新型コロナウイルスを高感度で検出する方法を作りました。検体の中に、ウイルスが２個以上あれば検出出来ます。早期確定診断は、重症化の抑制、他人への感染の阻止に役立つと思われます。

1. 新型コロナウイルス(COVID-19 )の高感度
検出システムの開発
[SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) Sequences]
つくば遺伝子研究所
http://www.tsukuba-genetech.com/

2. Data to support research and public health activities directed at the ongoing SARS-CoV-2 (Wuhan coronavirus) outbreak.
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/)
上記サイトに48種類のCovid19 ウイルスの全配列が Genbank (遺伝子銀行)に登録されています(2020年2月26日現在)。すべてをダウ
ンロードし、どのタイプのウイルスであっても検出できるように、PCRプライマーを設定しました。
Genebank RefSeq Gene region collection date Locality
MN908947 NC_045512 complete 1-Dec-19 China
MT019529 complete 23-Dec-19 China: Wuhan
LR757998 complete 26-Dec-19 China: Wuhan
MN996527 complete 30-Dec-19 China: Wuhan
MN996528 complete 30-Dec-19 China: Wuhan
MN996529 complete 30-Dec-19 China: Wuhan
MN996530 complete 30-Dec-19 China: Wuhan
MN996531 complete 30-Dec-19 China: Wuhan
MT019530 complete 30-Dec-19 China: Wuhan
MT019531 complete 30-Dec-19 China: Wuhan
MT019532 complete 30-Dec-19 China: Wuhan
LC522972 complete Jan-20 Japan
LC522973 complete Jan-20 Japan
LC522974 complete Jan-20 Japan
LC522975 complete Jan-20 Japan
LR757996 complete 1-Jan-20 China: Wuhan
MT019533 complete 1-Jan-20 China: Wuhan
MT039890 complete Jan-20 South Korea
MN988668 complete 2-Jan-20 China
MN988669 complete 2-Jan-20 China
LR757995 complete 5-Jan-20 China: Wuhan
MT093631 complete 8-Jan-20 China
MN938384 complete 10-Jan-20 China: Shenzhen
MN975262 complete 11-Jan-20 China
MT072688 complete 13-Jan-20 Nepal
MT049951 complete 17-Jan-20 China: Yunnan
MN985325 complete 19-Jan-20 USA: WA
MT039873 complete 20-Jan-20 China: Hangzhou
MN988713 complete 21-Jan-20 USA: IL
MN994468 complete 22-Jan-20 USA: CA
MN997409 complete 22-Jan-20 USA: AZ
MN994467 complete 23-Jan-20 USA: CA
MT007544 complete 25-Jan-20 Australia: Victoria
MT020880 complete 25-Jan-20 USA: WA
MT020881 complete 25-Jan-20 USA: WA
MT044258 complete 27-Jan-20 USA: CA
MT044257 complete 28-Jan-20 USA: IL
MT027062 complete 29-Jan-20 USA: CA
MT027063 complete 29-Jan-20 USA: CA
MT027064 complete 29-Jan-20 USA: CA
MT039888 complete 29-Jan-20 USA: MA
MT039887 complete 31-Jan-20 USA: WI
MT066175 complete 31-Jan-20 Taiwan
MT066176 complete 5-Feb-20 Taiwan
MT106052 complete 6-Feb-20 USA: CA
MT093571 complete 7-Feb-20 Sweden
MT106053 complete 10-Feb-20 USA: CA
MT106054 complete 11-Feb-20 USA: TX
48種類のCovid19

3. Covid-19 検出システム開発の戦略
• Genbankに登録されているCovid19の配列で、すべてのウイルスの種類に保存されている(共通の)
配列を検索する。
• 定量PCRを考慮に入れて、PCR産物(PCR反応で得られるDNA断片)が150塩基以下になるようにプ
ライマーをデザインする。
• ウイルスRNAから、先ず、cDNAを作る必要があるが、そのためのプライマー(ここでは、リバース
プライマーと呼ぶ)に、一本鎖として安定であることに配慮した、タグ配列を付加する。
• Covid19 を検出するための最初のプロセスは、検体からRNAを抽出し、逆転写酵素とリバースプラ
イマーを用いて、ウイルスRNAからcDNAを作る。
• こうして得られたウイルス由来の cDNA をタグともう一つのプイラマー(フォワードプライマー)を
用いて、通常のPCR 或いは、定量PCR法で、ウイルスRNAの存在を検出する。
• 次のスライドに、検出方法を模式的に示す。

4. Covid19 検出の流れ
RNA
抽出
リバースプライマー
5’ 3’
タグ配列(タグプライマー)
cDNA
RNA
タグ配列
5’3’
逆転写
フォワードプライマー
通常PCR
定量PCR
タグ配列(タグプライマー)は、鋳型と会合しやすいように、二次構造を取らないように設計し、且つ、
ほ乳類の配列とは相同性がないように設定
検体 RNA

5. Genbankに登録されているCovid19の全ての種類の配列に、共通している配列
GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGA
NC_045512 (MN908947: reference genome)
4124 4208
mer Tm GC PCR product
1-3L forward primer GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGT 26 71.6 50.0
85
1-3R reverse primer TCGCTAGCATTTCAGTAGTGCCACCAG 27 73.0 51.9
フォワードプライマー リバースプライマー
タグ
2720..8554
/gene="orf1ab"
/locus_tag="GU280_gp01"
/product="nsp3"
/note="former nsp1; conserved domains are: N-terminal
acidic (Ac), predicted phosphoesterase, papain-like proteinase, Y-domain, transmembrane domain 1 (TM1),
adenosine diphosphate-ribose 1''-phosphatase (ADRP); produced by both pp1a and
pp1ab"/protein_id="YP_009725299.1"
国立感染研究所が示したPCR領域と同じ領域

6. GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGTTTTAACTGCTGTGGTTATACCTACTAAAAAGGCTGGTGGCACTACTGAAATGCTAGCGA
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

7. Forward Primer: GTGGGTGATGTTGTTCAAGAGGGTGT

8. フォワードプイラマー/リバースプイラマーについて、Genbankに登録されている配列との相
同性を検索。 Covid19の配列を除けば、一つの登録配列でフォワードプイラマー/リバースプ
イラマーの双方が相同性を示すことはなかった。このことから、Covid19配列以外の配列を鋳
型とした、PCR産物が出来ないと判断される。

9. 前出のスライドで記載したように、in silicoで開発したシステムは、実際のCovid19RNAの検出が可能である
と思われる。
そこで、それを検証するために、Covid19のRNAゲノムの一部を化学合成し、それを鋳型として検出できる
かを調べた。
M DW 2000 200 20
500bp
100bp 110bp
[結果] : 本システムは20分子以上の Covid19 RNAが検出可能であることが判った。
M: 分子量マーカー
DW: 陰性コントロール(水)
2000: 2,000 分子のCovid19 RNA
200: 200 分子のCovid19 RNA
20: 200 分子のCovid19 RNA
110bp: Covid19由来PCR産物
Currently, the detection conditions are being under optimization

10. https://news.yahoo.co.jp/byline/yanagitaemmy/20200414-00172885/
上記のような報告がありました。コロナウイルス感染の確定診断はPCRで行われていますので、感染し
ていても、陰性の場合は、コロナ感染者とみなされません。陽性になるまでに、病状が進行したり、他
人にウイルスをうつすことも想定されます。極端な話ですが、ウイルス1個で感染がおこることもありま
す。
そこで、より高感度で、信頼性の高い検出システムを作るため、本システムの最適化を行いました。
その結果、次のスライドに示しましたように、感度を10倍に上げることが出来ました。具体的には、ウ
イルスRNAが2個(分子)あっても検出できるようになりました。

11. PCR 条件の最適化により、Covid19の検出感度の向上
M:分子量マーカー
C1: PCRでの陰性コントロール(水)
C2: RT-PCRでの陰性コントロール(水)
0: 0分子のCovid19 部分RNA
2: 2分子のCovid19 部分RNA
20: 20分子のCovid19 部分RNA
200: 200分子のCovid19 部分RNA
2000: 2,000 分子のCovid19 部分RNA
110bp: Covid19由来PCR産物
PCR cycles:40
RT反応は、ヒトRNAの存在下で行っている。
M C1 C2 0 2 20 200 2000 M
110bp
結論: 改良した本システムはサンプル当たり2個(分子)のウイルスRNAを検
出することができる。感染早期に確定診断が可能で、早い段階での治療、隔
離が可能となる可能性がある。