ELECTROFORESIS
I. Objetivo
El objetivo de este experimento es introducir a los alumnos en el conocimiento de la teoría
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Analítica II
Electroforesis Página 2
no se determina la movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es separar los...
Analítica II
Electroforesis Página 3
IV. Técnica
La velocidad de migración en un sistema electroforético es:
 Inversament...
Analítica II
Electroforesis Página 4
VI. Equipo electroforético
La instrumentación por la cual consta un equipo de electro...
Analítica II
Electroforesis Página 5
Electroforesis capilar:
La electroforesis capilar (EC) es una técnica de separación u...
Analítica II
Electroforesis Página 6
IX. La preparación de muestras generalmente incluye los siguientes pasos:
1. Extracci...
Analítica II
Electroforesis Página 7
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Hibridación del Anticuerpo
La membrana con las proteínas inmovilizadas debe trata...
Analítica II
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Tampón
Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por acción de...
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Electroforesis analitica ii

  1. 1. ELECTROFORESIS I. Objetivo El objetivo de este experimento es introducir a los alumnos en el conocimiento de la teoría electroforética y familiarizarse con los procedimientos implicados en la electroforesis II. Historia El termino electroforesis se refiere a la técnica separativa que emplea un campo eléctrico aplicado que actúa sobre partículas cargadas causando su movimiento a través de una matriz. El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937, su trabajo le valió el premio nobel de 1948. Fue Teselius quien se desarrolló el concepto de frente móvil (moving boundary), que más tarde se conoció como electroforesis de zona y se usos para separar proteínas en solución Entre 1940 y 1960 sobrevino un desarrollo de la electroforesis, aplicándose a diversas moléculas, desde proteínas grandes hasta aminoácidos e iones inorgánicos. A la electroforesis de zona se sumaron además el isoectroenfoque y la isotacoforesis, basadas en diferentes propiedades fiscas. Esto permitió realizar análisis separados en la misma muestra o bien realizar combinaciones de métodos. La distinción entre los tres métodos también se da a nivel de las matrices empleadas en cada una se han usado geles de polímeros, papel y capilares. El papel es fácil de usar dado que no es necesaria una preparación previa, pero con el tiempo se privilegiado el uso de matrices tipo gel, Smithies en 1955 introdujo el uso de geles de almidón, y dos años más tarde Kohn uso acetato de celulosa. En 1959 Ornstein y Davis; Raymond y Weintraub usan un gel de poliacrilamida. Los capilares fueron introducidos por Jorgenson y Lukacs a principios de los 80. Las técnicas de detección han evolucionado con los años también algunas de estas técnicas incluyen el teñido químico, técnicas inmunoelectroforetica, análisis bidimensional y varias técnicas de inmovilización en membranas. Hoy la electroforesis se aplica principalmente al análisis de muestras biológicas. Es ampliamente usada a análisis de DNA para química forense y en la investigación biológica III. Tipos de electroforesis: 1. De frente móvil: Aquella en la cual las partículas se mueven de forma libre en el medio en el que se encuentran dispersas. Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un tampón de pH y fuerza iónica adecuados. Se colocan los electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo eléctrico, provocando que las moléculas de la muestra (por ejemplo: proteínas) cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. 2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a través de un disolvente, utilizando además un medio que soporta a éste. En este caso
  2. 2. Analítica II Electroforesis Página 2 no se determina la movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es separar los componentes de la muestra. 3. Continua: la muestra se aplica también en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo del proceso. III. Fundamento de electroforesis Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión. La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también
  3. 3. Analítica II Electroforesis Página 3 IV. Técnica La velocidad de migración en un sistema electroforético es:  Inversamente proporcional a la viscosidad del medio.  Proporcional a la fuerza aplicada al campo.  Proporcional a la carga neta de la molécula  Inversamente proporcional al tamaño de la molécula.  Inversamente proporcional al coeficiente de fricción. V. Parámetros que influyen en la movilidad electroforética Tenemos: 1) Parámetros externos  Campo eléctrico  Temperatura 2) Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema electroforético  Viscosidad  Fuerza iónica  La naturaleza de los iones componentes  El pH 3) Parámetros relacionados con el soluto  La carga  La forma y tamaño de los iones
  4. 4. Analítica II Electroforesis Página 4 VI. Equipo electroforético La instrumentación por la cual consta un equipo de electroforesis es muy simple constando así de: *Fuente de alimentación o fuente de poder Deben ser capases de realizar la inversión de polaridad permitiendo así disponer de más recursos para optimizar la separación *Dos electrodos - ANODO (+) : es donde se inyecta la muestra -CATODO (-): es donde se detecta la muestra *Cuba de electroforesis -Cubetas: recipientes que contienen buffer -Tampones electrofónicos (buffer): La composición de buffer define el método de análisis, ambos recipientes contienen el mismo buffer y su nivel debe ser el mismo en los dos para evitar cualquier tipo de flujo debido a un desequilibrio hidrostático *Soporte electrofónico (papel o gel): esta es usada para analizar la mescla y determinar la pureza de la muestra
  5. 5. Analítica II Electroforesis Página 5 Electroforesis capilar: La electroforesis capilar (EC) es una técnica de separación utilizada en distintas áreas (química, bioquímica, etc.) para separar las diferentes moléculas presentes en una disolución de acuerdo con la relación masa/carga de las mismas. La separación se lleva a cabo en un tubo hueco de diámetro muy pequeño (menos de 50 µm de diámetro), de ahí que reciba el nombre de capilar. VII. Características de la electroforesis capilar:  Es una poderosa técnica para la separación eficiente de pequeñas y grandes moléculas  Tiempo rápido de análisis  Utiliza pequeñas cantidades de muestra  Bajo costo puede separar proteínas, ácidos nucleicos, iones inorgánicos ácidos orgánicos etc. VIII. Origen y preparación de la muestra Cualquiera sea su origen (proteínas totales o procedentes de un fraccionamiento sub celular), las muestras biológicas sometidas a electroforesis requieren de un tratamiento previo cuya función es liberarlas de todos los componentes no proteicos presentes. Estos son esencialmente: lípidos, ácidos nucleicos, componentes de naturaleza orgánica e inorgánica de baja masa molecular como vitaminas y cofactores, las sales y los iones inorgánicos. La eliminación de estos componentes es un arte del cual depende la calidad de la preparación y por ello el éxito o el fracaso del experimento. Las técnicas utilizadas para eliminar estos componentes tienen que cumplir ciertas condiciones: A) No pueden alterar el perfil de proteínas (es decir, no es posible una técnica que cause la pérdida irrecuperable de ciertas proteínas) B) No pueden introducir modificaciones sobre las proteínas (por ejemplo, no puede trabajarse en condiciones en que las proteasas endógenas sean activas y causen la proteólisis de componentes de la muestra C) El número de pasos debe ser mínimo y su diseño concebido para que al final, la preparación esté en condiciones de ser incorporada al gel de la primera dimensión (focalización) o a cualquier procedimiento de análisis alternativo. Un aspecto crítico es la presencia de sales provenientes de tampones utilizados en la obtención de una preparación. Por ejemplo, el Tris, el fosfato salino (PBS) uso frecuente en bioquímica, focalizan en una región del gel si se encuentran presentes en la preparación final, como consecuencia esa región aparece ¨vacía¨ de proteínas. La conductividad elevada de la muestra provoca el sobrecalentamiento del gel y su daño.
  6. 6. Analítica II Electroforesis Página 6 IX. La preparación de muestras generalmente incluye los siguientes pasos: 1. Extracción o solubilizarían de proteínas. 2. Eliminación de lípidos mediante extracción con solvente orgánico. 3. Eliminación de ácidos nucleicos mediante digestión con nucleasas, con precipitación con compuestos básicos o ultra centrifugación. a. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. b. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativa a cada una de ellas. c. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas.
  7. 7. Analítica II Electroforesis Página 7 .a. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratar-se para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anti-cuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de detección. e. Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se pro-cede a detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de quimioluminiscencia, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de captación de imágenes. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario.
  8. 8. Analítica II Electroforesis Página 8 Tampón Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por acción del campo eléctrico, lo cual genera protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en el cátodo. El tampón es, por esta razón, esencial durante la electroforesis para evitar que el ánodo se acidifique y el cátodo se haga más básico, pero no debe afectar a las moléculas a separar. Además, la fuerza iónica condiciona la movilidad electroforética de las substancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatación y en la conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza iónica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegaría a interferir en el sistema. Normalmente, se emplean tampones con fuerzas iónicas moderadas (0.05-0.10M), siendo el pH la característica que debe ser más controlada, puesto que determina la carga de la muestra. Conviene señalar también que atendiendo a la distribución del tampón, los sistemas se clasifican en Continuos cuando se emplea un único tampón en el proceso, y discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de ph y composición diferentes. Soporte La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie de fenómenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso: •Adsorción. Es una retención inespecífica de las moléculas de la muestra sobre el soporte, por lo que afecta negativamente a la resolución, ensanchando las bandas de migración. •Electro-endósmosis (EEO). Es un fenómeno que se da en algunos soportes (sobre todo en los no reductivos tipo I), en los que aparecen cargas negativas, debido a grupos carboxilo o sulfato, al estar en
  9. 9. Analítica II Electroforesis Página 9 contacto con una disolución iónica. Al aplicar el campo eléctrico, los iones y las moléculas se desplazan según su carga, pero en su migración se encuentran con un flujo de cationes desplazándose sobre la superficie del soporte y otro de aniones haciéndolo por el centro de los poros (Fig. 9). Este flujo orientado se llama flujo electro-endosmótico. El EEO va en contra de la resolución de una electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuirá a una mejor resolución en las inmuno-electroforesis y en la electroforesis. •Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los soportes; cuanto más tupida sea la red de fibras, menores serán los poros. El movimiento de las moléculas a través del soporte es más o menos fácil en función de su tamaño respecto al de los poros; aquellas moléculas cuyo tamaño se aproxime al del poro, verá impedido su avance respecto a aquellas cuyo tamaño sea muy inferior. Por esta razón, el soporte actúa como un cedazo que separa o tamiza las moléculas en función de su tamaño. IX. Referencias Páginas web  CASTELLANO. L., INTRODUCCIÓN ALGUNOS CONCEPTOS BÁSICOS. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162, CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba. Http://elfosscientiae.cigb.edu.cu/pdfs/Muestras/chapter20.pdf  Http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/plataformas_de_proteomica.pdf  Http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf  http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf  http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/plataformas_de_proteomica.pdf

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