Dokumen tersebut membahas tentang pemeriksaan kadar antigen CA 125 dengan metode ELISA untuk skrining, diagnosis, pemantauan terapi, dan prognosis kanker ovarium. Metode ELISA digunakan karena ekonomis dan sensitivitas yang tinggi. Kadar CA 125 yang meningkat dapat menandakan adanya kanker ovarium, terutama jenis epitelial.

1. TUTOR IMUNOLOGIPEMERIKSAAN CA 125 DENGAN METODE ELISA dr. Faizah Yunianti dr. Endang Retnowati, MS, Sp.PK(K) 13/06/2011 1

2. PENDAHULUAN 13/06/2011 2

3. 13/06/2011 Company Logo 3 m↑ : pd endometriosis berat, karsinoma ovarium. Glikoprotein BM besar CA 125 antigen permukaan yg berhubungan dgn kanker ovarium jenis epitelial

4. 13/06/2011 4 Tabel 1. Beberapa keadaan yang menyebabkan peningkatan kadar CA 125

7. Normal <21 U/mL.

9. 13/06/2011 6 Penentuan kadar CA 125 enzime linked immunosorbant assay (ELISA)) : Uji serologis Reaksi Ag – Ab yg dilabel enzim Ekonomis & sensitivitas ↑

10. 13/06/2011 7 Skrining Diagnosis & Stadium PENGGUNAAN CA 125 Monitoring Terapi & Prognosis

11. Skrining 13/06/2011 8 Pada kelompok yg berisiko tinggi : ♀ dgn riwayat keluarga mempunyai karsinoma ovarium pd usia postmenopause adanya massa di pelvis .

12. Diagnosis & penentuan stadium 13/06/2011 9 Membedakan jinak & keganasan : cut off 35 UI/mL. >65 U/mL : 90% keganasan (massa di pelvis). Kesalahan interpretasi : ♀ haid : cutoff 65 – 200 U/mL. 50% penderita st.I atau II  p↑ kadar CA 125. P↑ sangat jelas : karsinoma ovarium st.II-IV (kriteria FIGO). Asimtomatik + massa di pelvis+ kadar CA 125 >65 U/mL : sensitivitas 97% spesifisitas 78%.

13. Monitoring terapi & Prognosis 13/06/2011 10 kekambuhan penyakit post oophorectomy. CA 125 m ↓ : 50-75% penderita yg mendapat first line kemoterapi. Gard dkk : batas terendah 15 U/mL cut off monitoring penderita 15-35 UI/mL  kekambuhan penyakit. Kadar : > 450 U/mL : prognosis buruk, < 55 U/mL : prognosis lebih baik.

14. PEMERIKSAAN CA 125 METODE ELISA 13/06/2011 11 Prinsip Pemeriksaan Cara Kerja Hasil Perhitungan Kurva Standar Interferens Hasil Pemeriksaan

15. Prinsip pemeriksaan 13/06/2011 12 Ab dilapis enzim (konjugat) substrat warna kuning dibaca fotometer λ 450 nm Ab dilapiskan pd sumuran Ag serum yg diperiksa

17. Standar referensi CA 125

19. Kosentrasi Bufer pencuci

22. Prosedur Pemeriksaan 13/06/2011 14 Sumuran dilapisi antibodi + 100 μL CA 125 standar, sampel & kontrol Ditambahkan 100 μL reagen enzim konjugat ke tiap- tiap sumuran, dicampur selama 30’’ Inkubasi : 90 menit, t : 37° C Setelah inkubasi, campuran dibuang dgn mengosongkan sumurandgn cara : - dicuci menggunakan larutan pencuci. - cuci sumuran sebanyak 5x dgn bufer pencuci

23. Prosedur Pemeriksaan 13/06/2011 15 Sumurandibalik & dipukulkan pd kertas penyerap atau paper towel utk membuang seluruh sisa air Masukkan 100 μL larutan TMB pd masing-masing sumuran (warna biru), campur :10’’ Inkubasi pd suhu kamar pd ruang gelap selama 20’ Ditambahkan 100 μL larutan penghenti pd masing-masing sumuran, campur selama 30’’  warna biru berubah kuning Dibaca pd λ 450 nm.

24. Prosedur Pemeriksaan 13/06/2011 16

25. Nilai kontrol yg digunakan utk metode ELISA 13/06/2011 17

26. ALAT YANG DIGUNAKAN 13/06/2011 18 Stat FaxR 303 Microstrip Reader Chemwell 2910

27. Chemwell 2910 13/06/2011 Company Logo 19

28. Hasil perhitungan 13/06/2011 20 Hitung nilai absorbans (λ 450) untuk masing-masing standar , kontrol & sampel Kurva standar : memplot nilai mean dari absorbans yg didapat dari masing-masing standar terhadap kadar dlm U/mL pd kertas grafik bergaris. Absorbans : sumbu Y ; Kadar : sumbu X Nilai absorbans sampel digunakan untuk menentukan kadar CA 125 (U/mL) berdasarkan kurva standar

29. Tabel 3. Perbandingan kadar CA 125 dgn absorbans pada λ 450 nm 13/06/2011 21

30. Kurva standar 13/06/2011 Company Logo 22

32. Penggunaan anti koagulan

33. Sampel hemolisis, hiperbilirubinemia, lipemia

35. Wassalamu Alaikum warahmatullahi wabarakatuhTerima kasihthank you 13/06/2011 24

36. Radioimmunoassay (RIA) 13/06/2011 Company Logo 25 R cuci R Ag serum yg diperiksa Radiation counter Ag berlabel Antibodi pd fase padat

37. Immunoradiometric assay (IRMA) 13/06/2011 Company Logo 26

38. 13/06/2011 Company Logo 27 Kadar Sampel Absorbans Sampel = Kadar Standar Absorbans Standar Kadar Sampel = Absorbans sampel Absorbans standar X Kadar Standar

39. MUC-1 13/06/2011 Company Logo 28 Mucin 1, cell surface associated (MUC1) or polymorphic epithelial mucin (PEM) is a mucin, the protein part of which is encoded by the MUC1gene in humans.[1] Mucin proteins penetrate the membranes of epithelial cells, on the inner surface of the intestine and other organs. Mucin protects the body from infection by binding to pathogens. Overexpression of the mucin protein is often associated with colon and many other cancer

40. 13/06/2011 Company Logo 29 molecular weight glycoproteins that provide a protective layer on epithelial surfaces and are involved in cell-cell interactions, signaling, and metastasis expressed at the apical surface of ductal epithelia of tissues, including breast, pancreas, airway, and the gastrointestinal tract

41. Penanda tumor 13/06/2011 Company Logo 30 ALPHA – FETOPROTEIN ( AFP ) respon terapi pada kanker hati ( Karsinoma Hepatoseluler ). Kadar normal < 20 ng/mL. Kadar AFP m↑ bersama membesarnya tumor. Kanker hepar, kadar AFP m↑ > 500 ng/mL. m↑ pula pada hepatitis akut & kronis, tapi jarang > 100 ng/mL. Meningkat juga : - kanker testis - kanker ovarium jenis

42. Penanda tumor 13/06/2011 Company Logo 31 CA 15-3 monitoring kanker payudara. P↑ dijumpai pd <10 % pasien dengan stadium awal 70 % pasien dengan stadium lanjut. Kadar biasanya turun seiring keberhasilan terapi. Kadar normal : < 25 U/mL, kadar sampai 100 U/mL kadang dijumpai pd ♀sehat. responds terapi pada kanker hati ( Karsinoma Hepatoseluler ). Kada normal AFP biasanya kurang dari 20 ng/mL. Kadar AFP akan meningkat pada 2 dan 3 pasien dengan kanker hati. Kadar AFP meningkat bersama membesarnya tumor. Pada kebanyakan pasien dengan kanker hati, kadar AFP meningkat lebih dari 500 ng/mL. AFP meningkat pula pada hepatitis akut dan kronis, tapi jarang lebih dari 100 ng/mL. AFP juga meningkatk pada kanker testis tertentu ( jenis sel embryonal dan endodermal sinus ) dan digunakan untuk follow – up kanker tersebut. Peningkatan kadar AFP juga pada Kanker ovarium jenis tertentu yang jarang dan kanker testis yang disebut yolk sac tumor atau mixed germ cell cancer.

43. Penanda tumor 13/06/2011 Company Logo 32 Ca 19-9 awalnya dikembangkan untuk deteksi kanker colorectal, tapi ternyata lebih sensitif terhadap kanker pankreas. Kadar normal < 37 U/mL. Kadar yang tinggi pada awal diagnosis menunjukan stadium lanjut dari kanker responds terapi pada kanker hati ( Karsinoma Hepatoseluler ). Kada normal AFP biasanya kurang dari 20 ng/mL. Kadar AFP akan meningkat pada 2 dan 3 pasien dengan kanker hati. Kadar AFP meningkat bersama membesarnya tumor. Pada kebanyakan pasien dengan kanker hati, kadar AFP meningkat lebih dari 500 ng/mL. AFP meningkat pula pada hepatitis akut dan kronis, tapi jarang lebih dari 100 ng/mL. AFP juga meningkatk pada kanker testis tertentu ( jenis sel embryonal dan endodermal sinus ) dan digunakan untuk follow – up kanker tersebut. Peningkatan kadar AFP juga pada Kanker ovarium jenis tertentu yang jarang dan kanker testis yang disebut yolk sac tumor atau mixed germ cell cancer.

44. Penanda tumor 13/06/2011 Company Logo 33 Carcinoembryonic Antigen ( CEA ) Penanda tumor untuk memonitoring pasien dengan kanker colorectal selama / setelah terapi, tidak bisa dipakai untuk skrining atau diagnosis. Kadar normalnya sangat bervariasi antar laboratorium kadar > 5 ng/mL dikatakan Abnormal.

45. Penanda tumor 13/06/2011 Company Logo 34 Human Chorionic Gonadotropin ( HCG ) Beta – HCG. Kadarnya m↑ : - beberapa jenis kanker testis dan ovarium ( tumor germ cell ) - gestational trophoblastic, terutama Choriocarcinoma.

46. Penanda tumor 13/06/2011 Company Logo 35 Prostate-Specific Antigen ( PSA ) kanker prostat. Suatu protein yang dihasilkan sel grandula prostat. Benign prostate hyperplasia ( BPH ) kadang menunjukan peningkatan kadar PSA. Kadar PSA < 4 ng/mL bukan kanker > 10 ng/mLkanker, 4 – 10 ng/mL grey zonebiopsi.

47. Kriteria kanker ovarium menurut FIGO 13/06/2011 Company Logo 36 Stadium I :terbatas pd ovarium Stadium Ia : terbatas pd 1 ovarium, asites berisi sel ganas (-) pertumbuhan di permukaan luar (-) kapsul utuh Stadium Ib : terbatas pd kedua ovarium, asites berisi sel ganas (-), tumor di permukaan luar (-), kapsul intak Stadium Ic : tumor dgn stadium Ia & Ib, tetapi ada tumor di permukaan luar satu/kedua ovarium, atau dgn kapsul pecah/asites berisi sel ganas/ dengan bilasan peritoneum positif

48. Kriteria kanker ovarium menurut FIGO 13/06/2011 Company Logo 37 Stadium II :Pertumbuhan pd 1 atau 2 ovarium dgn perluasan ke panggul Stadium II a :perluasan dan/atau metastase ke uterus dan/atau tuba Stadium IIb : perluasan ke jaringan pelvis lainnya Stadium IIc : tumor stadium IIa dan IIb tetapi dgn tumor pd permukaan1 atau 2 ovarium, kapsul pecah, atau dgn asites yang mengandung sel ganas atau dgn bilasan peritoneum positif

49. 13/06/2011 Company Logo 38 Stadium III :1 atau ke 2 ovarium dgn implan di peritoneum di luar pelvis & atau kGB retroperitoneal atau inguinal (+). Metastase pd permukaan liver masuk stadium III. Terbatas pd pelvis kecil, tetapi secara histologik terbukti meluas ke usus besar/omentum Stadium III a : terbatas pd pelvis kecil dgn kGB (-), tetapi secara histologik & dikonfirmasi secara mikroskopik adanya penumbuhan (seeding) di permukaan peritoneum abdominal Stadium IIIb : 1 atau2 ovarium dgn implan dipermukaan peritoneum & terbukti secara mikroskopik diameter tidak melebihi 2 CM, KGB(-) Stadium IIIc :implan di abdomen dgn diameter > 2 cm & atau KGB retroperotoneal & inguinal (+)

50. Kriteria kanker ovarium menurut FIGO 13/06/2011 Company Logo 39 Stadium IV Pertumbuhan mengenai 1 atau ke 2 ovarium dengan metastasis jauh. efusi pleura dan hasil sitologinya positif dimasukkan dalam stadium IV. metastase ke liver.

51. Penanda tumor untuk skrining kanker ovarium 13/06/2011 Company Logo 40 CA 72-4 atau TAG 72 M-CSF OVX1 LPA Prostasin Osteopontin Inhibin Kallikrein

52. Bufer pencuci 13/06/2011 Company Logo 41 Pengenceran 20x 1 vol larutan bufer + 19 volume distilled water Stabil untuk 1 bulan pada t 2-8°C

53. CA 125 13/06/2011 Company Logo 42 Sensivisitas : 69,8% Spesifisitas : 72,3% Nilai ramal positif : 49,2% Nilai ramal negatif : 86,2%

54. TMB 13/06/2011 Company Logo 43 3, 3', 5, 5' tetramethyl benzidine (TMB). The substrate can be catalyzed with peroxidase to produce a pale blue color which can be read spectrophotometrically at 370 or 620-650 nm. The TMB reaction may be stopped with 2N H2SO4 or 1M H3PO4 (resulting in a yellow color), and read at 450 nm.

55. HRPO 13/06/2011 Company Logo 44 Nomenclature:donor : hydrogen-peroxide ixidoreductase, EC 1.11.1.7 Molecular weight: 40,000 Isoelectric point: 7.2 Structure: Glycoprotein with one mole of protoheme IX Inhibitors: Cyanide, sulfide, fluoride, azide, hydroxylamine, hydroxyl ions Activators: Peroxidation of o-dianisidine is accelerated by ammonia, pyridine, imidazole at pH values > 7.0 pH optimum: 6.0-6.5 (Figure 1 left) Temperature dependence: See Figure 1 righ t pH stability: 4.0 - 10.0 Thermal stability: Below 60ºC (Figure 2) Specificity: Peroxidase is specific to the hydrogen acceptor; only H2O2, methyl- and ethyl peroxides are active. In contrast, the enzyme is not specific for the hydrogen donor. A large number of phenols, aminophenols, diamines, indophenols, leuco dyes, ascorbate, and several amino acids react.