Tema 4 Rocas sedimentarias, características y clasificación
Seminario y trabajo práctico nº 1 2014
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos
Seminario y trabajo práctico Nº 1
Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y
cianuros alcalinos
Editor: Prof. Dra. Edda C. Villaamil Lepori
Autores: Prof. Bioq. Adriana Ridolfi; Bioq. Gloria Álvarez
2014
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos
1.1 MONÓXIDO DE CARBONO
1.1.1 -Introducción
El monóxido de carbono (CO) es un gas tóxico, inodoro, incoloro, no irritante, más
liviano que el aire.
Es la causa principal de muerte por intoxicación en los Estados Unidos y en Argentina
ocurren alrededor de 3000 casos de intoxicaciones anuales siendo fatales entre 250 y
300 casos.
Fuentes de monóxido de carbono:
Se produce por la oxidación incompleta durante la combustión de gas, carbón o de
querosén, en hornallas, braceros, estufas de gas y en los calentadores portátiles sin
respiraderos, lo puede generar emanaciones con concentraciones altas de monóxido de
carbono en el medio ambiente interior.
Se combina con la hemoglobina para formar carboxihemoglobina, que es incapaz de
transportar oxígeno, por lo que se produce anoxia tisular.
Las muestras que se utilizan en el análisis de CO pueden ser:
a) Biológicas: sangre entera. Se emplea para control laboral o de una posible
intoxicación (accidental o intencional) y también en el ámbito forense como posible
causa de muerte.
b) No biológicas: muestras de aire para controles en el ambiente de trabajo y para
investigar la calidad del aire ambiental en las ciudades.
1.1.2 - Métodos analíticos
Existen variados métodos analíticos para la investigación cualitativa y cuantitativa del
monóxido de carbono en sangre. Se pueden clasificar en métodos físicos y métodos
químicos.
Algunos métodos físicose basan en la mayor estabilidad de la carboxihemoglobina
(COHb) respecto de los demás pigmentos hemáticos y otros investigan la presencia de
CO gas. A su vez comprenden métodos no-instrumentales e instrumentales. Dentro de
los primeros se encuentra el Ensayo de dilución y el Ensayo alcalino.
Las técnicas instrumentales incluyen varias metodologías como las espectroscópicas,
espectrofotométricas, gasométricas, calorimétricas, absorción al IR y cromatografía
gaseosa.
Los métodos químicos se basan en el poder reductor del CO. Esta característica
permite emplear sales de Pd2+ o el I2O5.
De todos los métodos que se disponen hoy en día para la determinación de monóxido
de carbono, el método físico instrumental cooximétrico es el mayormente utilizado en
los laboratorios toxicológicos, clínicos y forenses. Esto se debe a la facilidad de
operación del instrumental, la poca muestra necesaria (sangre alrededor de 0,1 ml) y
por la rapidez de la obtención de los resultados.
Método de referencia para la determinación de CO en aire
Se basa en la absorción de radiación infrarroja (RI) por el CO, en un fotómetro no
dispersivo. La radiación IR producida pasa por 2 celdas iguales, una conteniendo un
detector selectivo y la otra CO. El CO en la celda absorbe RI en sus frecuencias
características y el detector es sensible a esas frecuencias. Con un gas diferente que
no tenga CO en la celda de muestreo las señales están balanceadas electrónicamente.
Si se introduce CO en la celda de muestreo absorberá RI la cual será detectada
electrónicamente y produce una señal de salida.
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Existen en el mercado instrumentos manuales para medir CO en el aire como el que se
muestra en la figura 1.
Figura 1.- Instrumento de medición de 0 a 2000 ppm de CO
1.1.2.1- Métodos Físicos
a)- Métodos no instrumentales (Cualitativos)
Ensayo de dilución (Haldane)
El método consiste en la comparación a simple vista de la coloración de la muestra de
sangre sospechosa diluída con otra normal en igual dilución. Una alícuota de sangre
normal y otra de la muestra en estudio se diluyen con agua, generalmente al 1%, y se
comparan los colores. La sangre normal tiene habitualmente un color rojo amarillento
mientras que si la muestra desconocida tiene COHb, el color serácarminado rosado
típico indicador de la presencia de COHb Es un método de baja sensibilidad
detectándose diferencia de color cuando la saturación de la hemoglobina con CO es
mayor del 30%.
Ensayo alcalino
Se basa en la mayor estabilidad de la COHb, dentro de ciertos límites, con respecto a
la labilidad del pigmento hemático normal (Hb) en un medio alcalino.
Una muestra de sangre normal y la muestra de sangre en estudio se diluyen con agua,
se agrega a ambas muestras NaOH y se observa el color.
La sangre normal adquiere color castaño por transformación de la Hb en hematina
alcalina. La hematina es la globina desnaturalizada que tiene el Fe como Fe3+.
La sangre con COHb mantiene por unos minutos su color carminado, porque la COHb
es más resistente y más estable al tratamiento por álcalis. Luego de varios minutos
también se transformará en hematina, por lo tanto es importante la observación
inmediata.
Este ensayo tiene como interferencia la sangre fetal o de recién nacido ya que la Hb
fetal es resistente al tratamiento con álcalis y por lo tanto se comporta como laCOHb.
La sensibilidad de este ensayo es superior a la del método anterior, ya que con un
porcentajede saturación de la Hb con CO superior al 10%, se puede diferenciar de una
normal.
b)- Métodos instrumentales
Métodos Espectrofotométricos
Se basan en la determinación de la Absorbancia a longitudes de onda características
dentro del espectro visible. Estas Absorbancias son generalmente máximas, mínimas o
puntos isosbésticos. De esas diferencias de absorbancia a distintas longitudes de onda,
se obtiene la concentración de COHb de la muestra. Existen distintas técnicas con gran
cantidad de interferencias: se debe trabajar en condiciones estrictas de pH y
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temperatura. Los picos de Absorbancia de la OHb y COHb son cercanos, la
concentración de COHb debe ser elevada para que no interfiera la OHb.
Sensibilidad: alrededor del 5% de saturación de COHb en la muestra de sangre. Hasta
un 5% de saturación se puede detectar trabajando en condiciones preestablecidas.
Cooximetría
El Cooxímetro (figura 2) es un analizador semiautomático capaz de medir la
concentración de Carboxihemoglobina (COHb) y otras hemoglobinas en muestras de
sangre entera. Básicamente estos equipos son fotómetros para múltiples longitudes de
onda. Realizan la lectura de la absorbancia a 4 o 5 longitudes de onda para una
muestra de sangre hemolizada y mediante algoritmos programados calculan la
proporción de cada componente de la hemoglobina total. Las fracciones analizadas
son: desoxihemoglobina, oxihemoglobina, sulfohemoglobina, metahemoglobina y
carboxihemoglobina.
Emplean filtros de interferencia para seleccionar una línea dada del espectro de
emisión de una lámpara de cátodo hueco de Tl-Ne. No requieren calibración habitual
de la longitud de onda.
Los cálculos son realizados por un microprocesador incorporado el cual a partir de las
mediciones de la absorbancia y las constantes de absortividad de las distintas
fracciones calcula su concentración y, cada fracción es sumada para obtener la
concentración de hemoglobina total.
La muestra utilizada es sangre entera anticoagulada con heparina. El volumen de
sangre utilizado varía según los distintos modelos de cooxímetros, hay equipos en los
cuales se inyectan muestras directamente de capilares heparinizados. La muestra se
puede conservar hasta 24 horas a 4ºC. Pueden interferir en la determinación elevados
niveles de bilirrubina y muestras lipémicas.
Figura 2 - Cooxímetro
Absorción al IR
El CO tiene una absorción característica en el infrarrojo (IR). El CO se libera de la
sangre por agregado de ferricianuro de potasio. El gas liberado absorbe al IR estando
los picos entre 2120 – 2170 cm–1
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Cromatografía gaseosa
Es el método de elección cuando hay otros gases interferentes. Tiene gran sensibilidad
y puede detectar hasta 0,5% de saturación de CO en sangre.
1.1.2.2- Métodos Químicos
Microdifusión
Fundamento de la microdifusión
La cámara de Conway (Figura 3) consiste en un receptáculo con dos compartimientos
concéntricos, generalmente de porcelana, y una tapa de vidrio esmerilada.
Se utiliza para la separación de compuestos volátiles o gaseosos, fijándolos en una
solución apropiada para luego cuantificarlos.
La tapa de vidrio permite un cierre hermético, cuando se le aplica el sellador en sus
bordes (vaselina sólida, etc.)
Figura 3. Cámara de Conway
En el compartimiento externo se coloca el material, el cual contiene el tóxico volátil o
gaseoso y en el compartimiento interior una solución fijadora del tóxico apropiada para
cada caso. El principio en el cual se basa el aislamiento de los compuestos volátiles o
gaseosos es el siguiente:
Cuando una solución de un gas o compuesto volátil A, al colocarla en un recipiente
hermético se establece el siguiente equilibrio:
Recién colocada la solución en el recipiente, el equilibrio se desplaza hacia la derecha,
o sea:
Luego de cierto tiempo se llega al punto de equilibrio y se tiene:
Si se repite la experiencia, pero se coloca la solución del compuesto A en el
compartimiento externo de la cámara de Conway y en el compartimiento interno una
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sustancia o solución fijadora del compuesto A, lo que ocurre es un nuevo
desplazamiento hacia la derecha
Esto ocurre hasta que se agote el compuesto A en la solución inicial. Para ayudar y
mejorar la liberación se agrega a la muestra a investigar un reactivo liberador, por
ejemplo ácido sulfúrico diluído en el caso de CN-:
El tiempo de difusión dependerá de la temperatura y de cada tipo de sustancia. A
mayor temperatura menor tiempo de difusión. No se aconseja elevar la temperatura
(colocando en estufa por ejemplo), ya que aumentan las probabilidades de pérdida del
compuesto volátil o gaseoso. Para cada tipo de microdifusión está estandarizado el
tiempo de difusión a temperatura ambiente.
Los mecanismos por los cuales se fijan los compuestos a los reactivos fijadores pueden
ser varios. Para el caso del CO ocurre una reacción redox. En otros casos es por
solubilidad y en otros por reacción ácido-base.
Determinación cuantitativa de monóxido de carbono por microdifusión
Se coloca en el compartimiento interno el reactivo fijador Cl2Pd 0,01N. Luego se coloca
la sangre en el compartimiento externo, se tapa la cámara y se desplaza el vidrio
dejando un pequeño espacio de la cámara externa abierto, del lado opuesto al que se
agregó la sangre y por él se agrega el reactivo liberador (SO4H2 10%). Se cierra la
cámara y se mezclan (liberador y muestra) por rotación. Se deja difundir una hora a
temperatura ambiente.
Entre el Pd2+ y el CO, se produce la siguiente reacción redox:
Como consecuencia aparece en la cámara interna una pátina de color metálico (Pd°)
Si se pretende efectuar la determinación cuantitativa, hay que proceder a centrifugar
el contenido del compartimiento interno para eliminar el Pd°. Se toma
cuantitativamente 0,1 ml del sobrenadante y se transfiere a un matraz aforado. Se
toma igual volumen de la solución de Cl2Pd original y se coloca en otro matraz aforado
(blanco de reacción). A ambos se agrega goma arábiga (para evitar la precipitación del
I2Pd) y solución de IK. Se lee la absorbancia del complejo coloreado formadoa 500 nm:
Cálculos
La solución fijadora de cloruro de paladio es 0,01N (0,222 g de cloruro de paladio en
250 ml de vehículo), que corresponde por lo tanto a 0,888 gramos por litro.
donde 177,61 gramos, es el peso molecular de cloruro de paladio, el cual contiene
106,7 gramos de paladio metálico. Esto equivale a 0,5335 mg por ml de la solución
reactivo 0,01N. De acuerdo a la ecuación redox antes señalada, cada mol de paladio es
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reducido por un mol de monóxido de carbono, es decir que 177,61 mg de cloruro de
paladio son reducidos por 28 mg de monóxido de carbono.
Por lo tanto:
Por lo tanto, 0,26 es el factor de transformación para expresar mg de paladio enmg de
monóxido de carbono.
Una vez determinada la densidad óptica del complejo [I4Pd]2-, los mg de paladio
reducido se calculan de la manera que sigue:
Db= Absorbancia del blanco y Dd = Absorbancia del desconocido o muestra
y
donde 0,05335 corresponde a los mg de Pd en 0,1 ml de la solución de cloruro de
paladio.
Para expresar ese resultado en mg por ciento de monóxido de carbono, se debe
multiplicar por 520, factor que proviene de multiplicar 2 x 10 (para referir al volumen
inicial de sangre y de acuerdo con la dilución), por 100 para referir a 100 ml de
sangre y por 0,26 (factor de transformación), resultando que: 2 x 10 x 100 x 0,26 =
520
Por lo tanto:
ó
Los mg de CO pueden expresarse en ml de CO, por medio de un factor que es igual a
0,8 ya que 1 mol de gas equivale a 22,4 l en las condiciones normales de presión y
temperatura.
Por lo tanto:
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El valor se lo suele referir a la cantidad de Hb de la sangre problema (por ejemplo “a”
g), expresando el CO hallado como porcentaje de saturación de la Hb total, sabiendo
que:
1.1.3- Interpretación del resultado
Comúnmente, los valores registrados en casos de intoxicaciones fatales son superiores
al 50% de saturación de la hemoglobina total.
Valores fisiológicos
No fumadores Menor a 0,6% Hb total
Fumadores 3,0-8,0% Hb total
BEI (Índice Biológico de Exposición) menor a 3,5% Hb total
Efectos en la salud humana por exposición a monóxido de carbono
Concentración de HbCO
en sangre (%)
Efecto observado
2,3-4,3 Disminución en la capacidad de realizar un ejercicio máximo en
un corto tiempo en individuos jóvenes saludables
2,9-4,5 Disminución en la duración de ejercicio, debido a dolor en el
pecho (angina), en pacientes con enfermedades al corazón.
Disminución del consumo máximo de oxígeno y tiempo para
realizar ejercicio, en individuos jóvenes saludables durante
ejercicio fuerte.
5-5,5 Disminución en la percepción visual y auditiva. Pérdida de la
capacidad sensorial, motora y de vigilancia.
5,0-17,0 Disminución en el consumo máximo de oxígeno durante el
ejercicio fuerte, en individuos jóvenes saludables.
7,0-20,0 Dolor de cabeza, decaimiento.
20,0-30,0 Mareo, náusea, debilidad
30,0 Confusión, colapso durante el ejercicio
40,0 Pérdida de conciencia y muerte si la exposición continúa
50,0 Muerte
Fuente: OMS: http://www.bvsde.paho.org/cursoa_orientacion/lecc4/lecc4_co.html
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1.2- ACIDO CIANHÍDRICO Y CIANUROS ALCALINOS
1.2.1- Introducción
La intoxicación aguda por compuestos derivados del HCN puede deberse a ingestión de
cianuros alcalinos (de sodio o potasio, los más comunes), o a inhalación del HCN
gaseoso. La intoxicación por ingestión de glucósidos cianogenéticos como los
contenidos en los frutos del albaricoque, almendras amargas, etc.,es poco frecuente
pero puede ocurrir especialmente en niños.
La intoxicacióncrónica puede deberse a la exposiciónal HCNde los trabajadores de
ciertas industrias como galvanoplastia, limpieza de metales, síntesis química,
investigación, etc.
1.2.2-Investigación del Ácido cianhídrico y los Cianuros alcalinos
Existen tres clases de determinaciones: los ensayos inmediatos, los ensayos mediatos
y los procedimientos cuantitativos
Ensayos inmediatos
Son procedimientos cualitativos, que se realizan en la atmósfera del recipiente que
contiene el material a analizar. Los materiales donde se determinan CNH y Cianuro
pueden ser: vísceras (cadáver); sangre y orina si el individuo no ha muerto; alimentos
(muchos vegetales que contienen glucósidos cianogenéticos y que al ser ingeridos, por
acción de enzimas que se encuentran tanto en el hombre como en animales, liberan
CNH); alimentos con agregado intencional de cianuro; etc. En tejidos y alimentos los
cianuros están fijos como cianuros alcalinos.
El recipiente que contiene la muestra debe estar cerrado herméticamente para evitar
pérdidas y la exposición del personal que está en contacto con el recipiente.
En la atmósfera del recipiente se libera CNH, ello se puede deber a dos tipos de
procesos:
Proceso hidrolítico:
El equilibrio se desplaza hacia la derecha a medida que se desprende el gas HCN.
Si se trata de vísceras, por efecto putrefactivo se libera CNH de acuerdo con:
Estos métodos permiten identificar CNH en forma rápida, en base a la utilización de los
llamados “papeles sensibles”. Consisten en utilizar tiras de papel de filtro
impregnadas con ciertos reactivos que se introducen en la atmósfera del recipiente
Se describen tres ensayos mediante papeles sensibles:
Ensayo de Guayaco-cúprico o de Schömbein
Se toma una tira de papel de filtro y en uno de los extremos se agrega una gota de
SO4Cu 0.5%, inmediatamente sobre la gota anterior se agrega una gota de resina de
Guayaco y se coloca la tira en el recipiente en el cual se quiere investigar la presencia
de HCN sin que tome contacto con el material que lo contiene.
Se considera un resultado positivo cuando aparece un color azul intenso, negativo por
aparición de color castaño (color de la resina de Guayaco) y dudoso por observación
después de varios minutos de un color verde o azul débil.
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Cuando se sospeche que hay poca cantidad de CN- en la muestra en estudio, deberá
agregarse ácido tartárico, porque es más fuerte que el HCN y lo desplaza de sus
combinaciones. Calentando a 60°C durante 30 minutos se desplazan los CN- fijos a
HCN. Se repiten las determinaciones con nuevos papeles; si se obtiene color azul
intenso, el ensayo es positivo; si da dudoso nuevamente se descarta la presencia del
ión CN-.
Valor analítico del ensayo
Cuando es negativo, permite descartar la presencia de CN- ya que es muy sensible
pero muy poco específico.
La poca especificidad se debe a:
Presencia de oxidantes directos de la resina de Guayaco, por ejemplo, ClO-, ClO3
-,
nitratos y nitritos, dan falsos positivos.
Presencia de reductores: estos reducen las sales de Cu2+ y actúan de la misma forma
que el cianuro, dan falsos positivos.
Para descartar la presencia de oxidantes directos, en el mismo procedimiento, se usa
una tira de papel sólo con resina de Guayaco (sin SO4Cu); si la reacción da positiva al
introducirla en el recipiente (azul), existen oxidantes directos.
Si no da color azul (o sea es negativo, se agrega SO4Cu a la misma tira. Si ahora se
observa un color azul, se puede pensar que hay cianuros presentes.
Si el resultado fuera negativo se descarta la presencia de cianuros.
Entonces si el ensayo resultara negativo se descarta la presencia de cianuros en el
material, y si fuera positivo se aplican otros métodos más específicos.
Fundamento
Las sales de Cu al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas aumentan su
potencial de oxidación. Esto se puede aprovechar si colocamos una sustancia que al
oxidarse cambie de color, como la resina de Guayaco o ácido guayacónico, que es de
color castaño y vira al azul.
Primero se forma una sal inestable (CN)2Cu, que pasa a CNH y CNOH, este último
responsable de la oxidación del ácido guayacónico que da azul de guayaco, lo que
permite visualizar la reacción del CNH sobre el Cu2+.
Sensibilidad
Según algunos autores: 1:3 x 106. Según otros autores: hasta 0,25 microgramos de
ácido cianhídrico
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Ensayo de o-tolidina
Fundamento
Tiene igual fundamento que la reacción anterior pero la visualizaciónse hace con o-tolidina;
también se pueden usar: bencidina, fenolftaleína o cualquier sustancia que al
oxidarse forme un complejo coloreado.
Complejo que se forma con la o-tolidina al oxidarse dos moléculas de este reactivo es
el que se indica en la figura 2-1.
Figura 1.2.1- Complejo coloreado de la o-tolidina oxidada
Valor analítico del ensayo:esta reacción es altamente sensible pero inespecífica.
Si los ensayos Guayaco-cúprico y de o-tolidina dan positivos se realiza un tercer
ensayo, más específico.
Ensayo de Magnin
Este ensayo es poco sensible pero muy específico. Se basa en la formación de Azul de
Prusia. Para ello se impregna la tira de papel en NaOH, se pone en contacto con la
atmósfera del recipiente y se deja actuar unos minutos. El NaOH fija el CNH como CN-de
acuerdo a la siguiente ecuación:
Luego se agrega a la tira SO4Fe. Se observa la formación de un precipitado verdoso
que luego pasa a castaño. Finalmente por agregado de unas gotas de ClH da color azul
por formación del Azul de Prusia de acuerdo a las siguientes ecuaciones:
El Fe(OH)2 es inestable, y se oxida por acción del O2 del aire precipitando como
Fe(OH)3 de color castaño, por lo tanto:
y por agregado del HCl:
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Siempre se efectúan por lo menos dos reacciones: una muy sensible (resina de
guayaco u o-tolidina) y otra muy específica (Magnin). Si las dos reacciones dan
positivas se procede al aislamiento.
Ensayos Mediatos
Si los ensayos inmediatos dieran positivos, se procede posteriormente a efectuar los
Ensayos Mediatos. Para ello primero se procede al aislamiento y luego a la
identificación del ión CN-. Este ión puede investigarse mediante la Formación de Azul
de Prusia (directo y modificado); por transformación en sulfocianuro (SCN-) o por la
Reacción de Aldridge.
Aislamiento
Se hace por destilación simple (figura 2.2). Se agrega ácido tartárico al material, se
destila y se recoge el HCN en NaOH para fijarlo.
Figura 1.2.2– Destilación simple
Si el material es visceral no debe conservarse en formol porque reacciona con el HCN
formando cianhidrinas de las que no se puede liberar HCN, por lo tanto no se podría
identificar.
En el caso de vísceras en estado de putrefacción agregar al material a destilar acetato
básico de plomo para retener el SH2.
Reacciones de identificación sobre el destilado
Reacción del azul de Prusia directa
Se usan los mismos reactivos y tiene el mismo fundamento que la reacción en papel.
Se toma una porción del destilado (donde el CN- ya está fijo) y se agrega SO4Fe, se
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deja unos minutos al aire (toma color castaño) y finalmente se añade ClH dando un
precipitado de color azul.
Es una reacción de muy baja sensibilidad (1:10000)
Reacción del azul de Prusia modificada o método de Chelle-Klassen
La modificación consiste en ajustar previamente el pH a 8,0, medio en el cual va a
precipitar luego el azul de Prusia. El ajuste se hace usando fenolftaleína como indicador
(en medio básico, rosada), se agrega solución diluido de SO4H2 que la hace virar a
incolora y luego por agregado de borato o carbonato de sodio se lleva a pH alcalino
aproximadamente igual a 8. Luego se lleva a cabo la reacción del azul de Prusia.
Mediante esta modificación aumenta la sensibilidad hasta 10 microgramos de ión
cianuro.
Si se tienen cantidades muy pequeñas se puede aumentar aún más su sensibilidad. En
estos casos el azul de Prusia no precipita sino que queda como coloide suspendido.
Se agrega entonces Cl2Ba, se forma SO4Ba que arrastra al azul de Prusia,
concentrándose en el fondo del tubo de ensayo, en forma de un “botón” azul o blanco
azulado.
Sensibilidad: hasta 5 microgramos de ión cianuro.
Reacción de Aldridge
Es una reacción cualitativa, que se recomienda también para determinaciones
cuantitativas (con el mismo fundamento se la utiliza en microdifusión).
Esta determinación puede realizarse sobre el destilado, y en muestras de sangre y
orina. Cuando no se usa el destilado la muestra debe desproteinizarse previamente
(generalmente con tricloroacético).
El destilado o el desproteinizado se acidifican con AcH y posteriormente se agrega
agua de Br2 saturada. El CN- reacciona con el Br2:
Generalmente queda un exceso de Br2 (amarillo) que debe ser eliminado por el
agregado de arsenito de sodio decolorándose la solución. Luego se agrega un reactivo
a base de Piridina en medio ácido: Reactivo Pirídico (Piridina diluida y acidificada).
Este compuesto es inestable, se descompone por un proceso hidrolítico y se rompe el
anillo. Queda el aldehído glutacónico (alcohol en un extremo y aldehído en el otro).
Si se le agrega una amina primaria cíclica, bencidina por ejemplo, se forma una base
de Schiff en los extremos y se obtiene un compuesto coloreado:
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Sensibilidad: hasta 3 microgramos de ión cianuro.
1.2.3-Métodos Cuantitativos
Existen macro y microtécnicas. Son ejemplo de macrotécnicas las técnicas
volumétricas; y de microtécnicas la microdifusión en Cámara de Conway.
Se utilizan microtécnicas para la determinación del ión cianuro por los siguientes
métodos de microdifusión: Tompsett y Feldstein y Klendshoj. Existen otras variantes
dentro de estos procedimientos.
Microdifusión: Reacción de Tompsett
Se utiliza la cámara de Conway (fig. 2.3) la cual se sella con un vidrio esmerilado,
lubricado previamente con vaselina o sellador, para evitar pérdidas.
Figura 1.2.3- Esquema de la cámara de Conway
Se usan los mismos reactivos y tiene el mismo fundamento que la reacción de
Aldridge.
Las muestras que se usan son homogenatos de vísceras, sangre u orina.
El reactivo liberador (compartimiento externo) es el ácido sulfúrico. Su concentración
depende del tipo de microdifusión usada. El reactivo liberadordebe ser un ácido más
fuerte que el HCN para desplazarlo de las uniones.
El reactivo fijador (compartimiento interno) es NaOH.
Tiempo de difusión: 3 – 4 hs. a temperatura ambiente.
Una vez fijado el CN- se procede a su cuantificación.
Se coloca el contenido de la cámara interna en un tubo de ensayo, se acidifica con
ácido acético, luego se adiciona agua de Br2, arsenito para eliminar el exceso de Br2 y
finalmente el reactivo piridina-bencidina.
Se lee la absorbancia del compuesto coloreado (rosa-rojo) a 520 nm, se interpola en la
curva de calibración construída previamente con distintos estándares de CN- y se
obtiene la cantidad de cianuro presente en la muestra.
Microdifusión: Reacción de Feldstein y Klendshoj
El reactivo liberador es ácido sulfúrico. El reactivo fijador es NaOH.
Tiempo de difusión: 3 – 4hs. a temperatura ambiente
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Para su cuantificación se utiliza la reacción de Aldridge pero difieren los reactivos.
Los reactivos que se utilizan son fosfato monosódicopara regular el pH, cloramina T en
lugar de Br2 acuoso, finalmente se agrega piridina – ácido barbitúrico.
Por reacción con la Cloramina T se forma el cloruro de cianopiridina que se
descompone y reacciona con el ácido barbitúrico. Se lee la absorbancia del compuesto
formado a 580 nm (color lila-violeta).
Valores normales de CN- en un individuo adulto
Hasta 15 μg% el CN- aparece como producto del catabolismo normal en pequeñas
cantidades.
En la intoxicación por inhalación de ácido cianhídrico. Valores mayores de 100 μg%
suelen ser fatales, pero esto varía de un individuo a otro.
En la intoxicación por ingestión de cianuros los valores suelen ser mayores aún 1-2
mg%.
La ingestión de 200 mg de CNNa puede provocar la muerte de un individuo adulto.
En muestras de sangre cadavérica el CN- desaparece rápidamente por acción
enzimática y bacteriana. Debe conservarse la muestra con FNa al 1% para evitar
dichas acciones.
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1.3- TRABAJO PRÁCTICO Nº 1: MONÓXIDO DE CARBONO Y
ÁCIDO CIANHÍDRICO Y CIANUROS ALCALINOS
1.3.1-TRABAJO PRÁCTICO: MONÓXIDO DE CARBONO
Desarrollo del trabajo práctico- Actividades a realizar
Los alumnos serán divididos en grupos de trabajo.
A cada grupo se le asignarán distintas muestras que deberán analizar.
Al finalizar el TP, cada grupo deberá presentar un informe con los resultados
analíticos y una discusión en base a los datos obtenidos.
1.3.1.1- Determinación Cuantitativa de Monóxido de Carbono
Método de Feldstein-Klendshoj (en sangre por Microdifusión)
Medidas de seguridad
Cada reactivo debe ser considerado como un peligro potencial a la salud y la
exposición a estos compuestos debe ser minimizada con buenas prácticas de
laboratorio.
Fundamento
Se basa en el poder reductor del monóxido de carbono, que actuando sobre una
solución de Cl2Pd, lo transforma en Pd°. La sal de paladio origina, con el ion ioduro, un
complejo coloreado de máxima absorción a 500 nm. Conociendo la absorbancia del
complejo formado a partir de la solución blanco de Cl2Pd y la que reaccionó con el CO
se establece la concentración de COHb presente en la muestra.
Muestra
Sangre entera (un volumen mínimo de 5 ml) obtenida por punción venosa con
heparina como anticoagulante. Una vez extraída la muestra rotular el recipiente que la
contiene. Si se trasvasa la sangre a un tubo, éste deberá estar limpio, seco y cerrarse
herméticamente.
Conservación de la muestra. Cuando no se realice el análisis en forma inmediata se
puede conservar durante 3 días entre 2 y 8ºC.
Reactivos
Solución de cloruro de paladio 0,01N: Disolver 0,222 g de cloruro de paladio en c.s.
de ácido clorhídrico 0,01N, calentando si fuera necesario. Completar a 250 con dicha
solución.
Ácido sulfúrico 10% (v/v)
Goma arábiga al 0,1% (p/v)
Solución de ioduro de potasio al 15% (p/v)
Materiales
Cámara de Conway
Matraces aforados de 10,0 ml
El habitual de laboratorio que se incluirá en el procedimiento.
El tratamiento del material de vidrio será mediante lavado con detergente y enjuagado
con agua de grifo, 3 veces. Luego enjuagado con agua destilada, 3 veces y secado en
estufa.
Tratamiento del material de trabajo
Lavado con detergente y enjuagado con agua de grifo, 3 veces
Enjuagado con agua destilada, 3 veces
Secado en estufa
Instrumental
Espectrofotómetro UV-visible.
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos
Procedimiento
En una unidad de Conway, colocar en el compartimiento interno, 2,0 ml de la
solución de cloruro de paladio 0,01N y en el compartimiento externo, 1 ml de sangre y
1 ml de ácido sulfúrico al 10%, en la parte opuesta a la que se colocó la sangre.
Cubrir la cámara con la respectiva tapa de cierre ya preparada con la vaselina
siliconada a fin de asegurar un cierre hermético y mezclar la sangre con el ácido
sulfúrico mediante un suave movimiento de rotación.
Dejar difundir 1 hora a temperatura ambiente. Si no hay cambio en el aspecto de la
solución reactiva, el ensayo puede considerarse negativo. De existir monóxido de
carbono aparece, en la superficie de la solución de Pd+2, una pátina plateada debido a
la formación de paladio metálico.
Determinación espectrofotométrica
Con una pipeta capilar extraer la totalidad de la solución del compartimiento interno
de la cámara de Conway, compuesta por paladio metálico y exceso de la solución de
Pd+2, y colocar en un tubo de centrífuga.
Centrifugar a 3000 rpm, para separar el precipitado de Pdo.
Trasvasar 0,1 ml del sobrenadante a un matraz aforado de 10,0 ml. (ver esquema de
trabajo)
En otro matraz de 10,0 ml colocar 0,1 ml de la solución de paladio 0,01N el que se
utilizará como blanco.
A cada matraz agregar 1 ml de solución de goma arábiga al 0,1% y 1 ml de IK al
15%.
Mezclar bien y llevar a volumen con agua destilada.
Determinar la densidad óptica a 500 nm llevando a 0 con agua destilada en el
espectrofotómetro.
Esquema de trabajo para la determinación espectrofotométrica de la COHb
En matraz aforado de 10 ml Muestra Blanco
Sobrenadante 0,1 ml -
Solución de Paladio - 0,1 ml
goma arábiga al 0,1% 1 ml 1 ml
IK al 15% 1 ml 1 ml
Agua destilada Llevar a 10 ml
Mezclar
Leer absorbancia a 500 nm
El exceso de la sal de paladio, Pd2+, origina con el ión ioduro, un complejo coloreado de
máxima absorción a 500 nm.
Cálculos
La concentración de CO expresada en mg% se calcula de acuerdo a la ecuación:
Ejemplo:
En una determinación practicada en una muestra de sangre de un sujeto fallecido por
inhalación de monóxido de carbono se hallaron los siguientes valores para las lecturas
de absorbancia:
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos
por lo cual
Luego,
Para expresar el resultado en por ciento de saturación (porcentaje de saturación de la
hemoglobina), es necesario conocer el tenor en hemoglobina. En el caso citado, la
muestra acusó un tenor de 13 gramos por ciento de hemoglobina, entonces:
Como 1 g de hemoglobina fija 1,34 ml de monóxido de carbono, 13 gramos fijarán:
13x1,34 = 17,42 ml.
Luego,
1.3.2- TRABAJO PRÁCTICO: CIANUROS
1.3.2.1- Ensayos inmediatos
Muestra
Cualquiera fuere su naturaleza (vísceras, líquidos biológicos, alimentos) deben
acondicionarse en recipientes bien limpios y secos, sin agregado de sustancia
alguna como conservador. El único medio de conservación aplicable es el frío.
La identificación inmediata del ácido cianhídrico de cianuros alcalinos se efectúa en
forma directa en la atmósfera del recipiente que contiene el material a analizar. La
liberación del ácido cianhídrico se debe a un proceso hidrolítico que prosigue en
variada magnitud según las condiciones del medio.
Ensayo con o-Tolidina
Fundamento del método
Se basa en la misma interpretación dada para el ensayo guayaco-cúprico. El color azul
es imputable a un derivado de estructura meriquinoide, similar al que produce la
bencidina.
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos
Reactivos
Solución acuosa de sulfato de cobre al 0,5%.
Solución alcohólica de o-Tolidina al 1%.
Materiales
Papel de filtro de 2 x 15 cm.
Cápsula de porcelana.
Varilla de vidrio.
Procedimiento
Humectar una tercera parte del papel de filtro con la solución de sulfato de cobre
0,5% y luego, mediante una varilla de vidrio, extender sobre la superficie humectada I
gota de solución alcohólica de o-tolidina al 1%.
Colocar el papel en el interior del recipiente que contiene el material a analizar.
En presencia de ácido cianhídrico se observa en forma inmediata color azul verdoso
que rápidamente vira al azul neto.
La aparición de color azul tenue por exposición prolongada no tiene significación
analítica.
Interferencias
Oxidantes directos de la o-tolidina
Reductores que actúen de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre.
Valor analítico del ensayo
Tiene valor cuando es negativo ya que es una reacción inespecífica. Cuando es positivo
requiere confirmación por ensayos específicos.
Sensibilidad: es una reacción altamente sensible.
Ensayo de Magnin
Fundamento del método
Se basa en la obtención del denominado azul de Prusia
Reactivos
Solución acuosa de hidróxido de sodio al 2%
Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% (preparación reciente)
Ácido clorhídrico concentrado pa
Materiales
Papel de filtro de 2 x 15 cm
Cápsula de porcelana
Procedimiento
Impregnar el papel de filtro con I-II gotas de la solución de hidróxido de sodio al 2%
y exponer en el interior del recipiente durante algunos minutos.
Retirar y extender sobre una cápsula de porcelana.
Distribuir sobre la superficie expuesta IV gotas de solución de sulfato ferroso 2%:
aparece un precipitado verde (hidróxido de Fe+2), que se oscurece paulatinamente
(hidróxido de Fe+3)
Dejar al aire unos minutos para favorecer la oxidación del ión ferroso.
Acidificar con unas gotas de ácido clorhídrico concentrado: en presencia de ión
cianuro aparece precipitado azul de Prusia.
Valor analítico
El ensayo de Magnin constituye un recurso analítico categórico para demostrar la
existencia de ácido cianhídrico dada su especificidad.
Sensibilidad: es un ensayo menos sensible que los descriptos anteriormente.
1.3.2.2-Ensayos Mediatos
Se trata del aislamiento e identificación del ácido cianhídrico a partir de los cianuros
alcalinos.
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos
El aislamiento se realiza por destilación simple en medio ácido (se acidifica el material
conácido tartárico al 10%), recogiendo el destilado en solución acuosa de hidróxido de
sodio al 10%. Los ensayos mediatos se efectúan sobre el destilado.
Ensayo de Azul de Prusia directo
Fundamento
El ensayo se basa en la formación del precipitado azul por formación del azul de Prusia
sobre el destilado.
Reactivos
Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% (preparación reciente).
Ácido clorhídrico concentrado pa.
Procedimiento
Colocar en un tubo de ensayo unos 2-4 mililitros del destilado y agregar IV gotas de
la solución de sulfato ferroso al 2%.
Calentar suavemente a ebullición hasta aparición del precipitado color castaño de
hidróxido férrico.
Enfriar y agregar c.s. de ácido clorhídrico concentrado.
En presencia de ión cianuro aparece color o precipitado azul. En ausencia de ión
cianuro aparece color amarillo débil (ión férrico).
Sensibilidad: 1:10000
Reacción de Aldridge
Fundamento
Por acción del bromo, el ión cianuro se transforma en bromuro de cianógeno, que
reacciona con la piridina para originar el bromuro de cianopiridina. La acción hidrolítica
determina la apertura del anillo pirídico, para dar lugar a la formación del aldehído
glutacónico.
Cuando este derivado se acopla con aminas primarias cíclicas (ej: bencidina) se
obtienen compuestos coloreados (bases de Schiff)
Reactivos
Ácido acético glacial p.a.
Solución saturada de agua bromo.
Solución acuosa de arsenito de sodio al 1,5%.
Reactivo pirídico: a 50 ml de agua destilada se agregan 5 ml de piridina y 2 ml de
ácido clorhídrico concentrado, completando a 100 ml con agua destilada.
Solución acética saturada de bencidina.
Procedimiento
Acidificar ligeramente 1 ml del destilado con ácido acético concentrado y agregar 0,5
ml de agua de bromo a saturación.
Incorporar a continuación 0,5 ml de solución de arsenito de sodio al 1.5% y luego
agregar 5 ml del reactivo pirídico, mezclar bien e incorporar por último 0,2 ml de la
solución acética de bencidina. Si existe ión cianuro aparece color naranja que pasa a
rojo.
Sensibilidad: hasta 3 microgramos de ión cianuro.
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos
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