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TÉCNICA
HISTOLÓGICA
Dra. Anahí Chavarría Krauser
Medicina Experimental
Facultad de Medicina, UNAM
PASOS
 Obtención de la muestra
 Fijación
 Deshidratación
 Aclarado
 Inclusión
 Formación del bloque
 Cortes del bloque
 Montaje en laminillas
 Desparafinazión
 Rehidratación
 Tinción
 Deshidratación
 Xileno
 Montaje
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
 Necropsia
 Biopsia
 Inscisional
 Excisional
 Por sacabocado
 Por punción
 Por absorción
 Por raspado
 Por trepanación
FIJACIÓN
1. Conservar los tejidos de forma que muestren
el mayor parecido posible a su estado in vivo.
2. Aumentar la dureza del tejido para facilitar la
preparación de finas películas de éste.
3. Destruir bacterias y gérmenes que pudieran
encontrarse en ellos.
4. Interrumpir los procesos celulares dinámicos
que ocurren a la muerte de la célula.
FIJACIÓN
PARA MICROSCOPÍA ÓPTICA:
1. Formaldehído al 5%, Formol al 10% o Formalina (Solución
de Formaldehído especial)
 Reacciona con los grupos aminos de las proteínas,
formando enlaces transversales y conservando las
estructuras de la célula.
2. Glutaraldehído al 2.5%, Tetróxido de Osmio, Líquido de
Helly y Fijador de Bouin
 Funcionan formando enlaces transversales en las
proteínas y manteniendo las estructuras de la célula.
3. Cloruro de Mercurio y Ácido Pícrico
 Precipitan las proteínas.
FIJACIÓN
PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA:
1. Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído, Tetróxido de
Osmio y Permanganato de Potasio
 Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que
otros fijadores como el formaldehído, son muy enérgicos
en su acción con las proteínas.
 Actúan como colorantes electrodensos, permitiendo
observar al tejido con el haz de electrones.
 Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un tampón a
pH 7.4, evita la violenta desnaturalización de las proteínas
guardando detalles finos de la célula. Es el más usado en
Microscopia Electrónica.
Regla de Oro para la
Fijación:
1. La mejor fijación es
cuando a pasado el
menor tiempo entre
la muerte del tejido y
la fijación.
2. Tamaño de la
Muestra: El tamaño
de la muestra debe de
ser de 2-3 cm.
variando el estudio
para lo cual se va a
utilizar.
DESHIDRATACIÓN
 Después que la muestra ha sido fijada se elimina
el fijador y se deshidrata.
 Debido a que una gran parte del tejido está
constituida por agua, se aplica una serie gradual
de soluciones acuosas de menor a mayor de
agente deshidratante (Alcohol Etílico o Acetona)
 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y 100 %
 Esto se hace por que si se colocara el tejido en una
solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua
saldría muy rápido del tejido y se deformaría.
ACLARAMIENTO O
DIAFANIZACIÓN
 El tejido se pasa a una solución de una sustancia que es
miscible tanto con el alcohol como con el medio de
inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza
como medio de inclusión Parafina líquida).
 La sustancias comúnmente utilizada son: el xileno o
xilol, tolueno, benzol o cloroformo.
 Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna
transparente o claro en el xileno, esto se debe a que
cambia su índice de refracción. También se pueden
utilizar como medios de aclaramiento.
 NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la
célula y por lo cual al extraerse también se extraen las
grasas y los lípidos de la célula.
INCLUSIÓN
 A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente
finos para ser observados al microscopio, los tejidos
tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia
de consistencia firme.
 Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y
parafina.
 El objetivo de la inclusión es:
 Distinguir entre sí las células superpuestas en un
tejido y la matriz extracelular.
 Tener un objeto lo suficientemente duro para su
manejo y corte.
INCLUSIÓN
 La inclusión se logra al infiltrar la
parafina líquida o cualquier medio
de inclusión en estado líquido al
tejido, que disuelve el medio de
aclaramiento y penetra en el tejido.
 La muestra de tejido se agrega al
recipiente que contiene la parafina
fundida a 60º C
 El tiempo varía de 30 minutos a 6
horas manteniendo la temperatura
a 60º C.
 Debido al calor, el xilol o el benzol
se evaporan y los espacios
anteriormente ocupados por ellos
son ahora ocupados por la
parafina.
INCLUSIÓN
 Después se coloca la
pieza y un poco de
parafina fundida en un
molde de papel o metal
de forma rectangular
 Se deja solidificar a
temperatura ambiente,
formándose un bloque
sólido de parafina con el
trozo de tejido incluido,
a este bloque se le
denomina Taco.
INCLUSIÓN
 Los medios de inclusión para Microscopía
Electrónica comúnmente utilizados son resinas
polimerizadas o epoxi como:
 Epon
 Mikropal
 Araldit
CORTE
 El bloque ahora se
puede cortar en
secciones lo
suficientemente
delgadas como para
permitir el paso de la
luz.
 La mayor parte de los
preparados para
microscopia óptica
tienen un grosor entre 3
a 10 micrómetros.
 Para estos cortes se
utiliza un aparato
llamado microtomo.
CORTE
 Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se
extraen en el proceso de aclaramiento o enzimas que
quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión,
nos auxiliamos con la Técnica de Congelación de
Tejidos.
 Un tejido congelado es lo suficientemente duro para ser
cortado.
 Se sumerge la muestra de tejido en Nitrógeno líquido
para tener una congelación rápida.
 Luego se corta con crióstato.
 La ventaja de esta técnica es que los cortes que se
obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el
diagnostico de material patológico, tomado en
intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el
transcurso de una operación.
CRIÓSTATO
CORTE
Para Microscopía Electrónica:
 Se requieren cortes más delgados (denominados ultra
finos) de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de
0.5 mm. de lado medio.
 Para esto se utiliza un microtomo con hoja de vidrio o
diamante.
 Una vez preparados, se montan sobre rejillas de cobre
con un diámetro de 3mm.
CORTE
 Los cortes se colocan
sobre portaobjetos a los
que se les ha agregado
un agente adhesivo.
 Los más comunes son:
albúmina, gelatina,
polilisina.
TINCIÓN
 Los cortes todavía
no son aptos para su
examen con el
microscopio, puesto
que los tejidos se
hallan infiltrados en
parafina y carecen
de color.
TINCIÓN
 La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen
en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de
graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una
solución 100% de agua.
 Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes más utilizados
son la HEMATOXILINA Y la EOSINA.
Xilol
Xilol
Alcoholes en grados crecientes
Alcoholes en grados
decrecientes
Eosina
Hematoxilina
Agua amoniacal
Alcohol-ácido
TINCIÓN
MONTAJE
 Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera
que pueda fijarse de modo permanente el
CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el
MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de
Canadá, permount o clarion).
 Los medios de montaje pueden ser miscibles o no
miscibles en agua, si son miscibles en agua ya no es
necesaria la deshidratación después del teñido, se puede
montarlo directamente.
 El cubreobjetos no solo protege el tejido, sino que se
requiere para observar el corte con un microscopio.
MONTAJE
MÉTODOS HISTO- Y
CITOQUÍMICOS
COLORANTES
Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:
 Colorantes que diferencian los componentes
ácidos y básicos de la célula.
 Colorantes especializados que distinguen los
componentes fibrosos de la matriz extracelular.
 Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y
forman depósitos de metales con ellos.
COLORANTES BÁSICOS
 Contiene una molécula de anilina que tiene una o más cargas
positivas en su porción coloreada.
 Reaccionan con los GRUPOS ANIÓNICOS de los
componentes texturales, como son:
 los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y RNA)
 los grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos
 los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas.
 Son colorantes básicos:
 Verde metileno
 Azul de metileno
 Azul de toluidina
 Pironina G
COLORANTES ÁCIDOS
 Contiene una o más cargas negativas en su porción
coloreada.
 Reaccionan con los GRUPOS CATIÓNICOS de los
componentes texturales, como son:
 los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las proteínas.
 Son colorantes ácidos:
 Fucsina ácida
 Azul de anilina
 Eosina
 Naranja G
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante ácido
(o con Eosina) se dice que es ACIDÓFILO y que presenta
ACIDOFILIA. Estos componentes son:
 La mayor parte del citoplasma no especializado.
 Filamentos Citoplasmáticos.
 Fibras extracelulares.
Todos estos debidos a grupos amino ionizados.
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico
(o con Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO y que presenta
BASOFILIA. Estos componentes son:
 La heterocromatina y los nucleolos del núcleo por los grupos fosfato
ionizados.
 Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos fosfato ionizados.
 Matriz del cartílago por grupos sulfato ionizados.
METACROMASIA
Es el fenómeno por el cual un colorante (por ejemplo Azul de Toluidina
o la tionina) cambia de color tras reaccionar con un componente
textural.
Esto se debe a que en tejidos con altas concentraciones de
POLIANIONES, la molécula del colorante se polimeriza entre si y
sus propiedades de absorción son diferentes de las propiedades de las
moléculas individuales.
Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente,
denominados cromotropos, son principalmente los
glucosaminoglucanos sulfatados y las nucleoproteínas.
GRUPOS ALDEHÍDO Y REACTIVO
DE SCHIFF
 El Reactivo de Schiff es la leucofucsina o
bisulfato de fucsina.
 Es incoloro, pero puede formar un color rojo
estable producto de adición con grupos
aldehído.
 Este compuesto se utiliza en combinación con
otros productos químicos como:
 Método del ácido peryódico-Schiff (PAS)
 Método de Feulgen
PAS
 Se emplea para determinar la presencia de moléculas como el glucógeno,
glucoproteínas y glucosaminoglucanos.
 Rompe la unión de los anillos de las hexosas formando grupos aldehído
o rompe los enlaces de las hexoaminas de los glucosaminoglucanos,
también formando grupos aldehído
 Los grupos aldehído reaccionan con el reactivo de Schiff.
 También sirve para identificar membranas basales y fibras reticulares.
FEULGEN
 es un método específico para la determinación histoquímica del DNA,
 La hidrólisis de un ácido débil con cloruro de hidrógeno (HCl) lleva a
que se separen los grupos púricos del DNA.
 De este modo se abre el anillo de desoxirribosa, y se forma un grupo
aldehído que reacciona con el reactivo de Schiff.
 Se obtiene un color magenta o rojo.
 No se tiñe el RNA.
HISTOQUÍMICA DE LÍPIDOS
 Luego de la fijación con formalina se realizan cortes por
congelación, por lo que se evita extraer los lípidos con
los solventes orgánicos.
 Los colorantes frecuentemente usados son los Sudán,
osmio.
 Son casi insolubles en agua y se emplean disueltos en
un solvente orgánico en el cual los lípidos sean
relativamente insolubles, y en el que también el
colorante sea sólo parcialmente soluble.
 Para evitar la extracción del colorante y los lípidos,
luego de la coloración se montan los cortes en medio
acuoso.
HISTOQUÍMICA DE LÍPIDOS
 Los colorantes Sudán tiñen
fuertemente los
TRIGLICÉRIDOS, como
por ejemplo:
 ROJO DE SUDÁN O
SUDÁN III, en la coloración
de células adiposas.
 EL NEGRO DE SUDÁN O
SUDÁN IV, se emplea en la
coloración de las vainas
mielínicas de las fibras
nerviosas compuestas por
lipoproteínas.
MÉTODOS NO ESPECÍFICOS
 Estos métodos utilizan varios
colorantes que colorean
diferentes estructuras tisulares
de los cuales se desconocen
las bases químicas en como se
unen con los componentes
 Ejemplos son: el tricrómico
de Mallory, tricrómico de
Masson, Gallego.
IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA
 El nitrato de plata y la
metenamina de plata,
en condiciones muy
controladas de
concentración, pH y
salinidad del medio,
precipita sobre grupos
amino libres muy
característicos de
algunas proteínas
permitiendo su
identificación.
HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA
 Las enzimas son catalizadores
biológicos de estructura proteica.
La actividad de muchas de ellas
puede evidenciarse
microscópicamente.
 En algunos casos la preservación
de esta actividad requiere de
cortes de criostato, pero en otros
la enzima resiste una breve
fijación en acetona fría,
formaldehído, glutaraldehído y
otros dialdehídos.
 Las técnicas enzimáticas se basan
en la incubación de los cortes de
tejidos con un sustrato apropiado.
INMUNOCITOQUÍMICA
 Se basa en la detección de sustancias
de los tejidos por medio del uso de
anticuerpos.
 Un corte histológico se incuba con
la inmunoglobulina (anticuerpo)
capaz de unirse específicamente al
componente del tejido que se
pretende demostrar (el antígeno).
 Los anticuerpos que se unen al
antígeno no son visibles por sí
mismos, por lo que es necesario
emplear sistemas de visualización
 tipo enzimático
 sustancias fluorescentes
 Sustancias electrodensas como el
oro coloidal o la ferritina
HIBRIDAZIÓN IN SITU
 La hibridación in situ consiste en la
detección de secuencias muy específicas de
un ácido nucleico a través de su capacidad de
aparearse con una secuencia
complementaria.
 Esta técnica se implementa usualmente para
el ADN, consistiendo su primer paso en
separar las cadenas del mismo
(desnaturalización), por medio del
calentamiento a 90° C.
 Posteriormente se incuba el corte con una
secuencia de ADN de simple cadena y
complementaria con la que se quiere
investigar conocida como sonda y que se ha
marcado de alguna manera (generalmente
con fluoresceína o con biotina).
 Finalmente se visualiza con alguno de los
sistemas similarmente a como se lo hace para
la inmunohistoquímica.
RADIOAUTOGRAFÍA
 En esta técnica se usa
una emulsión
fotográfica colocada
sobre un corte
histológico para
localizar material
radioactivo en los
tejidos.
ARTIFICIOS DE LA TÉCNICA
 Obtención
 Atricción y aplastamiento del tejido por pinzas, etc.
 Desecación, en general por depositar pequeñas muestras de tejido sobre una gasa y demorar
su fijación
 Autólisis, por demorar la fijación
 Fijación
 Autólisis, por emplear pequeños volúmenes de fijador para piezas mayores de 1 cm cúbico
 Retracción, mayor con los alcoholes
 Pobre coloración, mayor con las sales y el osmio
 Precipitados, mayor con las sales
 Inclusión
 Retracción, por sobrecalentamiento
 Corte
 Rayas, por melladura de las navajas
 Pliegues, por falla al extender los cortes
 Coloración
 Ausencia de coloración, generalmente en las reacciones histoquímicas por falla en alguno de
sus pasos
 Sobrecoloración, al extenderse en el tiempo
 Precipitados, por no filtrar los colorantes
 Montaje
 Burbujas de aire y gotas en el medio de montaje
Técnica histológica

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Técnica histológica

  • 1. TÉCNICA HISTOLÓGICA Dra. Anahí Chavarría Krauser Medicina Experimental Facultad de Medicina, UNAM
  • 2. PASOS  Obtención de la muestra  Fijación  Deshidratación  Aclarado  Inclusión  Formación del bloque  Cortes del bloque  Montaje en laminillas  Desparafinazión  Rehidratación  Tinción  Deshidratación  Xileno  Montaje
  • 3. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA  Necropsia  Biopsia  Inscisional  Excisional  Por sacabocado  Por punción  Por absorción  Por raspado  Por trepanación
  • 4. FIJACIÓN 1. Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo. 2. Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste. 3. Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos. 4. Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.
  • 5. FIJACIÓN PARA MICROSCOPÍA ÓPTICA: 1. Formaldehído al 5%, Formol al 10% o Formalina (Solución de Formaldehído especial)  Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando enlaces transversales y conservando las estructuras de la célula. 2. Glutaraldehído al 2.5%, Tetróxido de Osmio, Líquido de Helly y Fijador de Bouin  Funcionan formando enlaces transversales en las proteínas y manteniendo las estructuras de la célula. 3. Cloruro de Mercurio y Ácido Pícrico  Precipitan las proteínas.
  • 6. FIJACIÓN PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA: 1. Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído, Tetróxido de Osmio y Permanganato de Potasio  Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el formaldehído, son muy enérgicos en su acción con las proteínas.  Actúan como colorantes electrodensos, permitiendo observar al tejido con el haz de electrones.  Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un tampón a pH 7.4, evita la violenta desnaturalización de las proteínas guardando detalles finos de la célula. Es el más usado en Microscopia Electrónica.
  • 7. Regla de Oro para la Fijación: 1. La mejor fijación es cuando a pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijación. 2. Tamaño de la Muestra: El tamaño de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual se va a utilizar.
  • 8. DESHIDRATACIÓN  Después que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata.  Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante (Alcohol Etílico o Acetona)  50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y 100 %  Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.
  • 9. ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN  El tejido se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida).  La sustancias comúnmente utilizada son: el xileno o xilol, tolueno, benzol o cloroformo.  Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. También se pueden utilizar como medios de aclaramiento.  NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.
  • 10.
  • 11.
  • 12. INCLUSIÓN  A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme.  Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y parafina.  El objetivo de la inclusión es:  Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.  Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.
  • 13. INCLUSIÓN  La inclusión se logra al infiltrar la parafina líquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido.  La muestra de tejido se agrega al recipiente que contiene la parafina fundida a 60º C  El tiempo varía de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.  Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina.
  • 14. INCLUSIÓN  Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular  Se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco.
  • 15. INCLUSIÓN  Los medios de inclusión para Microscopía Electrónica comúnmente utilizados son resinas polimerizadas o epoxi como:  Epon  Mikropal  Araldit
  • 16. CORTE  El bloque ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz.  La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros.  Para estos cortes se utiliza un aparato llamado microtomo.
  • 17. CORTE  Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de Congelación de Tejidos.  Un tejido congelado es lo suficientemente duro para ser cortado.  Se sumerge la muestra de tejido en Nitrógeno líquido para tener una congelación rápida.  Luego se corta con crióstato.  La ventaja de esta técnica es que los cortes que se obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el diagnostico de material patológico, tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operación.
  • 19. CORTE Para Microscopía Electrónica:  Se requieren cortes más delgados (denominados ultra finos) de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm. de lado medio.  Para esto se utiliza un microtomo con hoja de vidrio o diamante.  Una vez preparados, se montan sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm.
  • 20. CORTE  Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado un agente adhesivo.  Los más comunes son: albúmina, gelatina, polilisina.
  • 21.
  • 22. TINCIÓN  Los cortes todavía no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.
  • 23. TINCIÓN  La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% de agua.  Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y la EOSINA. Xilol Xilol Alcoholes en grados crecientes Alcoholes en grados decrecientes Eosina Hematoxilina Agua amoniacal Alcohol-ácido
  • 25. MONTAJE  Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que pueda fijarse de modo permanente el CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá, permount o clarion).  Los medios de montaje pueden ser miscibles o no miscibles en agua, si son miscibles en agua ya no es necesaria la deshidratación después del teñido, se puede montarlo directamente.  El cubreobjetos no solo protege el tejido, sino que se requiere para observar el corte con un microscopio.
  • 28. COLORANTES Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:  Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula.  Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelular.  Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos.
  • 29. COLORANTES BÁSICOS  Contiene una molécula de anilina que tiene una o más cargas positivas en su porción coloreada.  Reaccionan con los GRUPOS ANIÓNICOS de los componentes texturales, como son:  los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y RNA)  los grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos  los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas.  Son colorantes básicos:  Verde metileno  Azul de metileno  Azul de toluidina  Pironina G
  • 30. COLORANTES ÁCIDOS  Contiene una o más cargas negativas en su porción coloreada.  Reaccionan con los GRUPOS CATIÓNICOS de los componentes texturales, como son:  los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las proteínas.  Son colorantes ácidos:  Fucsina ácida  Azul de anilina  Eosina  Naranja G
  • 31. Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante ácido (o con Eosina) se dice que es ACIDÓFILO y que presenta ACIDOFILIA. Estos componentes son:  La mayor parte del citoplasma no especializado.  Filamentos Citoplasmáticos.  Fibras extracelulares. Todos estos debidos a grupos amino ionizados.
  • 32. Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO y que presenta BASOFILIA. Estos componentes son:  La heterocromatina y los nucleolos del núcleo por los grupos fosfato ionizados.  Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos fosfato ionizados.  Matriz del cartílago por grupos sulfato ionizados.
  • 33. METACROMASIA Es el fenómeno por el cual un colorante (por ejemplo Azul de Toluidina o la tionina) cambia de color tras reaccionar con un componente textural. Esto se debe a que en tejidos con altas concentraciones de POLIANIONES, la molécula del colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorción son diferentes de las propiedades de las moléculas individuales. Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente, denominados cromotropos, son principalmente los glucosaminoglucanos sulfatados y las nucleoproteínas.
  • 34. GRUPOS ALDEHÍDO Y REACTIVO DE SCHIFF  El Reactivo de Schiff es la leucofucsina o bisulfato de fucsina.  Es incoloro, pero puede formar un color rojo estable producto de adición con grupos aldehído.  Este compuesto se utiliza en combinación con otros productos químicos como:  Método del ácido peryódico-Schiff (PAS)  Método de Feulgen
  • 35. PAS  Se emplea para determinar la presencia de moléculas como el glucógeno, glucoproteínas y glucosaminoglucanos.  Rompe la unión de los anillos de las hexosas formando grupos aldehído o rompe los enlaces de las hexoaminas de los glucosaminoglucanos, también formando grupos aldehído  Los grupos aldehído reaccionan con el reactivo de Schiff.  También sirve para identificar membranas basales y fibras reticulares.
  • 36. FEULGEN  es un método específico para la determinación histoquímica del DNA,  La hidrólisis de un ácido débil con cloruro de hidrógeno (HCl) lleva a que se separen los grupos púricos del DNA.  De este modo se abre el anillo de desoxirribosa, y se forma un grupo aldehído que reacciona con el reactivo de Schiff.  Se obtiene un color magenta o rojo.  No se tiñe el RNA.
  • 37. HISTOQUÍMICA DE LÍPIDOS  Luego de la fijación con formalina se realizan cortes por congelación, por lo que se evita extraer los lípidos con los solventes orgánicos.  Los colorantes frecuentemente usados son los Sudán, osmio.  Son casi insolubles en agua y se emplean disueltos en un solvente orgánico en el cual los lípidos sean relativamente insolubles, y en el que también el colorante sea sólo parcialmente soluble.  Para evitar la extracción del colorante y los lípidos, luego de la coloración se montan los cortes en medio acuoso.
  • 38. HISTOQUÍMICA DE LÍPIDOS  Los colorantes Sudán tiñen fuertemente los TRIGLICÉRIDOS, como por ejemplo:  ROJO DE SUDÁN O SUDÁN III, en la coloración de células adiposas.  EL NEGRO DE SUDÁN O SUDÁN IV, se emplea en la coloración de las vainas mielínicas de las fibras nerviosas compuestas por lipoproteínas.
  • 39. MÉTODOS NO ESPECÍFICOS  Estos métodos utilizan varios colorantes que colorean diferentes estructuras tisulares de los cuales se desconocen las bases químicas en como se unen con los componentes  Ejemplos son: el tricrómico de Mallory, tricrómico de Masson, Gallego.
  • 40. IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA  El nitrato de plata y la metenamina de plata, en condiciones muy controladas de concentración, pH y salinidad del medio, precipita sobre grupos amino libres muy característicos de algunas proteínas permitiendo su identificación.
  • 41. HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA  Las enzimas son catalizadores biológicos de estructura proteica. La actividad de muchas de ellas puede evidenciarse microscópicamente.  En algunos casos la preservación de esta actividad requiere de cortes de criostato, pero en otros la enzima resiste una breve fijación en acetona fría, formaldehído, glutaraldehído y otros dialdehídos.  Las técnicas enzimáticas se basan en la incubación de los cortes de tejidos con un sustrato apropiado.
  • 42. INMUNOCITOQUÍMICA  Se basa en la detección de sustancias de los tejidos por medio del uso de anticuerpos.  Un corte histológico se incuba con la inmunoglobulina (anticuerpo) capaz de unirse específicamente al componente del tejido que se pretende demostrar (el antígeno).  Los anticuerpos que se unen al antígeno no son visibles por sí mismos, por lo que es necesario emplear sistemas de visualización  tipo enzimático  sustancias fluorescentes  Sustancias electrodensas como el oro coloidal o la ferritina
  • 43. HIBRIDAZIÓN IN SITU  La hibridación in situ consiste en la detección de secuencias muy específicas de un ácido nucleico a través de su capacidad de aparearse con una secuencia complementaria.  Esta técnica se implementa usualmente para el ADN, consistiendo su primer paso en separar las cadenas del mismo (desnaturalización), por medio del calentamiento a 90° C.  Posteriormente se incuba el corte con una secuencia de ADN de simple cadena y complementaria con la que se quiere investigar conocida como sonda y que se ha marcado de alguna manera (generalmente con fluoresceína o con biotina).  Finalmente se visualiza con alguno de los sistemas similarmente a como se lo hace para la inmunohistoquímica.
  • 44. RADIOAUTOGRAFÍA  En esta técnica se usa una emulsión fotográfica colocada sobre un corte histológico para localizar material radioactivo en los tejidos.
  • 45. ARTIFICIOS DE LA TÉCNICA  Obtención  Atricción y aplastamiento del tejido por pinzas, etc.  Desecación, en general por depositar pequeñas muestras de tejido sobre una gasa y demorar su fijación  Autólisis, por demorar la fijación  Fijación  Autólisis, por emplear pequeños volúmenes de fijador para piezas mayores de 1 cm cúbico  Retracción, mayor con los alcoholes  Pobre coloración, mayor con las sales y el osmio  Precipitados, mayor con las sales  Inclusión  Retracción, por sobrecalentamiento  Corte  Rayas, por melladura de las navajas  Pliegues, por falla al extender los cortes  Coloración  Ausencia de coloración, generalmente en las reacciones histoquímicas por falla en alguno de sus pasos  Sobrecoloración, al extenderse en el tiempo  Precipitados, por no filtrar los colorantes  Montaje  Burbujas de aire y gotas en el medio de montaje