1. Análise de Risco Ambiental
do Milho GM: Manejo da
Resistência de Insetos (MRI)
José Magid Waquil
jmwaquil@gmail.com
INOVADEFESA/RIT DA/CNPq
Sete Lagoas, MG.

2. Protocolo de Cartagena
• Biossegurança de OGMs vivos;
• Países desenvolvidos e em desenvolvimento;
• Métodos científicos para avaliar:
– biossegurança pré-liberação;
– monitoramento pós-liberação;
• Uso seguro e sustentável da tecnologia e
• Consenso da necessidade da avaliação de Risco

3. Principais Aspectos
1) Hibridização dos OGM com seus parentes selvagens;
2) Desenvolvimento de resistência de pragas ao OGM;
3) Mudança de status de pragas secundárias;
4) Alterações na composição dos OGMs

4. Principais Aspectos (cont.)
5) Redução de biodiversidade;
6) Efeito sobre polinizadores;
7) Efeito sobre inimigos naturais; e
8) Efeitos sobre organismos do solo
- incluindo os decompositores

5. Análise de Risco de OGMs
• É uma iniciativa internacional para desenvolver
uma abordagem científica rigorosa visando avaliar
os riscos potenciais das culturas OGMs resistentes
a artrópodes sobre as espécies alvo e não-alvo .
• Adaptação de testes abordando a análise de risco
que seja aplicada internacionalmente dentro dos
conceitos da toxicologia e da ecologia (meio
ambiente).

6. Objetivos:
• Formulação e avaliação de hipóteses de risco,
claras, usando o máximo de dados disponíveis
para a tomada de decisões consistentes em cada
etapa da avaliação.
• Espera-se com a ARP-OGM dar subsídios para
as agências de regulamentação que estão
desenvolvendo suas próprias análises e para
harmonizar as exigências regulatórias entre os
diferentes países e regiões do mundo.

7. Determinação do Risco
Sistema de produção
Dose de cultura, fenologia,
Eficácia Manejo, etc.
Risco = f (perigo, exposição)
História de Dinâmica populacional
Resistência da espécie-alvo,
da espécie Mobilidade da espécie
Sub-estrutura

8. Risco Ambiental mais Iminente
Quebra da Funcionalidade – Resistência
Praga Resistente: “Praga com capacidade de
sobreviver em resposta a uma pressão de seleção -
por ex. um inseto resistente a um inseticida”.
Biótipo – indivíduo ou população de inseto
distinguível da sua espécie por critérios outros que
não o morfológico – por ex. capacidade parasítica.

9. Omoto&Maia

10. Omoto&Maia

11. Omoto&Maia

12. Omoto&Maia

13. Bases para a Análise:
• Curva de Mortalidade
• linha Probit-Log
• Dose Letal Média
• – suficiente para matar 50% população
• Concentração Letal Média
• na qual se observa 50% mortalidade.

14. Omoto&Maia

15. Bioensaio: distribuição de frequência
Mort. (%) Freqüência
3,0 20
9,0 40 700
15,0 70
600
20,0 100
30,0 300 500
40,0 550
400
50,0 600
60,0 550 300
70,0 300 200
85,0 150
93,0 100 100
96,0 90 0
98,0 85 0 20 40 60 80 100
99,0 80
100,0 78

16. Bioensaio: mortalidade acumulada
Dose (mg) Mortal. (%)
0,0 0,0 Curva de Dose-Mortalidade (%)
100
1.690,0 3,0
90
2.856,1 9,0 80
Porcentagem (%)
3.712,9 15,0 70
4.826,8 30,0 60
50
5.550,8 50,0 40
6.274,9 70,0 30
8.157,3 85,0 20
10
10.604,5 93,0 0
13.785,8 96,0 0 5000 10000 15000 20000 25000
17.921,6 98,0 Dose (mg)
23.298,1 99,0

17. Bioensaio: log da dose/mortalidade
Log dose Mortalidade (%)
3,22789 3,0
3,33000 5,0
Dose - Mortalidade (%)
100 3,45577 10,0
90 3,56972 15,0
80 3,68366 25,0
Mortalidade (%)
70
3,74436 40,0
60
50 3,79760 60,0
40 3,91155 88,0
30 3,98000 93,0
20
4,02549 95,0
10
0 4,09000 97,0
3,00 3,50 4,00 4,50 4,13943 98,0
Log Dose 4,20000 99,0
4,25338 99,5
4,36732 99,9

18. Bioensaio: curva de mortalidade
Log Dose Probit
3,2279 3
LC50=5626,18 mg 3,3300 3,4
Log-Probit 3,4558 3,9
8 3,5697 4,2
3,6837 4,6
7
3,7444 4,8
6
3,7976 5.0
5 3,9115 5,6
Probit
4 3,9800 5,8
3 4,0255 6,1
4,0900 6,5
2
y = 4,0764x - 10,3 4,1394 6,7
1
R² = 0,99 4,2000 6,9
0 4,2534 7,2
3,00 3,50 Log Dose 4,00 4,50
4,3673 7,5

19. Genética da Resistência
Omoto&Maia

20. Genética da Resistência: dominância
Omoto&Maia

21. Genética de populações
• Equilíbrio de Hardy-Weinberg
–(p+q)2= p 2 (SS)+ 2pq(Ss)+ q 2(ss)= 1 onde:
– q= freqüência do Susceptível
– p= freqüência do Resistente
• Condições do equilíbrio
–População infinita e cruzamentos aleatórios
–Não há seleção, migração, mutação de alelos
–Meiose normal - gametogênese ao acaso
• Interações gênicas

22. Omoto&Maia

23. Evolução da Resistência: frequência
Premissas : monogênica, dialética (S e R) e autossômica
SS RS RR
SS RS RR
SS RS RR
__________________
Fonte: Georghiou (1983)

24. Evolução da Resistência: dominância

25. Omoto&Maia

26. Omoto&Maia

27. Frequência Crítica
Omoto&Maia

28. Tamanho da Amostra
Necessário para detectar pelo menos um indivíduo resistente
P(x1) = 1 – P(x=0)
10000
P(x=0) = (1 – f)n
0.1% R na pop.
Onde:
Sample Size (n)
1000
n = tamanho da amostra
f = freqüência de Resistente 1% R na pop.
1 - P(x1) = (1 – f)n 100
10% R na pop.
n log (1 – f) = log [1 - P(x1)]
10
log [1 - P(x1)] 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
n= Probability of detection (%)
log (1 – f)
Roush & Miller (1986)

29. Omoto&Maia

30. Alta Dose Operacional
Depois que se conhece o alelo R, a alta
ideal seria aquela concentração que mata
100% dos indivíduos heterozigotos (RS).
Antes de se conhecer o alelo R, o EPA-US:
“alta dose” é a concentração da toxina
equivalente a 25 vezes a concentração LC99
para a praga-alvo.

31. Bioensaio: CL de Toxinas Bt/LCM
Probabili Cry 1 A(b) Cry 1F
-dade Intervalo confiança Intervalo confiança
(%)
CL (95%)
CL (95%)
(g / cm2 ) Inferior Superior (g / cm2) Inferior Superior
01 1,05 0,20 2,97 2,48 1,47 3,69
05 7,04 2,37 13,98 5,45 3,66 7,40
10 19,37 8,81 32,39 8,30 5,94 10,75
50 689,81 459,55 1241,0 36,46 31,09 42,33
90 24561,0 8823 129291,0 160,21 129,54 209,24
95 67622,0 20041 491001,0 243,75 188,94 338,21
99 452007,0 92947 6027744,0 535,58 380,15 839,82

32. Índice de Inibição no Ganho Peso
LC50=689,81ng/cm2 LC50=36,46 ng/cm2
=91,61% inibição peso =89,81 % inibição peso
Índice de inibição da LCM/Cry 1A(b) Í ndice de I nibição da LCM /Cry 1F
90 100
80 90
70 80
Arcsin % Inibição
Arcsen % Inibição
60 70
60
50
50
40
40
30
30
y = 16,08x + 27,562 y = 15,8x + 46,606
20 20
R2 = 0,7594
R2 = 0,7435
10 10
0 0
0 1 2 3 4 0 1 2 3
Log dose Log Dose

33. Não-Preferência LCM para milho Bt
Não-Bt Bt
DKB 330
DKB 330 YG
86,00  4,27% 11,00 ± 4,47%
LCM neonatas, 24 h após infestação

34. Recuperação de Larvas Pequenas
No. vivas=66 Sobrevivência = 62,86%
No. total= 105 Após 10 dias de exposição
800
Peso Inicial
700 2a pesagem
Peso de pupa
600
500
Peso (mg)
400
300
200
100
0
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101
População

35. Evolução da Resistência Depende

36. Fatores que Afetam
a Evolução da Resistência
• Eventos de Bt disponíveis
• Área cultivada com a cultura transgênica
• Espécies-alvo
• Impacto sobre os sobreviventes inverno
• Definição: pragas primárias e secundárias
• Impacto da expressão e dose

37. Manejo da Resistência

38. Manejo da Resistência/Insetos (MRI)
• Manejo da Resistência(Inseto): Esforço para
adiar ou prevenir a adaptação de espécies-praga à
pesticida pela preservação de genes de
susceptibilidade na população;
• MR padrão: combinação da estratégia de
alta dose da toxina (25X DL99) com área de
refúgio (área cultivada com não Bt);
• Pirâmide de genes: combinação de mais de
uma toxina de diferentes receptores.

39. Área de Refúgio - AR
• Objetivo da AR – permitir desenvolvimento
de insetos susceptíveis em quantidade
suficiente para reduzir a chance de
cruzamento entre insetos resistentes e
Reduzir a pressão de seleção
• Distância da AR – deve estar no máximo
800 metros de qualquer planta de milho Bt.
• Tamanho da área de refúgio –
– Fórmulas empíricas
– Através de Modelo (computador)

40. Manejo da Resistência Milho Bt
• Tamanho da Área de refúgio:
– 10% da área de milho para uma toxina
– 5% da área de milho para duas toxinas
• Distância da Área de Refúgio:
– 800 m dispersão da mariposa no campo
• Cultivar da Área de Refúgio:
– Deve ter mesmo ciclo
– Características semelhantes à cultivar Bt.
– Preferencialmente o híbrido isogênico

41. Funcionamento do Refúgio
Dispersão suficiente para Área de refúgio para
garantir cruzamentos produzir SS
entre RR ou RS X SS
10% área:
90% área produção SS
Sobrevivência
RR ou RS Perda potencial:
34% X 10%= 3,4%
Bt Refúgio
800 m
Milho-Bt Refúgio: milho não-Bt com
___________________
Adaptado de Omoto&Maia mesmo ciclo e porte

42. Refúgio Estruturado I
800 m
• Campo separado
“Refúgio
• qual tamanho? externo”
• qual distância?
800 m 800 m
• Área definida com 800 m
plantas não-Bt, dentro “Refúgio dentro
do campo com OGM da lavoura Bt”
(faixas de plantas)

43. Refúgio Estruturado II/pivô-central
•Milho não-Bt no
•centro do Pivô “Refúgio central” 10% 800 m
“Refúgio
• Campo separado externo”
10%
800 m
800 m
• Área definida com “Refúgio em Pivô
plantas Bt e não-Bt, independente” Milho-Bt Milho
Milho-Bt
não-Bt
800 m

44. Refúgio no Saco/“mistura de semente”
• Mistura de sementes milho Bt e
não-Bt no mesmo saco e foi
aprovado nos EUA para 2012
•Dificuldades operacionais/Empresa
•Facilidade para o semeio/produtor
•Efetividade do uso do refúgio
•Distribuição uniforme do refúgio
•Inviabilidade controle químico
•Redução da área de refúgio
•Melhor distribuição IN na área
•Movimento de lagartas (+/-)

45. Pirâmide/Sequência de Genes
a – 75% mortalidade RS para cada toxina
b – 50% mortalidade RS para cada toxina
c – 50% + 75% mortalidade RS das toxinas Fonte: Roush (1998)

46. Monitoramento Pós-Liberação
Exemplo: Ostrinia nubilalis – ECB/EUA
Biomassa
Moralidade
________________________
Fonte: Siegfried et al 2008

47. Mortalidade da LCM em Cry 1F

48. Inibição da LCM em Cry 1F

49. Determinação do Perigo da Resistência
• Caracterização da população em risco
• História de resistência da espécie-alvo
• Variabilidade natural à toxina do Bt
• Frequência inicial do gene R ao Bt
• Efetividade potencial da toxina transgênica
• Qual é a Dose?

50. Fluxo Gênico:
o milho em referência

51. Fontes de misturas adventícias
1. Transferência de pólen entre plantas –
fluxo gênico
2. Misturas de sementes (contaminações)
3. Misturas de grãos nas operações de
colheita,transporte e armazenamento
4. Plantas voluntárias
Fonte: Commission of the European Communities, Recomendations of 23 July 2003

52. Fluxo Gênico
• Vertical: entre indivíduos da mesma espécie
1. Alógamas – menos de 5% de autofecundação
2. Autógamas – mais de 95% de autofecundação
3. Intermediárias – entre 5% e 95% de
autofecuandação
• Horizontal: entre indivíduos diferentes, distantes
geneticamente

53. Coexistência
Estratégia para que os produtores
agrícolas continuem a fazendo suas
escolhas prática utilizando
variedades convencionais, cultivares
transgênicos e cultivos orgânicos, de
acordo com as obrigações legais para
rotulação e padrões de pureza.
_________________________________________________________
Fonte: Commission of the European Communities, Recomendations of 23 July 2003

54. Características do Milho
• Planta monóica: inflorescência masculina (pendão) e
feminina (boneca) na mesma planta
• Liberação do pólen: dura em média 13 dias
• Pendão: produz em média de 25 milhões de grãos de pólen
• Alta competição para fertilização: 645 grãos de
pólen competem para fertilizar um único estilo-estigma (cabelo)
• Viabilidade no campo: aproximadamente 2 horas
• Polinização: predominantemente pelo vento
•
__________________________________
Fontes: Bignotto 2002 e Luna et al 2001

55. Polinização cruzada/milho
• Distância entre a lavouras
• Barreiras físicas
• Condições climáticas
• Velocidade do vento
• Topografia
• Sincronia das cultivares
• Arranjo espacial
__________________________________
• Fonte: Eastham & Sweet. IN: European Environmental Agency,
Environmental Issue Report 28, Capitulo 5.

56. Exemplos de Coexistência
1. Manutenção da pureza genética de linhagens elites
em programas de melhoramento
2. Manutenção da pureza genética de cultivares
crioulas
3. Em cultivos de milhos especiais não transgênicos
para consumo humano (“speciality maize”)
4. Em cultivos de milhos coloridos importantes na
alimentação de povos latino-americanos
5. Cultivo de milho “waxy” para a industria de amido

57. Isolamento Espacial no Milho
Resultados de 16 ensaios no
Canadá e de 40 ensaios nos
Estados Unidos
Gustafson et al. Crop Science 46:2133-2140, 2006.

58. Taxa de Cruzamento/Distância
Milho Soja
Indicador: resistência à herbicida
________________________________________
Fonte consultada: Siqueira et al.Cadernos de Ciência & Tecnologia, 21(1): 11-81, 2004

59. Regras de Coexistência: Milho-Bt
 CTNBio – Decreto 5.991 – 22/11/2005
 Liberação planejada – 20/07/2006
 Isolamento de 400 m ou 40 dias
 Liberação comercial – 16/08/2007
 Isolamento de 100 m
 20 m + 10 fileira milho não-Bt
 Híbrido de igual ciclo e igual porte

60. Obrigado!