizábal B., Cano L., Gómez L., Lopera D. Inmunología de Rojas. XV Edición. Corporación para la Torres, A.; Baca, B. Reacción en Cadena de la Polimerasa. Centro de Investigaciones Microbiológicas. Instituto de Ciencias. Universidad de Puebla. . [Accesado 20 May 2013] Disponible en: http://www.elementos.buap.mx/num23/pdf/16.pdf