PRACTICA No. 5
ESTRUCTURA DE LOS MICROORGANISMOS
IDENTIFICACION MICROBIANA
OBJETIVO
Dar a conocer al estudiante los diferentes métodos de laboratorio para la identificación
bacteriana, medios de cultivos, morfología macroscópica, morfología microscópica y técnicas
para la realización de frotis directos (extendidos de muestras clínicas), frotis indirectos
(extendidos a partir de cultivos), coloraciones simples y compuestas.
Paciente
Historia clínica y exploración
Localización de la infección
Estudio hematológico y Exámenes microbiológicos
Bioquímico
Imágenes diagnosticas: Métodos directos
RX, TC, RM Examen microscópico
Cultivo, identificación y antibiograma
Detección de antígenos específicos
Detección de DNA, RNA especifico
Métodos Indirectos
Pruebas serológicas en suero
DIAGNOSTICO ETIOLOGICO

Morfología macroscópica. Medios de cultivo
Las bacterias para su crecimiento deben tener las condiciones necesarias para desarrollar un
nuevo protoplasma, estos requerimientos están dados por:
- Medios de cultivo
- Atmosfera
- pH especifico
- Temperatura
- Tiempo suficiente para su reproducción
Todo material en el cual los microorganismos puedan reproducirse es un medio de cultivo, estos
medios se preparan sobre una sustancia o base llamada agar que se extrae de algas marinas al
que se puede adicionar sustancias nutritivas como Sangre de cordero, vitaminas, extracto de
levadura, cloruro de sodio, colorantes e indicadores,
Tipos de medios de cultivos:
1. Según la consistencia dada por la cantidad de agar:
- Solidos
- Líquidos y
- Semisólidos
2. Según el aporte nutritivo y la utilidad en el laboratorio:
- Básicos: Diseñados para el crecimiento y el mantenimiento de poblaciones bacterianas.
Los más comunes son: Tripticasa soya, agar nutritivo y Mueller Hinton.
- Enriquecidos: Medios altamente nutritivos compuestos por un medio básico y
suplemento nutritivo como sangre o hemoglobina.
- Selectivos: Específicos para bacterias que se desarrollan en presencia de compuestos
agregados al medio de cultivo, inhibiendo el crecimiento de otros.
- Selectivos diferenciales: A estos medios se adicionan colorantes o sustancias químicas,
más un indicador de pH, permitiendo la diferenciación de distintos tipos de bacterias y
la selección de diferentes géneros.
- Medios diferenciales: o pruebas bioquímicas. Son medios con diferentes sustratos
utilizados para conocer el comportamiento metabólico de las bacterias y poderlos
clasificar en género y especie.

Morfología microscópica. Coloraciones
Principales coloraciones utilizadas en microbiología
- Coloraciones simples: Tinción de las bacterias por la aplicación de una sola solución
colorante. Se utiliza para observar morfología.
- Coloración compuesta o diferencial: Pone de manifiesto diferencias entre varias
células bacterianas o las partes de una bacteria, se utilizan varios colorantes. Ej.:
coloración de Gram, coloración de Ziehl Neelsen.
- Tinción negativa: Técnica por la cual las células bacterianas o fúngicas sin teñir se
hacen visibles sobre una película oscura como la tinción de tinta china
Coloraciones compuestas: Coloración de GRAM
Los métodos de coloración de los extendidos de diferentes muestras, fueron inicialmente
descritas por Paul Erlich y Robert Koch, quienes al aplicarlos, observaron numerosas
estructuras que no habían sido vistas anteriormente. En 1884, Christian Gram ideo una de las
coloraciones más importantes, la cual le permitió distinguir bacterias que tenían morfología
similar, pero que se coloreaban diferente.
En 1921 Hucker propuso una modificación a la coloración propuesta por Gram, esta
modificación presento ventajas tales como, una mejor estabilidad de los reactivos y una mejor
diferenciación de los microorganismos, y esta modificación es la que se utiliza hoy en día, en la
gran mayoría de los laboratorios de microbiología
. Es la prueba de laboratorio de microbiología más simple y con el mejor costo efectividad, lo
que representa un beneficio tanto para el paciente, como para el clínico y el laboratorio..
Con la coloración de Gram se tiñen casi todas las bacterias, levaduras y parásitos, excluyéndose
solo aquellos que tienen una pared muy delgada como Mycoplasmas o las que no la tienen
como Chlamydia sp. También se colorean células epiteliales y los leucocitos lo que permite
determinar, la calidad de la muestra y la respuesta inflamatoria del hospedero.
Al colorear los microorganismos con la coloración de GRAM, podemos apreciar su tamaño y
forma y además clasificarlas en Gram positivas o negativas, parámetro muy importante para el
diagnóstico presuntivo de infecciones bacterianas, el cual permite el rápido inicio del
tratamiento adecuado y los subsecuentes procedimientos de identificación.

FUNDAMENTO:
La coloración de Gram se basa en las diferencias existentes en la composición química de la
pared celular de las bacterias, lo que les confiere o no la capacidad de retener el cristal violeta,
colorante inicial del procedimiento..
La pared celular de las bacterias Gram positivas, está compuesta en un 50-60% por el
peptidoglucano y en un 40.50% por ácidos teicoicos y polisacáridos. El peptidoglucano
(llamado también mureina, capa de glicopeptido o mucopeptido) está compuesto de N-
acetilglusamina y N-acetil muramico.
En las bacterias Gram positivas, el cristal violeta se fija a la pared celular y con la adición del
lugol que actúa como mordiente, se produce el complejo cristal violeta.iodo, el cual es resistente
a la decoloración
La pared celular de las bacterias Gram negativas está compuesta por una delgada capa de
petidoglucano el cual constituye el 5-10% de la pared celular, recubriendo esta capa se
encuentra una membrana externa compleja, constituida por fosfolípidos (20.30%),
lipopolisacaridos (30%) y proteínas (40-50%),
El decolorante actúa como un solvente, sobre los lípidos presentes en las membranas de las
bacterias Gram negativas, los poros se aumentan de tamaño y se libera el complejo cristal
violeta-iodo y la bacteria toma el colorante secundario o de contraste (safranina).
Otros microorganismos como las levaduras se colorean rápidamente de color violeta cuando se
aplica la coloración de Gram a una preparación seca; las células inflamatorias (leucocitos)
aparecen de color rosado y las células epiteliales de color rosado o violeta dependiendo de lo
grueso del extendido y del fibrinógeno presente en el moco y los glóbulos rojos se colorean de
rosado.
1. Primer colorante: cristal violeta. Es un colorante básico que en contacto con las
células cargadas negativamente, reacciona con ella colore3andolas de color violeta.
2. Solución mordiente, lugol: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y
las células.
3. Agente decolorante, alcohol acetona: Es un disolvente orgánico
4. Colorante de contraste, safranina: Es un colorante básico.
Procedimiento de la coloración de Gram
1. Preparar un frotis delgado a partir de cultivos (utilizar solución salina estéril), o de
especímenes clínicos (abscesos, esputos, secreciones, líquidos etc.,) en una lámina
portaobjetos nueva y limpia.
2. Dejar secar al medio ambiente
3. Fijar al calor
4. Colocar cristal violeta sobre el portaobjetos y dejar actuar por un minuto
5. Enjuagar con agua y escurrir
6. Agregar la solución de lugol y dejar actuar por un minuto
7. Escurrir la solución y enjuagar con agua
8. Decolorar con alcohol-acetona por 8 segundos y enjuagar con agua
9. Agregar la solución de safranina y dejar actuar por 30 segundos, enjuagar,
escurrir y secar al aire

Una vez teñido se observa con lente de inmersión (100X), usando aceite de inmersión.
En extendidos directos de material orgánico (muestras clínicas o especímenes) se evalúa las
células bacterianas, su morfología y comportamiento frente al Gram, su disposición o
agrupación y otros elementos como leucocitos, hematíes y células epiteliales.
Clasificación de las bacterias
La coloración de Gram es usada en el laboratorio de microbiología para clasificar las bacterias
con base en su:
- FORMA
- TAMAÑO
- DISPOSICION O ARREGLO
- REACCION AL GRAM
Forma: Las bacterias pueden tener forma de:
- Esférica denominadas “cocos”
- Cilíndrica o en forma de barras denominadas “bacilos” o “cocobacilos”
- En espiral o helicoidales
Tamaño: Este parámetro está relacionado con el diámetro de los cocos o la longitud de los
bacilos. Estos últimos pueden observarse cortos, largos o como filamentos.
Disposición o arreglo: Se refiere a la agrupación o arreglo de las bacterias.
Los cocos pueden estar dispuestos en:
- Pares (diplococos)
- Cadenas, características del genero Streptococcus
- Racimos, características del genero Staphylococos
- Tétradas, (dispuestas en cuatro)
Los bacilos no se agrupan con la variedad de modelos de los cocos, pero pueden presentarse en
forma de empalizadas, letras chinas o cadenas cortas.
Las bacterias de forma helicoidal se presentan como células individuales, las diversas especies
ofrecen notables diferencias en longitud, en el número y amplitud de las espirales y en la rigidez
de las paredes celulares.
Reacción al Gram
Según la reacción al Gram, las bacterias se dividen en Gram positivas, las que se tiñen de color
violeta, y en Gram negativas, las que se tiñen de color rosado,

La división de las bacterias en Gram positivas y en Gram negativas está dada por las diferencias
físicas químicas en la composición de la pared celular.,
UTILIDAD
ESTE EXAMEN TIENE VALOR DIAGNOSTICO Y ES DE INFORME INMEDIATO EN
LAS SIGUIENTES MUESTRAS:
- LCR
- ESPUTO
- ORINA
- SANGRE
- ABSCESOS
- SECRECIONES´
NO TIENE VALOR DIAGNOSTICO EN:
- MUESTRAS FARINGEAS
- NASOFARINGEAS
- ES DE USO LIMITADO EN MUESTRAS DE MATERIA FECAL.(Solo en el Gram
modificado, para el diagnóstico presuntivo de infecciones por Campylobacter sp.)
-
PROCEDIMIENTO:
Es importante estandarizar los métodos de coloración para obtener resultados confiables
y reproducibles.
Elementos
- Laminas portaobjetos, ,lavadas y desengrasadas
- Solución salina estéril (0.86%)
- Pipetas pasteur o aplicadores de algodón estéril
- Asas microbiológicas
- Mecheros
- Aceite de inmersión
NOTA: Las láminas portaobjetos utilizadas para la coloración de Gram, deben ser nuevas, sin
rayas y limpias. Es recomendable mantener las láminas portaobjetos en alcohol y antes de
usarlas dejarlas secar al aire.
Preparación del extendido para colorear con Gram
Los extendidos para colorear con Gram pueden ser:
- Muestras clínicas
- Cultivos en caldo
- Colonias crecidas en medios solidos
Extendidos de muestras clínicas
Se toman con escobillón, rótelo suavemente sobre la lámina portaobjeto, en forma circular,
empezando del centro hacia afuera, para evitar dañar las celulas y la disposición de
las bacterias.

Extendidos a partir de cultivos en caldo
- Mezcle el cultivo
- Con una pipeta pasteur, transfiera una gota o dos a una lámina portaobjeto.
- Extienda la gota para formar una película delgada.
Extendidos a partir de colonias en medios de cultivos solidos
- Incinere el asa a la llama colocándola en forma vertical
- Enfríela en una parte del agar donde no haya crecimiento bacteriano
- Tome una colonia con el asa y extiéndala sobre un portaobjeto al que previamente ha
colocado una gota pequeña de solución salina, Mezcle por movimientos circulares.
Evite hacer preparaciones muy gruesas.
- Deje secar al aire y fíjela por el calor pasándola suavemente por la llama.
- Anote la morfología y tinción de las bacterias observadas
.
Frotis indirecto
Gram positivos
Frotis indirecto
Gram negativos
Examen directo
Notas:
10. Maneje el asa como si fuera un lápiz. Esto le deja dos dedos libres para manipular
tapones de algodón u otras funciones.
11. Cuando esterilice el asa contaminada con líquidos o particular de cultivos, hágalo
con mesura, pasando poco a poco por encima de la llama, hasta que quede al rojo.
De esta manera se evita que partículas mal incineradas caigan en su mesa de
trabajo, contaminándola.
Coloraciones negativas; Tinta china
Coloración utilizada para visualizar capsulas.

La capsula es una estructura externa que presentan algunas bacterias, compuesta por una
sustancia viscosa que forma una cubierta o envoltura alrededor de la célula aumentando su
capacidad infecciosa (virulencia)
Importantes microorganismos formadores de capsula: Género, Klebsiella
Genero Streptococcus Especie pneumoniae
Procedimiento
1. Sobre una lámina portaobjetos nuevo y limpio colocar una gota china y hacer una
suspensión de la muestra clínica del microorganismo. Las partículas de carbón y de la
tinta no pueden penetrar en la capsula de manera que solo se ennegrece el fondo.
2. Dejar secar la preparación, fijarla al calor y aplicar cristal violeta durante 1 minuto para
visualizar el microorganismo.
3. Lavar y dejar secar.
4. Observar al microscopio la capsula como una zona clara alrededor de la bacteria.
Dibuje la capsula y la morfología bacteriana
Diplococos encapsulados Bacilos encapsulados
Coloración de Scheuffer Fulton para esporas
Algunas bacterias Gram positivas como Bacillus y Clostridium bajo condiciones adversas tales
como alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes químicos pueden pasar de su estado
vegetativo aq un estado latente o de espora (endospora) permitiendo la supervivencia del
microorganismo durante largo tiempo.
La forma y localización de la espora dentro del bacilo son criterios importantes para la
clasificación taxonómica.
Procedimiento
- Realizar una suspensión colocando una gota de solución salina en una lámina
portaobjetos nueva y limpia y una pequeña cantidad de la colonia a partir de cultivo
viejo (mínimo (48 horas) de Bacillus, de esta manera aseguramos la presencia de
endosporas bacterianas.
- Dejar secar al medio ambiente.
- Fijarla al calor
- Agregar solución de verde de malaquita al 5%.

- Utilizando un mechero, calentar durante 3 minutos, hasta que salgan vapores pero
evitando que se seque el colorante, dejar enfriar.
- Lavar con abundante agua y aplicar safranina como colorante de contraste durante 1
minuto.
- Observar al microscopio las endosporas de color verde y el bacilo de color rosado.
Dibuje la espora y la morfología bacteriana.
Autoevaluación
Mencione las estructuras de las bacterias Gram positivas y la función de cada una
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________
Mencione las estructuras de las bacterias Gram negativas y la función de cada una
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

Complete el siguiente cuadro según las características descritas.
Características Gram positivos Gram negativos
Pared celular
Sensibilidad a la penicilina
Resistencias a los medios
físicos
Sensibilidad a la lisozima
Inhibición por colorantes
Formación de esporas
MATERIALES: Para cada grupo de 4-5 estudiantes
 Medios de cultivo con diferentes crecimientos de colonias bacterianas(Agar): 1
 Medios de cultivo básicos, enriquecidos y diferenciales : 1 de cada uno
 Medios de cultivo liquido( Caldo): 1
 Solución salina estéril. 1 frasco
 Laminas portaobjetos: 2
 Asas microbiológicas: 1
 Mechero
 Aceite de inmersión: 1
 Microscopio: 1
 Coloración de Gram
CONSULTA
1.‐ Escriba el fundamentode lassiguientescoloracionestambiénaplicadasenel campode la
microbiología.
ColoraciónZiehl NeelsenyGram
GIEMSA
Tinta china.