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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Seminario y trabajo práctico Nº 1 
Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y 
cianuros alcalinos 
Editor: Prof. Dra. Edda C. Villaamil Lepori 
Autores: Prof. Bioq. Adriana Ridolfi; Bioq. Gloria Álvarez 
2014
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
1.1 MONÓXIDO DE CARBONO 
1.1.1 -Introducción 
El monóxido de carbono (CO) es un gas tóxico, inodoro, incoloro, no irritante, más 
liviano que el aire. 
Es la causa principal de muerte por intoxicación en los Estados Unidos y en Argentina 
ocurren alrededor de 3000 casos de intoxicaciones anuales siendo fatales entre 250 y 
300 casos. 
Fuentes de monóxido de carbono: 
Se produce por la oxidación incompleta durante la combustión de gas, carbón o de 
querosén, en hornallas, braceros, estufas de gas y en los calentadores portátiles sin 
respiraderos, lo puede generar emanaciones con concentraciones altas de monóxido de 
carbono en el medio ambiente interior. 
Se combina con la hemoglobina para formar carboxihemoglobina, que es incapaz de 
transportar oxígeno, por lo que se produce anoxia tisular. 
Las muestras que se utilizan en el análisis de CO pueden ser: 
a) Biológicas: sangre entera. Se emplea para control laboral o de una posible 
intoxicación (accidental o intencional) y también en el ámbito forense como posible 
causa de muerte. 
b) No biológicas: muestras de aire para controles en el ambiente de trabajo y para 
investigar la calidad del aire ambiental en las ciudades. 
1.1.2 - Métodos analíticos 
Existen variados métodos analíticos para la investigación cualitativa y cuantitativa del 
monóxido de carbono en sangre. Se pueden clasificar en métodos físicos y métodos 
químicos. 
Algunos métodos físicose basan en la mayor estabilidad de la carboxihemoglobina 
(COHb) respecto de los demás pigmentos hemáticos y otros investigan la presencia de 
CO gas. A su vez comprenden métodos no-instrumentales e instrumentales. Dentro de 
los primeros se encuentra el Ensayo de dilución y el Ensayo alcalino. 
Las técnicas instrumentales incluyen varias metodologías como las espectroscópicas, 
espectrofotométricas, gasométricas, calorimétricas, absorción al IR y cromatografía 
gaseosa. 
Los métodos químicos se basan en el poder reductor del CO. Esta característica 
permite emplear sales de Pd2+ o el I2O5. 
De todos los métodos que se disponen hoy en día para la determinación de monóxido 
de carbono, el método físico instrumental cooximétrico es el mayormente utilizado en 
los laboratorios toxicológicos, clínicos y forenses. Esto se debe a la facilidad de 
operación del instrumental, la poca muestra necesaria (sangre alrededor de 0,1 ml) y 
por la rapidez de la obtención de los resultados. 
Método de referencia para la determinación de CO en aire 
Se basa en la absorción de radiación infrarroja (RI) por el CO, en un fotómetro no 
dispersivo. La radiación IR producida pasa por 2 celdas iguales, una conteniendo un 
detector selectivo y la otra CO. El CO en la celda absorbe RI en sus frecuencias 
características y el detector es sensible a esas frecuencias. Con un gas diferente que 
no tenga CO en la celda de muestreo las señales están balanceadas electrónicamente. 
Si se introduce CO en la celda de muestreo absorberá RI la cual será detectada 
electrónicamente y produce una señal de salida.
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Existen en el mercado instrumentos manuales para medir CO en el aire como el que se 
muestra en la figura 1. 
Figura 1.- Instrumento de medición de 0 a 2000 ppm de CO 
1.1.2.1- Métodos Físicos 
a)- Métodos no instrumentales (Cualitativos) 
Ensayo de dilución (Haldane) 
El método consiste en la comparación a simple vista de la coloración de la muestra de 
sangre sospechosa diluída con otra normal en igual dilución. Una alícuota de sangre 
normal y otra de la muestra en estudio se diluyen con agua, generalmente al 1%, y se 
comparan los colores. La sangre normal tiene habitualmente un color rojo amarillento 
mientras que si la muestra desconocida tiene COHb, el color serácarminado rosado 
típico indicador de la presencia de COHb Es un método de baja sensibilidad 
detectándose diferencia de color cuando la saturación de la hemoglobina con CO es 
mayor del 30%. 
Ensayo alcalino 
Se basa en la mayor estabilidad de la COHb, dentro de ciertos límites, con respecto a 
la labilidad del pigmento hemático normal (Hb) en un medio alcalino. 
Una muestra de sangre normal y la muestra de sangre en estudio se diluyen con agua, 
se agrega a ambas muestras NaOH y se observa el color. 
La sangre normal adquiere color castaño por transformación de la Hb en hematina 
alcalina. La hematina es la globina desnaturalizada que tiene el Fe como Fe3+. 
La sangre con COHb mantiene por unos minutos su color carminado, porque la COHb 
es más resistente y más estable al tratamiento por álcalis. Luego de varios minutos 
también se transformará en hematina, por lo tanto es importante la observación 
inmediata. 
Este ensayo tiene como interferencia la sangre fetal o de recién nacido ya que la Hb 
fetal es resistente al tratamiento con álcalis y por lo tanto se comporta como laCOHb. 
La sensibilidad de este ensayo es superior a la del método anterior, ya que con un 
porcentajede saturación de la Hb con CO superior al 10%, se puede diferenciar de una 
normal. 
b)- Métodos instrumentales 
Métodos Espectrofotométricos 
Se basan en la determinación de la Absorbancia a longitudes de onda características 
dentro del espectro visible. Estas Absorbancias son generalmente máximas, mínimas o 
puntos isosbésticos. De esas diferencias de absorbancia a distintas longitudes de onda, 
se obtiene la concentración de COHb de la muestra. Existen distintas técnicas con gran 
cantidad de interferencias: se debe trabajar en condiciones estrictas de pH y
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
temperatura. Los picos de Absorbancia de la OHb y COHb son cercanos, la 
concentración de COHb debe ser elevada para que no interfiera la OHb. 
Sensibilidad: alrededor del 5% de saturación de COHb en la muestra de sangre. Hasta 
un 5% de saturación se puede detectar trabajando en condiciones preestablecidas. 
Cooximetría 
El Cooxímetro (figura 2) es un analizador semiautomático capaz de medir la 
concentración de Carboxihemoglobina (COHb) y otras hemoglobinas en muestras de 
sangre entera. Básicamente estos equipos son fotómetros para múltiples longitudes de 
onda. Realizan la lectura de la absorbancia a 4 o 5 longitudes de onda para una 
muestra de sangre hemolizada y mediante algoritmos programados calculan la 
proporción de cada componente de la hemoglobina total. Las fracciones analizadas 
son: desoxihemoglobina, oxihemoglobina, sulfohemoglobina, metahemoglobina y 
carboxihemoglobina. 
Emplean filtros de interferencia para seleccionar una línea dada del espectro de 
emisión de una lámpara de cátodo hueco de Tl-Ne. No requieren calibración habitual 
de la longitud de onda. 
Los cálculos son realizados por un microprocesador incorporado el cual a partir de las 
mediciones de la absorbancia y las constantes de absortividad de las distintas 
fracciones calcula su concentración y, cada fracción es sumada para obtener la 
concentración de hemoglobina total. 
La muestra utilizada es sangre entera anticoagulada con heparina. El volumen de 
sangre utilizado varía según los distintos modelos de cooxímetros, hay equipos en los 
cuales se inyectan muestras directamente de capilares heparinizados. La muestra se 
puede conservar hasta 24 horas a 4ºC. Pueden interferir en la determinación elevados 
niveles de bilirrubina y muestras lipémicas. 
Figura 2 - Cooxímetro 
Absorción al IR 
El CO tiene una absorción característica en el infrarrojo (IR). El CO se libera de la 
sangre por agregado de ferricianuro de potasio. El gas liberado absorbe al IR estando 
los picos entre 2120 – 2170 cm–1
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Cromatografía gaseosa 
Es el método de elección cuando hay otros gases interferentes. Tiene gran sensibilidad 
y puede detectar hasta 0,5% de saturación de CO en sangre. 
1.1.2.2- Métodos Químicos 
Microdifusión 
Fundamento de la microdifusión 
La cámara de Conway (Figura 3) consiste en un receptáculo con dos compartimientos 
concéntricos, generalmente de porcelana, y una tapa de vidrio esmerilada. 
Se utiliza para la separación de compuestos volátiles o gaseosos, fijándolos en una 
solución apropiada para luego cuantificarlos. 
La tapa de vidrio permite un cierre hermético, cuando se le aplica el sellador en sus 
bordes (vaselina sólida, etc.) 
Figura 3. Cámara de Conway 
En el compartimiento externo se coloca el material, el cual contiene el tóxico volátil o 
gaseoso y en el compartimiento interior una solución fijadora del tóxico apropiada para 
cada caso. El principio en el cual se basa el aislamiento de los compuestos volátiles o 
gaseosos es el siguiente: 
Cuando una solución de un gas o compuesto volátil A, al colocarla en un recipiente 
hermético se establece el siguiente equilibrio: 
Recién colocada la solución en el recipiente, el equilibrio se desplaza hacia la derecha, 
o sea: 
Luego de cierto tiempo se llega al punto de equilibrio y se tiene: 
Si se repite la experiencia, pero se coloca la solución del compuesto A en el 
compartimiento externo de la cámara de Conway y en el compartimiento interno una
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
sustancia o solución fijadora del compuesto A, lo que ocurre es un nuevo 
desplazamiento hacia la derecha 
Esto ocurre hasta que se agote el compuesto A en la solución inicial. Para ayudar y 
mejorar la liberación se agrega a la muestra a investigar un reactivo liberador, por 
ejemplo ácido sulfúrico diluído en el caso de CN-: 
El tiempo de difusión dependerá de la temperatura y de cada tipo de sustancia. A 
mayor temperatura menor tiempo de difusión. No se aconseja elevar la temperatura 
(colocando en estufa por ejemplo), ya que aumentan las probabilidades de pérdida del 
compuesto volátil o gaseoso. Para cada tipo de microdifusión está estandarizado el 
tiempo de difusión a temperatura ambiente. 
Los mecanismos por los cuales se fijan los compuestos a los reactivos fijadores pueden 
ser varios. Para el caso del CO ocurre una reacción redox. En otros casos es por 
solubilidad y en otros por reacción ácido-base. 
Determinación cuantitativa de monóxido de carbono por microdifusión 
Se coloca en el compartimiento interno el reactivo fijador Cl2Pd 0,01N. Luego se coloca 
la sangre en el compartimiento externo, se tapa la cámara y se desplaza el vidrio 
dejando un pequeño espacio de la cámara externa abierto, del lado opuesto al que se 
agregó la sangre y por él se agrega el reactivo liberador (SO4H2 10%). Se cierra la 
cámara y se mezclan (liberador y muestra) por rotación. Se deja difundir una hora a 
temperatura ambiente. 
Entre el Pd2+ y el CO, se produce la siguiente reacción redox: 
Como consecuencia aparece en la cámara interna una pátina de color metálico (Pd°) 
Si se pretende efectuar la determinación cuantitativa, hay que proceder a centrifugar 
el contenido del compartimiento interno para eliminar el Pd°. Se toma 
cuantitativamente 0,1 ml del sobrenadante y se transfiere a un matraz aforado. Se 
toma igual volumen de la solución de Cl2Pd original y se coloca en otro matraz aforado 
(blanco de reacción). A ambos se agrega goma arábiga (para evitar la precipitación del 
I2Pd) y solución de IK. Se lee la absorbancia del complejo coloreado formadoa 500 nm: 
Cálculos 
La solución fijadora de cloruro de paladio es 0,01N (0,222 g de cloruro de paladio en 
250 ml de vehículo), que corresponde por lo tanto a 0,888 gramos por litro. 
donde 177,61 gramos, es el peso molecular de cloruro de paladio, el cual contiene 
106,7 gramos de paladio metálico. Esto equivale a 0,5335 mg por ml de la solución 
reactivo 0,01N. De acuerdo a la ecuación redox antes señalada, cada mol de paladio es
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
reducido por un mol de monóxido de carbono, es decir que 177,61 mg de cloruro de 
paladio son reducidos por 28 mg de monóxido de carbono. 
Por lo tanto: 
Por lo tanto, 0,26 es el factor de transformación para expresar mg de paladio enmg de 
monóxido de carbono. 
Una vez determinada la densidad óptica del complejo [I4Pd]2-, los mg de paladio 
reducido se calculan de la manera que sigue: 
Db= Absorbancia del blanco y Dd = Absorbancia del desconocido o muestra 
y 
donde 0,05335 corresponde a los mg de Pd en 0,1 ml de la solución de cloruro de 
paladio. 
Para expresar ese resultado en mg por ciento de monóxido de carbono, se debe 
multiplicar por 520, factor que proviene de multiplicar 2 x 10 (para referir al volumen 
inicial de sangre y de acuerdo con la dilución), por 100 para referir a 100 ml de 
sangre y por 0,26 (factor de transformación), resultando que: 2 x 10 x 100 x 0,26 = 
520 
Por lo tanto: 
ó 
Los mg de CO pueden expresarse en ml de CO, por medio de un factor que es igual a 
0,8 ya que 1 mol de gas equivale a 22,4 l en las condiciones normales de presión y 
temperatura. 
Por lo tanto:
8 
Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
El valor se lo suele referir a la cantidad de Hb de la sangre problema (por ejemplo “a” 
g), expresando el CO hallado como porcentaje de saturación de la Hb total, sabiendo 
que: 
1.1.3- Interpretación del resultado 
Comúnmente, los valores registrados en casos de intoxicaciones fatales son superiores 
al 50% de saturación de la hemoglobina total. 
Valores fisiológicos 
No fumadores Menor a 0,6% Hb total 
Fumadores 3,0-8,0% Hb total 
BEI (Índice Biológico de Exposición) menor a 3,5% Hb total 
Efectos en la salud humana por exposición a monóxido de carbono 
Concentración de HbCO 
en sangre (%) 
Efecto observado 
2,3-4,3 Disminución en la capacidad de realizar un ejercicio máximo en 
un corto tiempo en individuos jóvenes saludables 
2,9-4,5 Disminución en la duración de ejercicio, debido a dolor en el 
pecho (angina), en pacientes con enfermedades al corazón. 
Disminución del consumo máximo de oxígeno y tiempo para 
realizar ejercicio, en individuos jóvenes saludables durante 
ejercicio fuerte. 
5-5,5 Disminución en la percepción visual y auditiva. Pérdida de la 
capacidad sensorial, motora y de vigilancia. 
5,0-17,0 Disminución en el consumo máximo de oxígeno durante el 
ejercicio fuerte, en individuos jóvenes saludables. 
7,0-20,0 Dolor de cabeza, decaimiento. 
20,0-30,0 Mareo, náusea, debilidad 
30,0 Confusión, colapso durante el ejercicio 
40,0 Pérdida de conciencia y muerte si la exposición continúa 
50,0 Muerte 
Fuente: OMS: http://www.bvsde.paho.org/cursoa_orientacion/lecc4/lecc4_co.html
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
1.2- ACIDO CIANHÍDRICO Y CIANUROS ALCALINOS 
1.2.1- Introducción 
La intoxicación aguda por compuestos derivados del HCN puede deberse a ingestión de 
cianuros alcalinos (de sodio o potasio, los más comunes), o a inhalación del HCN 
gaseoso. La intoxicación por ingestión de glucósidos cianogenéticos como los 
contenidos en los frutos del albaricoque, almendras amargas, etc.,es poco frecuente 
pero puede ocurrir especialmente en niños. 
La intoxicacióncrónica puede deberse a la exposiciónal HCNde los trabajadores de 
ciertas industrias como galvanoplastia, limpieza de metales, síntesis química, 
investigación, etc. 
1.2.2-Investigación del Ácido cianhídrico y los Cianuros alcalinos 
Existen tres clases de determinaciones: los ensayos inmediatos, los ensayos mediatos 
y los procedimientos cuantitativos 
Ensayos inmediatos 
Son procedimientos cualitativos, que se realizan en la atmósfera del recipiente que 
contiene el material a analizar. Los materiales donde se determinan CNH y Cianuro 
pueden ser: vísceras (cadáver); sangre y orina si el individuo no ha muerto; alimentos 
(muchos vegetales que contienen glucósidos cianogenéticos y que al ser ingeridos, por 
acción de enzimas que se encuentran tanto en el hombre como en animales, liberan 
CNH); alimentos con agregado intencional de cianuro; etc. En tejidos y alimentos los 
cianuros están fijos como cianuros alcalinos. 
El recipiente que contiene la muestra debe estar cerrado herméticamente para evitar 
pérdidas y la exposición del personal que está en contacto con el recipiente. 
En la atmósfera del recipiente se libera CNH, ello se puede deber a dos tipos de 
procesos: 
 Proceso hidrolítico: 
El equilibrio se desplaza hacia la derecha a medida que se desprende el gas HCN. 
 Si se trata de vísceras, por efecto putrefactivo se libera CNH de acuerdo con: 
Estos métodos permiten identificar CNH en forma rápida, en base a la utilización de los 
llamados “papeles sensibles”. Consisten en utilizar tiras de papel de filtro 
impregnadas con ciertos reactivos que se introducen en la atmósfera del recipiente 
Se describen tres ensayos mediante papeles sensibles: 
Ensayo de Guayaco-cúprico o de Schömbein 
Se toma una tira de papel de filtro y en uno de los extremos se agrega una gota de 
SO4Cu 0.5%, inmediatamente sobre la gota anterior se agrega una gota de resina de 
Guayaco y se coloca la tira en el recipiente en el cual se quiere investigar la presencia 
de HCN sin que tome contacto con el material que lo contiene. 
Se considera un resultado positivo cuando aparece un color azul intenso, negativo por 
aparición de color castaño (color de la resina de Guayaco) y dudoso por observación 
después de varios minutos de un color verde o azul débil.
10 
Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Cuando se sospeche que hay poca cantidad de CN- en la muestra en estudio, deberá 
agregarse ácido tartárico, porque es más fuerte que el HCN y lo desplaza de sus 
combinaciones. Calentando a 60°C durante 30 minutos se desplazan los CN- fijos a 
HCN. Se repiten las determinaciones con nuevos papeles; si se obtiene color azul 
intenso, el ensayo es positivo; si da dudoso nuevamente se descarta la presencia del 
ión CN-. 
Valor analítico del ensayo 
Cuando es negativo, permite descartar la presencia de CN- ya que es muy sensible 
pero muy poco específico. 
La poca especificidad se debe a: 
 Presencia de oxidantes directos de la resina de Guayaco, por ejemplo, ClO-, ClO3 
-, 
nitratos y nitritos, dan falsos positivos. 
 Presencia de reductores: estos reducen las sales de Cu2+ y actúan de la misma forma 
que el cianuro, dan falsos positivos. 
Para descartar la presencia de oxidantes directos, en el mismo procedimiento, se usa 
una tira de papel sólo con resina de Guayaco (sin SO4Cu); si la reacción da positiva al 
introducirla en el recipiente (azul), existen oxidantes directos. 
Si no da color azul (o sea es negativo, se agrega SO4Cu a la misma tira. Si ahora se 
observa un color azul, se puede pensar que hay cianuros presentes. 
Si el resultado fuera negativo se descarta la presencia de cianuros. 
Entonces si el ensayo resultara negativo se descarta la presencia de cianuros en el 
material, y si fuera positivo se aplican otros métodos más específicos. 
Fundamento 
Las sales de Cu al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas aumentan su 
potencial de oxidación. Esto se puede aprovechar si colocamos una sustancia que al 
oxidarse cambie de color, como la resina de Guayaco o ácido guayacónico, que es de 
color castaño y vira al azul. 
Primero se forma una sal inestable (CN)2Cu, que pasa a CNH y CNOH, este último 
responsable de la oxidación del ácido guayacónico que da azul de guayaco, lo que 
permite visualizar la reacción del CNH sobre el Cu2+. 
Sensibilidad 
Según algunos autores: 1:3 x 106. Según otros autores: hasta 0,25 microgramos de 
ácido cianhídrico
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Ensayo de o-tolidina 
Fundamento 
Tiene igual fundamento que la reacción anterior pero la visualizaciónse hace con o-tolidina; 
también se pueden usar: bencidina, fenolftaleína o cualquier sustancia que al 
oxidarse forme un complejo coloreado. 
Complejo que se forma con la o-tolidina al oxidarse dos moléculas de este reactivo es 
el que se indica en la figura 2-1. 
Figura 1.2.1- Complejo coloreado de la o-tolidina oxidada 
Valor analítico del ensayo:esta reacción es altamente sensible pero inespecífica. 
Si los ensayos Guayaco-cúprico y de o-tolidina dan positivos se realiza un tercer 
ensayo, más específico. 
Ensayo de Magnin 
Este ensayo es poco sensible pero muy específico. Se basa en la formación de Azul de 
Prusia. Para ello se impregna la tira de papel en NaOH, se pone en contacto con la 
atmósfera del recipiente y se deja actuar unos minutos. El NaOH fija el CNH como CN-de 
acuerdo a la siguiente ecuación: 
Luego se agrega a la tira SO4Fe. Se observa la formación de un precipitado verdoso 
que luego pasa a castaño. Finalmente por agregado de unas gotas de ClH da color azul 
por formación del Azul de Prusia de acuerdo a las siguientes ecuaciones: 
El Fe(OH)2 es inestable, y se oxida por acción del O2 del aire precipitando como 
Fe(OH)3 de color castaño, por lo tanto: 
y por agregado del HCl:
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Siempre se efectúan por lo menos dos reacciones: una muy sensible (resina de 
guayaco u o-tolidina) y otra muy específica (Magnin). Si las dos reacciones dan 
positivas se procede al aislamiento. 
Ensayos Mediatos 
Si los ensayos inmediatos dieran positivos, se procede posteriormente a efectuar los 
Ensayos Mediatos. Para ello primero se procede al aislamiento y luego a la 
identificación del ión CN-. Este ión puede investigarse mediante la Formación de Azul 
de Prusia (directo y modificado); por transformación en sulfocianuro (SCN-) o por la 
Reacción de Aldridge. 
Aislamiento 
Se hace por destilación simple (figura 2.2). Se agrega ácido tartárico al material, se 
destila y se recoge el HCN en NaOH para fijarlo. 
Figura 1.2.2– Destilación simple 
Si el material es visceral no debe conservarse en formol porque reacciona con el HCN 
formando cianhidrinas de las que no se puede liberar HCN, por lo tanto no se podría 
identificar. 
En el caso de vísceras en estado de putrefacción agregar al material a destilar acetato 
básico de plomo para retener el SH2. 
Reacciones de identificación sobre el destilado 
Reacción del azul de Prusia directa 
Se usan los mismos reactivos y tiene el mismo fundamento que la reacción en papel. 
Se toma una porción del destilado (donde el CN- ya está fijo) y se agrega SO4Fe, se
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
deja unos minutos al aire (toma color castaño) y finalmente se añade ClH dando un 
precipitado de color azul. 
Es una reacción de muy baja sensibilidad (1:10000) 
Reacción del azul de Prusia modificada o método de Chelle-Klassen 
La modificación consiste en ajustar previamente el pH a 8,0, medio en el cual va a 
precipitar luego el azul de Prusia. El ajuste se hace usando fenolftaleína como indicador 
(en medio básico, rosada), se agrega solución diluido de SO4H2 que la hace virar a 
incolora y luego por agregado de borato o carbonato de sodio se lleva a pH alcalino 
aproximadamente igual a 8. Luego se lleva a cabo la reacción del azul de Prusia. 
Mediante esta modificación aumenta la sensibilidad hasta 10 microgramos de ión 
cianuro. 
Si se tienen cantidades muy pequeñas se puede aumentar aún más su sensibilidad. En 
estos casos el azul de Prusia no precipita sino que queda como coloide suspendido. 
Se agrega entonces Cl2Ba, se forma SO4Ba que arrastra al azul de Prusia, 
concentrándose en el fondo del tubo de ensayo, en forma de un “botón” azul o blanco 
azulado. 
Sensibilidad: hasta 5 microgramos de ión cianuro. 
Reacción de Aldridge 
Es una reacción cualitativa, que se recomienda también para determinaciones 
cuantitativas (con el mismo fundamento se la utiliza en microdifusión). 
Esta determinación puede realizarse sobre el destilado, y en muestras de sangre y 
orina. Cuando no se usa el destilado la muestra debe desproteinizarse previamente 
(generalmente con tricloroacético). 
El destilado o el desproteinizado se acidifican con AcH y posteriormente se agrega 
agua de Br2 saturada. El CN- reacciona con el Br2: 
Generalmente queda un exceso de Br2 (amarillo) que debe ser eliminado por el 
agregado de arsenito de sodio decolorándose la solución. Luego se agrega un reactivo 
a base de Piridina en medio ácido: Reactivo Pirídico (Piridina diluida y acidificada). 
Este compuesto es inestable, se descompone por un proceso hidrolítico y se rompe el 
anillo. Queda el aldehído glutacónico (alcohol en un extremo y aldehído en el otro). 
Si se le agrega una amina primaria cíclica, bencidina por ejemplo, se forma una base 
de Schiff en los extremos y se obtiene un compuesto coloreado:
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Sensibilidad: hasta 3 microgramos de ión cianuro. 
1.2.3-Métodos Cuantitativos 
Existen macro y microtécnicas. Son ejemplo de macrotécnicas las técnicas 
volumétricas; y de microtécnicas la microdifusión en Cámara de Conway. 
Se utilizan microtécnicas para la determinación del ión cianuro por los siguientes 
métodos de microdifusión: Tompsett y Feldstein y Klendshoj. Existen otras variantes 
dentro de estos procedimientos. 
Microdifusión: Reacción de Tompsett 
Se utiliza la cámara de Conway (fig. 2.3) la cual se sella con un vidrio esmerilado, 
lubricado previamente con vaselina o sellador, para evitar pérdidas. 
Figura 1.2.3- Esquema de la cámara de Conway 
Se usan los mismos reactivos y tiene el mismo fundamento que la reacción de 
Aldridge. 
Las muestras que se usan son homogenatos de vísceras, sangre u orina. 
El reactivo liberador (compartimiento externo) es el ácido sulfúrico. Su concentración 
depende del tipo de microdifusión usada. El reactivo liberadordebe ser un ácido más 
fuerte que el HCN para desplazarlo de las uniones. 
El reactivo fijador (compartimiento interno) es NaOH. 
Tiempo de difusión: 3 – 4 hs. a temperatura ambiente. 
Una vez fijado el CN- se procede a su cuantificación. 
Se coloca el contenido de la cámara interna en un tubo de ensayo, se acidifica con 
ácido acético, luego se adiciona agua de Br2, arsenito para eliminar el exceso de Br2 y 
finalmente el reactivo piridina-bencidina. 
Se lee la absorbancia del compuesto coloreado (rosa-rojo) a 520 nm, se interpola en la 
curva de calibración construída previamente con distintos estándares de CN- y se 
obtiene la cantidad de cianuro presente en la muestra. 
Microdifusión: Reacción de Feldstein y Klendshoj 
El reactivo liberador es ácido sulfúrico. El reactivo fijador es NaOH. 
Tiempo de difusión: 3 – 4hs. a temperatura ambiente
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Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Para su cuantificación se utiliza la reacción de Aldridge pero difieren los reactivos. 
Los reactivos que se utilizan son fosfato monosódicopara regular el pH, cloramina T en 
lugar de Br2 acuoso, finalmente se agrega piridina – ácido barbitúrico. 
Por reacción con la Cloramina T se forma el cloruro de cianopiridina que se 
descompone y reacciona con el ácido barbitúrico. Se lee la absorbancia del compuesto 
formado a 580 nm (color lila-violeta). 
Valores normales de CN- en un individuo adulto 
Hasta 15 μg% el CN- aparece como producto del catabolismo normal en pequeñas 
cantidades. 
En la intoxicación por inhalación de ácido cianhídrico. Valores mayores de 100 μg% 
suelen ser fatales, pero esto varía de un individuo a otro. 
En la intoxicación por ingestión de cianuros los valores suelen ser mayores aún 1-2 
mg%. 
La ingestión de 200 mg de CNNa puede provocar la muerte de un individuo adulto. 
En muestras de sangre cadavérica el CN- desaparece rápidamente por acción 
enzimática y bacteriana. Debe conservarse la muestra con FNa al 1% para evitar 
dichas acciones.
16 
Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
1.3- TRABAJO PRÁCTICO Nº 1: MONÓXIDO DE CARBONO Y 
ÁCIDO CIANHÍDRICO Y CIANUROS ALCALINOS 
1.3.1-TRABAJO PRÁCTICO: MONÓXIDO DE CARBONO 
Desarrollo del trabajo práctico- Actividades a realizar 
 Los alumnos serán divididos en grupos de trabajo. 
 A cada grupo se le asignarán distintas muestras que deberán analizar. 
 Al finalizar el TP, cada grupo deberá presentar un informe con los resultados 
analíticos y una discusión en base a los datos obtenidos. 
1.3.1.1- Determinación Cuantitativa de Monóxido de Carbono 
Método de Feldstein-Klendshoj (en sangre por Microdifusión) 
Medidas de seguridad 
Cada reactivo debe ser considerado como un peligro potencial a la salud y la 
exposición a estos compuestos debe ser minimizada con buenas prácticas de 
laboratorio. 
Fundamento 
Se basa en el poder reductor del monóxido de carbono, que actuando sobre una 
solución de Cl2Pd, lo transforma en Pd°. La sal de paladio origina, con el ion ioduro, un 
complejo coloreado de máxima absorción a 500 nm. Conociendo la absorbancia del 
complejo formado a partir de la solución blanco de Cl2Pd y la que reaccionó con el CO 
se establece la concentración de COHb presente en la muestra. 
Muestra 
Sangre entera (un volumen mínimo de 5 ml) obtenida por punción venosa con 
heparina como anticoagulante. Una vez extraída la muestra rotular el recipiente que la 
contiene. Si se trasvasa la sangre a un tubo, éste deberá estar limpio, seco y cerrarse 
herméticamente. 
Conservación de la muestra. Cuando no se realice el análisis en forma inmediata se 
puede conservar durante 3 días entre 2 y 8ºC. 
Reactivos 
 Solución de cloruro de paladio 0,01N: Disolver 0,222 g de cloruro de paladio en c.s. 
de ácido clorhídrico 0,01N, calentando si fuera necesario. Completar a 250 con dicha 
solución. 
 Ácido sulfúrico 10% (v/v) 
 Goma arábiga al 0,1% (p/v) 
 Solución de ioduro de potasio al 15% (p/v) 
Materiales 
 Cámara de Conway 
 Matraces aforados de 10,0 ml 
El habitual de laboratorio que se incluirá en el procedimiento. 
El tratamiento del material de vidrio será mediante lavado con detergente y enjuagado 
con agua de grifo, 3 veces. Luego enjuagado con agua destilada, 3 veces y secado en 
estufa. 
Tratamiento del material de trabajo 
Lavado con detergente y enjuagado con agua de grifo, 3 veces 
Enjuagado con agua destilada, 3 veces 
Secado en estufa 
Instrumental 
Espectrofotómetro UV-visible.
17 
Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Procedimiento 
 En una unidad de Conway, colocar en el compartimiento interno, 2,0 ml de la 
solución de cloruro de paladio 0,01N y en el compartimiento externo, 1 ml de sangre y 
1 ml de ácido sulfúrico al 10%, en la parte opuesta a la que se colocó la sangre. 
 Cubrir la cámara con la respectiva tapa de cierre ya preparada con la vaselina 
siliconada a fin de asegurar un cierre hermético y mezclar la sangre con el ácido 
sulfúrico mediante un suave movimiento de rotación. 
 Dejar difundir 1 hora a temperatura ambiente. Si no hay cambio en el aspecto de la 
solución reactiva, el ensayo puede considerarse negativo. De existir monóxido de 
carbono aparece, en la superficie de la solución de Pd+2, una pátina plateada debido a 
la formación de paladio metálico. 
Determinación espectrofotométrica 
 Con una pipeta capilar extraer la totalidad de la solución del compartimiento interno 
de la cámara de Conway, compuesta por paladio metálico y exceso de la solución de 
Pd+2, y colocar en un tubo de centrífuga. 
 Centrifugar a 3000 rpm, para separar el precipitado de Pdo. 
 Trasvasar 0,1 ml del sobrenadante a un matraz aforado de 10,0 ml. (ver esquema de 
trabajo) 
 En otro matraz de 10,0 ml colocar 0,1 ml de la solución de paladio 0,01N el que se 
utilizará como blanco. 
 A cada matraz agregar 1 ml de solución de goma arábiga al 0,1% y 1 ml de IK al 
15%. 
 Mezclar bien y llevar a volumen con agua destilada. 
 Determinar la densidad óptica a 500 nm llevando a 0 con agua destilada en el 
espectrofotómetro. 
Esquema de trabajo para la determinación espectrofotométrica de la COHb 
En matraz aforado de 10 ml Muestra Blanco 
Sobrenadante 0,1 ml - 
Solución de Paladio - 0,1 ml 
goma arábiga al 0,1% 1 ml 1 ml 
IK al 15% 1 ml 1 ml 
Agua destilada Llevar a 10 ml 
Mezclar 
Leer absorbancia a 500 nm 
El exceso de la sal de paladio, Pd2+, origina con el ión ioduro, un complejo coloreado de 
máxima absorción a 500 nm. 
Cálculos 
La concentración de CO expresada en mg% se calcula de acuerdo a la ecuación: 
Ejemplo: 
En una determinación practicada en una muestra de sangre de un sujeto fallecido por 
inhalación de monóxido de carbono se hallaron los siguientes valores para las lecturas 
de absorbancia:
18 
Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
por lo cual 
Luego, 
Para expresar el resultado en por ciento de saturación (porcentaje de saturación de la 
hemoglobina), es necesario conocer el tenor en hemoglobina. En el caso citado, la 
muestra acusó un tenor de 13 gramos por ciento de hemoglobina, entonces: 
Como 1 g de hemoglobina fija 1,34 ml de monóxido de carbono, 13 gramos fijarán: 
13x1,34 = 17,42 ml. 
Luego, 
1.3.2- TRABAJO PRÁCTICO: CIANUROS 
1.3.2.1- Ensayos inmediatos 
Muestra 
Cualquiera fuere su naturaleza (vísceras, líquidos biológicos, alimentos) deben 
acondicionarse en recipientes bien limpios y secos, sin agregado de sustancia 
alguna como conservador. El único medio de conservación aplicable es el frío. 
La identificación inmediata del ácido cianhídrico de cianuros alcalinos se efectúa en 
forma directa en la atmósfera del recipiente que contiene el material a analizar. La 
liberación del ácido cianhídrico se debe a un proceso hidrolítico que prosigue en 
variada magnitud según las condiciones del medio. 
Ensayo con o-Tolidina 
Fundamento del método 
Se basa en la misma interpretación dada para el ensayo guayaco-cúprico. El color azul 
es imputable a un derivado de estructura meriquinoide, similar al que produce la 
bencidina.
19 
Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Reactivos 
 Solución acuosa de sulfato de cobre al 0,5%. 
 Solución alcohólica de o-Tolidina al 1%. 
Materiales 
 Papel de filtro de 2 x 15 cm. 
 Cápsula de porcelana. 
 Varilla de vidrio. 
Procedimiento 
 Humectar una tercera parte del papel de filtro con la solución de sulfato de cobre 
0,5% y luego, mediante una varilla de vidrio, extender sobre la superficie humectada I 
gota de solución alcohólica de o-tolidina al 1%. 
 Colocar el papel en el interior del recipiente que contiene el material a analizar. 
 En presencia de ácido cianhídrico se observa en forma inmediata color azul verdoso 
que rápidamente vira al azul neto. 
 La aparición de color azul tenue por exposición prolongada no tiene significación 
analítica. 
Interferencias 
 Oxidantes directos de la o-tolidina 
 Reductores que actúen de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre. 
Valor analítico del ensayo 
Tiene valor cuando es negativo ya que es una reacción inespecífica. Cuando es positivo 
requiere confirmación por ensayos específicos. 
Sensibilidad: es una reacción altamente sensible. 
Ensayo de Magnin 
Fundamento del método 
Se basa en la obtención del denominado azul de Prusia 
Reactivos 
 Solución acuosa de hidróxido de sodio al 2% 
 Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% (preparación reciente) 
 Ácido clorhídrico concentrado pa 
Materiales 
 Papel de filtro de 2 x 15 cm 
 Cápsula de porcelana 
Procedimiento 
 Impregnar el papel de filtro con I-II gotas de la solución de hidróxido de sodio al 2% 
y exponer en el interior del recipiente durante algunos minutos. 
 Retirar y extender sobre una cápsula de porcelana. 
 Distribuir sobre la superficie expuesta IV gotas de solución de sulfato ferroso 2%: 
aparece un precipitado verde (hidróxido de Fe+2), que se oscurece paulatinamente 
(hidróxido de Fe+3) 
 Dejar al aire unos minutos para favorecer la oxidación del ión ferroso. 
 Acidificar con unas gotas de ácido clorhídrico concentrado: en presencia de ión 
cianuro aparece precipitado azul de Prusia. 
Valor analítico 
El ensayo de Magnin constituye un recurso analítico categórico para demostrar la 
existencia de ácido cianhídrico dada su especificidad. 
Sensibilidad: es un ensayo menos sensible que los descriptos anteriormente. 
1.3.2.2-Ensayos Mediatos 
Se trata del aislamiento e identificación del ácido cianhídrico a partir de los cianuros 
alcalinos.
20 
Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
El aislamiento se realiza por destilación simple en medio ácido (se acidifica el material 
conácido tartárico al 10%), recogiendo el destilado en solución acuosa de hidróxido de 
sodio al 10%. Los ensayos mediatos se efectúan sobre el destilado. 
Ensayo de Azul de Prusia directo 
Fundamento 
El ensayo se basa en la formación del precipitado azul por formación del azul de Prusia 
sobre el destilado. 
Reactivos 
 Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% (preparación reciente). 
 Ácido clorhídrico concentrado pa. 
Procedimiento 
 Colocar en un tubo de ensayo unos 2-4 mililitros del destilado y agregar IV gotas de 
la solución de sulfato ferroso al 2%. 
 Calentar suavemente a ebullición hasta aparición del precipitado color castaño de 
hidróxido férrico. 
 Enfriar y agregar c.s. de ácido clorhídrico concentrado. 
 En presencia de ión cianuro aparece color o precipitado azul. En ausencia de ión 
cianuro aparece color amarillo débil (ión férrico). 
Sensibilidad: 1:10000 
Reacción de Aldridge 
Fundamento 
Por acción del bromo, el ión cianuro se transforma en bromuro de cianógeno, que 
reacciona con la piridina para originar el bromuro de cianopiridina. La acción hidrolítica 
determina la apertura del anillo pirídico, para dar lugar a la formación del aldehído 
glutacónico. 
Cuando este derivado se acopla con aminas primarias cíclicas (ej: bencidina) se 
obtienen compuestos coloreados (bases de Schiff) 
Reactivos 
 Ácido acético glacial p.a. 
 Solución saturada de agua bromo. 
 Solución acuosa de arsenito de sodio al 1,5%. 
 Reactivo pirídico: a 50 ml de agua destilada se agregan 5 ml de piridina y 2 ml de 
ácido clorhídrico concentrado, completando a 100 ml con agua destilada. 
 Solución acética saturada de bencidina. 
Procedimiento 
 Acidificar ligeramente 1 ml del destilado con ácido acético concentrado y agregar 0,5 
ml de agua de bromo a saturación. 
 Incorporar a continuación 0,5 ml de solución de arsenito de sodio al 1.5% y luego 
agregar 5 ml del reactivo pirídico, mezclar bien e incorporar por último 0,2 ml de la 
solución acética de bencidina. Si existe ión cianuro aparece color naranja que pasa a 
rojo. 
Sensibilidad: hasta 3 microgramos de ión cianuro.
21 
Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 
Bibliografía: 
 Albiano, N.F. (2011) Gases asfixiantes químicos (sección 4- Cap. 13) en 
Toxicología Laboral, Ed. Superintendencia de Riesgos del Trabajo, Buenos Aires. 
 Conway, E.J. (1962)Microdiffusion analysis and volumetric error. (5th ed.), 
Crosby Lockwood and Sons, London, UK. 
 Fabre y Truhaut, R. (1977) Toxicología. Paraninfo – Madrid. 
 Frejaville, J. P.; Buordon, R. (1979) Toxicología Clínica y Analítica. Editorial 
Jims. Barcelona. 
 Guatelli, M. (1971)Intoxicación oxicarbonada. Estudio bioquímico y metodología 
analítica. EUDEBA. Buenos Aires. 
 Guatelli, M. (2005) Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos: Guía de Trabajos 
Prácticos – Cátedra de Toxicología y Química Legal – Facultad de Farmacia y 
Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. 104 pp. 
 Fiorenza Biancucci, G.; González, D.; Pérez, A.; Ridolfi, A.; Strobl, A (2008) 
Manual de procedimientos analíticos Toxicológicos para laboratorios de baja 
complejidad.Eds: Asociación Toxicológica Argentina (ATA),OPS/OMS.Ciudad de 
Buenos Aires.186 pp. 
 Lauwerys, R.; Hoet, P. (1993) Industrial Chemical Exposure. (2nd ed.) Lewis 
Publishers. Florida, USA, 318 pp. 
 Leikin,J.B.; Paloucek,F.P.(1998) Poisoning and Toxicology Compendium,Lexi- 
Comp Inc. Hudson, Ohio, 1465 pp. 
 Roses, O.E. (1979) Monóxido de carbono. En El laboratorio en la clínica.Ed: 
Iovine-Selva, Cap. 17. Editorial Panamericana, Buenos Aires.

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Seminario y trabajo práctico nº 1 2014

  • 1. 1 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Seminario y trabajo práctico Nº 1 Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Editor: Prof. Dra. Edda C. Villaamil Lepori Autores: Prof. Bioq. Adriana Ridolfi; Bioq. Gloria Álvarez 2014
  • 2. 2 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 1.1 MONÓXIDO DE CARBONO 1.1.1 -Introducción El monóxido de carbono (CO) es un gas tóxico, inodoro, incoloro, no irritante, más liviano que el aire. Es la causa principal de muerte por intoxicación en los Estados Unidos y en Argentina ocurren alrededor de 3000 casos de intoxicaciones anuales siendo fatales entre 250 y 300 casos. Fuentes de monóxido de carbono: Se produce por la oxidación incompleta durante la combustión de gas, carbón o de querosén, en hornallas, braceros, estufas de gas y en los calentadores portátiles sin respiraderos, lo puede generar emanaciones con concentraciones altas de monóxido de carbono en el medio ambiente interior. Se combina con la hemoglobina para formar carboxihemoglobina, que es incapaz de transportar oxígeno, por lo que se produce anoxia tisular. Las muestras que se utilizan en el análisis de CO pueden ser: a) Biológicas: sangre entera. Se emplea para control laboral o de una posible intoxicación (accidental o intencional) y también en el ámbito forense como posible causa de muerte. b) No biológicas: muestras de aire para controles en el ambiente de trabajo y para investigar la calidad del aire ambiental en las ciudades. 1.1.2 - Métodos analíticos Existen variados métodos analíticos para la investigación cualitativa y cuantitativa del monóxido de carbono en sangre. Se pueden clasificar en métodos físicos y métodos químicos. Algunos métodos físicose basan en la mayor estabilidad de la carboxihemoglobina (COHb) respecto de los demás pigmentos hemáticos y otros investigan la presencia de CO gas. A su vez comprenden métodos no-instrumentales e instrumentales. Dentro de los primeros se encuentra el Ensayo de dilución y el Ensayo alcalino. Las técnicas instrumentales incluyen varias metodologías como las espectroscópicas, espectrofotométricas, gasométricas, calorimétricas, absorción al IR y cromatografía gaseosa. Los métodos químicos se basan en el poder reductor del CO. Esta característica permite emplear sales de Pd2+ o el I2O5. De todos los métodos que se disponen hoy en día para la determinación de monóxido de carbono, el método físico instrumental cooximétrico es el mayormente utilizado en los laboratorios toxicológicos, clínicos y forenses. Esto se debe a la facilidad de operación del instrumental, la poca muestra necesaria (sangre alrededor de 0,1 ml) y por la rapidez de la obtención de los resultados. Método de referencia para la determinación de CO en aire Se basa en la absorción de radiación infrarroja (RI) por el CO, en un fotómetro no dispersivo. La radiación IR producida pasa por 2 celdas iguales, una conteniendo un detector selectivo y la otra CO. El CO en la celda absorbe RI en sus frecuencias características y el detector es sensible a esas frecuencias. Con un gas diferente que no tenga CO en la celda de muestreo las señales están balanceadas electrónicamente. Si se introduce CO en la celda de muestreo absorberá RI la cual será detectada electrónicamente y produce una señal de salida.
  • 3. 3 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Existen en el mercado instrumentos manuales para medir CO en el aire como el que se muestra en la figura 1. Figura 1.- Instrumento de medición de 0 a 2000 ppm de CO 1.1.2.1- Métodos Físicos a)- Métodos no instrumentales (Cualitativos) Ensayo de dilución (Haldane) El método consiste en la comparación a simple vista de la coloración de la muestra de sangre sospechosa diluída con otra normal en igual dilución. Una alícuota de sangre normal y otra de la muestra en estudio se diluyen con agua, generalmente al 1%, y se comparan los colores. La sangre normal tiene habitualmente un color rojo amarillento mientras que si la muestra desconocida tiene COHb, el color serácarminado rosado típico indicador de la presencia de COHb Es un método de baja sensibilidad detectándose diferencia de color cuando la saturación de la hemoglobina con CO es mayor del 30%. Ensayo alcalino Se basa en la mayor estabilidad de la COHb, dentro de ciertos límites, con respecto a la labilidad del pigmento hemático normal (Hb) en un medio alcalino. Una muestra de sangre normal y la muestra de sangre en estudio se diluyen con agua, se agrega a ambas muestras NaOH y se observa el color. La sangre normal adquiere color castaño por transformación de la Hb en hematina alcalina. La hematina es la globina desnaturalizada que tiene el Fe como Fe3+. La sangre con COHb mantiene por unos minutos su color carminado, porque la COHb es más resistente y más estable al tratamiento por álcalis. Luego de varios minutos también se transformará en hematina, por lo tanto es importante la observación inmediata. Este ensayo tiene como interferencia la sangre fetal o de recién nacido ya que la Hb fetal es resistente al tratamiento con álcalis y por lo tanto se comporta como laCOHb. La sensibilidad de este ensayo es superior a la del método anterior, ya que con un porcentajede saturación de la Hb con CO superior al 10%, se puede diferenciar de una normal. b)- Métodos instrumentales Métodos Espectrofotométricos Se basan en la determinación de la Absorbancia a longitudes de onda características dentro del espectro visible. Estas Absorbancias son generalmente máximas, mínimas o puntos isosbésticos. De esas diferencias de absorbancia a distintas longitudes de onda, se obtiene la concentración de COHb de la muestra. Existen distintas técnicas con gran cantidad de interferencias: se debe trabajar en condiciones estrictas de pH y
  • 4. 4 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos temperatura. Los picos de Absorbancia de la OHb y COHb son cercanos, la concentración de COHb debe ser elevada para que no interfiera la OHb. Sensibilidad: alrededor del 5% de saturación de COHb en la muestra de sangre. Hasta un 5% de saturación se puede detectar trabajando en condiciones preestablecidas. Cooximetría El Cooxímetro (figura 2) es un analizador semiautomático capaz de medir la concentración de Carboxihemoglobina (COHb) y otras hemoglobinas en muestras de sangre entera. Básicamente estos equipos son fotómetros para múltiples longitudes de onda. Realizan la lectura de la absorbancia a 4 o 5 longitudes de onda para una muestra de sangre hemolizada y mediante algoritmos programados calculan la proporción de cada componente de la hemoglobina total. Las fracciones analizadas son: desoxihemoglobina, oxihemoglobina, sulfohemoglobina, metahemoglobina y carboxihemoglobina. Emplean filtros de interferencia para seleccionar una línea dada del espectro de emisión de una lámpara de cátodo hueco de Tl-Ne. No requieren calibración habitual de la longitud de onda. Los cálculos son realizados por un microprocesador incorporado el cual a partir de las mediciones de la absorbancia y las constantes de absortividad de las distintas fracciones calcula su concentración y, cada fracción es sumada para obtener la concentración de hemoglobina total. La muestra utilizada es sangre entera anticoagulada con heparina. El volumen de sangre utilizado varía según los distintos modelos de cooxímetros, hay equipos en los cuales se inyectan muestras directamente de capilares heparinizados. La muestra se puede conservar hasta 24 horas a 4ºC. Pueden interferir en la determinación elevados niveles de bilirrubina y muestras lipémicas. Figura 2 - Cooxímetro Absorción al IR El CO tiene una absorción característica en el infrarrojo (IR). El CO se libera de la sangre por agregado de ferricianuro de potasio. El gas liberado absorbe al IR estando los picos entre 2120 – 2170 cm–1
  • 5. 5 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Cromatografía gaseosa Es el método de elección cuando hay otros gases interferentes. Tiene gran sensibilidad y puede detectar hasta 0,5% de saturación de CO en sangre. 1.1.2.2- Métodos Químicos Microdifusión Fundamento de la microdifusión La cámara de Conway (Figura 3) consiste en un receptáculo con dos compartimientos concéntricos, generalmente de porcelana, y una tapa de vidrio esmerilada. Se utiliza para la separación de compuestos volátiles o gaseosos, fijándolos en una solución apropiada para luego cuantificarlos. La tapa de vidrio permite un cierre hermético, cuando se le aplica el sellador en sus bordes (vaselina sólida, etc.) Figura 3. Cámara de Conway En el compartimiento externo se coloca el material, el cual contiene el tóxico volátil o gaseoso y en el compartimiento interior una solución fijadora del tóxico apropiada para cada caso. El principio en el cual se basa el aislamiento de los compuestos volátiles o gaseosos es el siguiente: Cuando una solución de un gas o compuesto volátil A, al colocarla en un recipiente hermético se establece el siguiente equilibrio: Recién colocada la solución en el recipiente, el equilibrio se desplaza hacia la derecha, o sea: Luego de cierto tiempo se llega al punto de equilibrio y se tiene: Si se repite la experiencia, pero se coloca la solución del compuesto A en el compartimiento externo de la cámara de Conway y en el compartimiento interno una
  • 6. 6 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos sustancia o solución fijadora del compuesto A, lo que ocurre es un nuevo desplazamiento hacia la derecha Esto ocurre hasta que se agote el compuesto A en la solución inicial. Para ayudar y mejorar la liberación se agrega a la muestra a investigar un reactivo liberador, por ejemplo ácido sulfúrico diluído en el caso de CN-: El tiempo de difusión dependerá de la temperatura y de cada tipo de sustancia. A mayor temperatura menor tiempo de difusión. No se aconseja elevar la temperatura (colocando en estufa por ejemplo), ya que aumentan las probabilidades de pérdida del compuesto volátil o gaseoso. Para cada tipo de microdifusión está estandarizado el tiempo de difusión a temperatura ambiente. Los mecanismos por los cuales se fijan los compuestos a los reactivos fijadores pueden ser varios. Para el caso del CO ocurre una reacción redox. En otros casos es por solubilidad y en otros por reacción ácido-base. Determinación cuantitativa de monóxido de carbono por microdifusión Se coloca en el compartimiento interno el reactivo fijador Cl2Pd 0,01N. Luego se coloca la sangre en el compartimiento externo, se tapa la cámara y se desplaza el vidrio dejando un pequeño espacio de la cámara externa abierto, del lado opuesto al que se agregó la sangre y por él se agrega el reactivo liberador (SO4H2 10%). Se cierra la cámara y se mezclan (liberador y muestra) por rotación. Se deja difundir una hora a temperatura ambiente. Entre el Pd2+ y el CO, se produce la siguiente reacción redox: Como consecuencia aparece en la cámara interna una pátina de color metálico (Pd°) Si se pretende efectuar la determinación cuantitativa, hay que proceder a centrifugar el contenido del compartimiento interno para eliminar el Pd°. Se toma cuantitativamente 0,1 ml del sobrenadante y se transfiere a un matraz aforado. Se toma igual volumen de la solución de Cl2Pd original y se coloca en otro matraz aforado (blanco de reacción). A ambos se agrega goma arábiga (para evitar la precipitación del I2Pd) y solución de IK. Se lee la absorbancia del complejo coloreado formadoa 500 nm: Cálculos La solución fijadora de cloruro de paladio es 0,01N (0,222 g de cloruro de paladio en 250 ml de vehículo), que corresponde por lo tanto a 0,888 gramos por litro. donde 177,61 gramos, es el peso molecular de cloruro de paladio, el cual contiene 106,7 gramos de paladio metálico. Esto equivale a 0,5335 mg por ml de la solución reactivo 0,01N. De acuerdo a la ecuación redox antes señalada, cada mol de paladio es
  • 7. 7 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos reducido por un mol de monóxido de carbono, es decir que 177,61 mg de cloruro de paladio son reducidos por 28 mg de monóxido de carbono. Por lo tanto: Por lo tanto, 0,26 es el factor de transformación para expresar mg de paladio enmg de monóxido de carbono. Una vez determinada la densidad óptica del complejo [I4Pd]2-, los mg de paladio reducido se calculan de la manera que sigue: Db= Absorbancia del blanco y Dd = Absorbancia del desconocido o muestra y donde 0,05335 corresponde a los mg de Pd en 0,1 ml de la solución de cloruro de paladio. Para expresar ese resultado en mg por ciento de monóxido de carbono, se debe multiplicar por 520, factor que proviene de multiplicar 2 x 10 (para referir al volumen inicial de sangre y de acuerdo con la dilución), por 100 para referir a 100 ml de sangre y por 0,26 (factor de transformación), resultando que: 2 x 10 x 100 x 0,26 = 520 Por lo tanto: ó Los mg de CO pueden expresarse en ml de CO, por medio de un factor que es igual a 0,8 ya que 1 mol de gas equivale a 22,4 l en las condiciones normales de presión y temperatura. Por lo tanto:
  • 8. 8 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos El valor se lo suele referir a la cantidad de Hb de la sangre problema (por ejemplo “a” g), expresando el CO hallado como porcentaje de saturación de la Hb total, sabiendo que: 1.1.3- Interpretación del resultado Comúnmente, los valores registrados en casos de intoxicaciones fatales son superiores al 50% de saturación de la hemoglobina total. Valores fisiológicos No fumadores Menor a 0,6% Hb total Fumadores 3,0-8,0% Hb total BEI (Índice Biológico de Exposición) menor a 3,5% Hb total Efectos en la salud humana por exposición a monóxido de carbono Concentración de HbCO en sangre (%) Efecto observado 2,3-4,3 Disminución en la capacidad de realizar un ejercicio máximo en un corto tiempo en individuos jóvenes saludables 2,9-4,5 Disminución en la duración de ejercicio, debido a dolor en el pecho (angina), en pacientes con enfermedades al corazón. Disminución del consumo máximo de oxígeno y tiempo para realizar ejercicio, en individuos jóvenes saludables durante ejercicio fuerte. 5-5,5 Disminución en la percepción visual y auditiva. Pérdida de la capacidad sensorial, motora y de vigilancia. 5,0-17,0 Disminución en el consumo máximo de oxígeno durante el ejercicio fuerte, en individuos jóvenes saludables. 7,0-20,0 Dolor de cabeza, decaimiento. 20,0-30,0 Mareo, náusea, debilidad 30,0 Confusión, colapso durante el ejercicio 40,0 Pérdida de conciencia y muerte si la exposición continúa 50,0 Muerte Fuente: OMS: http://www.bvsde.paho.org/cursoa_orientacion/lecc4/lecc4_co.html
  • 9. 9 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 1.2- ACIDO CIANHÍDRICO Y CIANUROS ALCALINOS 1.2.1- Introducción La intoxicación aguda por compuestos derivados del HCN puede deberse a ingestión de cianuros alcalinos (de sodio o potasio, los más comunes), o a inhalación del HCN gaseoso. La intoxicación por ingestión de glucósidos cianogenéticos como los contenidos en los frutos del albaricoque, almendras amargas, etc.,es poco frecuente pero puede ocurrir especialmente en niños. La intoxicacióncrónica puede deberse a la exposiciónal HCNde los trabajadores de ciertas industrias como galvanoplastia, limpieza de metales, síntesis química, investigación, etc. 1.2.2-Investigación del Ácido cianhídrico y los Cianuros alcalinos Existen tres clases de determinaciones: los ensayos inmediatos, los ensayos mediatos y los procedimientos cuantitativos Ensayos inmediatos Son procedimientos cualitativos, que se realizan en la atmósfera del recipiente que contiene el material a analizar. Los materiales donde se determinan CNH y Cianuro pueden ser: vísceras (cadáver); sangre y orina si el individuo no ha muerto; alimentos (muchos vegetales que contienen glucósidos cianogenéticos y que al ser ingeridos, por acción de enzimas que se encuentran tanto en el hombre como en animales, liberan CNH); alimentos con agregado intencional de cianuro; etc. En tejidos y alimentos los cianuros están fijos como cianuros alcalinos. El recipiente que contiene la muestra debe estar cerrado herméticamente para evitar pérdidas y la exposición del personal que está en contacto con el recipiente. En la atmósfera del recipiente se libera CNH, ello se puede deber a dos tipos de procesos:  Proceso hidrolítico: El equilibrio se desplaza hacia la derecha a medida que se desprende el gas HCN.  Si se trata de vísceras, por efecto putrefactivo se libera CNH de acuerdo con: Estos métodos permiten identificar CNH en forma rápida, en base a la utilización de los llamados “papeles sensibles”. Consisten en utilizar tiras de papel de filtro impregnadas con ciertos reactivos que se introducen en la atmósfera del recipiente Se describen tres ensayos mediante papeles sensibles: Ensayo de Guayaco-cúprico o de Schömbein Se toma una tira de papel de filtro y en uno de los extremos se agrega una gota de SO4Cu 0.5%, inmediatamente sobre la gota anterior se agrega una gota de resina de Guayaco y se coloca la tira en el recipiente en el cual se quiere investigar la presencia de HCN sin que tome contacto con el material que lo contiene. Se considera un resultado positivo cuando aparece un color azul intenso, negativo por aparición de color castaño (color de la resina de Guayaco) y dudoso por observación después de varios minutos de un color verde o azul débil.
  • 10. 10 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Cuando se sospeche que hay poca cantidad de CN- en la muestra en estudio, deberá agregarse ácido tartárico, porque es más fuerte que el HCN y lo desplaza de sus combinaciones. Calentando a 60°C durante 30 minutos se desplazan los CN- fijos a HCN. Se repiten las determinaciones con nuevos papeles; si se obtiene color azul intenso, el ensayo es positivo; si da dudoso nuevamente se descarta la presencia del ión CN-. Valor analítico del ensayo Cuando es negativo, permite descartar la presencia de CN- ya que es muy sensible pero muy poco específico. La poca especificidad se debe a:  Presencia de oxidantes directos de la resina de Guayaco, por ejemplo, ClO-, ClO3 -, nitratos y nitritos, dan falsos positivos.  Presencia de reductores: estos reducen las sales de Cu2+ y actúan de la misma forma que el cianuro, dan falsos positivos. Para descartar la presencia de oxidantes directos, en el mismo procedimiento, se usa una tira de papel sólo con resina de Guayaco (sin SO4Cu); si la reacción da positiva al introducirla en el recipiente (azul), existen oxidantes directos. Si no da color azul (o sea es negativo, se agrega SO4Cu a la misma tira. Si ahora se observa un color azul, se puede pensar que hay cianuros presentes. Si el resultado fuera negativo se descarta la presencia de cianuros. Entonces si el ensayo resultara negativo se descarta la presencia de cianuros en el material, y si fuera positivo se aplican otros métodos más específicos. Fundamento Las sales de Cu al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas aumentan su potencial de oxidación. Esto se puede aprovechar si colocamos una sustancia que al oxidarse cambie de color, como la resina de Guayaco o ácido guayacónico, que es de color castaño y vira al azul. Primero se forma una sal inestable (CN)2Cu, que pasa a CNH y CNOH, este último responsable de la oxidación del ácido guayacónico que da azul de guayaco, lo que permite visualizar la reacción del CNH sobre el Cu2+. Sensibilidad Según algunos autores: 1:3 x 106. Según otros autores: hasta 0,25 microgramos de ácido cianhídrico
  • 11. 11 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Ensayo de o-tolidina Fundamento Tiene igual fundamento que la reacción anterior pero la visualizaciónse hace con o-tolidina; también se pueden usar: bencidina, fenolftaleína o cualquier sustancia que al oxidarse forme un complejo coloreado. Complejo que se forma con la o-tolidina al oxidarse dos moléculas de este reactivo es el que se indica en la figura 2-1. Figura 1.2.1- Complejo coloreado de la o-tolidina oxidada Valor analítico del ensayo:esta reacción es altamente sensible pero inespecífica. Si los ensayos Guayaco-cúprico y de o-tolidina dan positivos se realiza un tercer ensayo, más específico. Ensayo de Magnin Este ensayo es poco sensible pero muy específico. Se basa en la formación de Azul de Prusia. Para ello se impregna la tira de papel en NaOH, se pone en contacto con la atmósfera del recipiente y se deja actuar unos minutos. El NaOH fija el CNH como CN-de acuerdo a la siguiente ecuación: Luego se agrega a la tira SO4Fe. Se observa la formación de un precipitado verdoso que luego pasa a castaño. Finalmente por agregado de unas gotas de ClH da color azul por formación del Azul de Prusia de acuerdo a las siguientes ecuaciones: El Fe(OH)2 es inestable, y se oxida por acción del O2 del aire precipitando como Fe(OH)3 de color castaño, por lo tanto: y por agregado del HCl:
  • 12. 12 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Siempre se efectúan por lo menos dos reacciones: una muy sensible (resina de guayaco u o-tolidina) y otra muy específica (Magnin). Si las dos reacciones dan positivas se procede al aislamiento. Ensayos Mediatos Si los ensayos inmediatos dieran positivos, se procede posteriormente a efectuar los Ensayos Mediatos. Para ello primero se procede al aislamiento y luego a la identificación del ión CN-. Este ión puede investigarse mediante la Formación de Azul de Prusia (directo y modificado); por transformación en sulfocianuro (SCN-) o por la Reacción de Aldridge. Aislamiento Se hace por destilación simple (figura 2.2). Se agrega ácido tartárico al material, se destila y se recoge el HCN en NaOH para fijarlo. Figura 1.2.2– Destilación simple Si el material es visceral no debe conservarse en formol porque reacciona con el HCN formando cianhidrinas de las que no se puede liberar HCN, por lo tanto no se podría identificar. En el caso de vísceras en estado de putrefacción agregar al material a destilar acetato básico de plomo para retener el SH2. Reacciones de identificación sobre el destilado Reacción del azul de Prusia directa Se usan los mismos reactivos y tiene el mismo fundamento que la reacción en papel. Se toma una porción del destilado (donde el CN- ya está fijo) y se agrega SO4Fe, se
  • 13. 13 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos deja unos minutos al aire (toma color castaño) y finalmente se añade ClH dando un precipitado de color azul. Es una reacción de muy baja sensibilidad (1:10000) Reacción del azul de Prusia modificada o método de Chelle-Klassen La modificación consiste en ajustar previamente el pH a 8,0, medio en el cual va a precipitar luego el azul de Prusia. El ajuste se hace usando fenolftaleína como indicador (en medio básico, rosada), se agrega solución diluido de SO4H2 que la hace virar a incolora y luego por agregado de borato o carbonato de sodio se lleva a pH alcalino aproximadamente igual a 8. Luego se lleva a cabo la reacción del azul de Prusia. Mediante esta modificación aumenta la sensibilidad hasta 10 microgramos de ión cianuro. Si se tienen cantidades muy pequeñas se puede aumentar aún más su sensibilidad. En estos casos el azul de Prusia no precipita sino que queda como coloide suspendido. Se agrega entonces Cl2Ba, se forma SO4Ba que arrastra al azul de Prusia, concentrándose en el fondo del tubo de ensayo, en forma de un “botón” azul o blanco azulado. Sensibilidad: hasta 5 microgramos de ión cianuro. Reacción de Aldridge Es una reacción cualitativa, que se recomienda también para determinaciones cuantitativas (con el mismo fundamento se la utiliza en microdifusión). Esta determinación puede realizarse sobre el destilado, y en muestras de sangre y orina. Cuando no se usa el destilado la muestra debe desproteinizarse previamente (generalmente con tricloroacético). El destilado o el desproteinizado se acidifican con AcH y posteriormente se agrega agua de Br2 saturada. El CN- reacciona con el Br2: Generalmente queda un exceso de Br2 (amarillo) que debe ser eliminado por el agregado de arsenito de sodio decolorándose la solución. Luego se agrega un reactivo a base de Piridina en medio ácido: Reactivo Pirídico (Piridina diluida y acidificada). Este compuesto es inestable, se descompone por un proceso hidrolítico y se rompe el anillo. Queda el aldehído glutacónico (alcohol en un extremo y aldehído en el otro). Si se le agrega una amina primaria cíclica, bencidina por ejemplo, se forma una base de Schiff en los extremos y se obtiene un compuesto coloreado:
  • 14. 14 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Sensibilidad: hasta 3 microgramos de ión cianuro. 1.2.3-Métodos Cuantitativos Existen macro y microtécnicas. Son ejemplo de macrotécnicas las técnicas volumétricas; y de microtécnicas la microdifusión en Cámara de Conway. Se utilizan microtécnicas para la determinación del ión cianuro por los siguientes métodos de microdifusión: Tompsett y Feldstein y Klendshoj. Existen otras variantes dentro de estos procedimientos. Microdifusión: Reacción de Tompsett Se utiliza la cámara de Conway (fig. 2.3) la cual se sella con un vidrio esmerilado, lubricado previamente con vaselina o sellador, para evitar pérdidas. Figura 1.2.3- Esquema de la cámara de Conway Se usan los mismos reactivos y tiene el mismo fundamento que la reacción de Aldridge. Las muestras que se usan son homogenatos de vísceras, sangre u orina. El reactivo liberador (compartimiento externo) es el ácido sulfúrico. Su concentración depende del tipo de microdifusión usada. El reactivo liberadordebe ser un ácido más fuerte que el HCN para desplazarlo de las uniones. El reactivo fijador (compartimiento interno) es NaOH. Tiempo de difusión: 3 – 4 hs. a temperatura ambiente. Una vez fijado el CN- se procede a su cuantificación. Se coloca el contenido de la cámara interna en un tubo de ensayo, se acidifica con ácido acético, luego se adiciona agua de Br2, arsenito para eliminar el exceso de Br2 y finalmente el reactivo piridina-bencidina. Se lee la absorbancia del compuesto coloreado (rosa-rojo) a 520 nm, se interpola en la curva de calibración construída previamente con distintos estándares de CN- y se obtiene la cantidad de cianuro presente en la muestra. Microdifusión: Reacción de Feldstein y Klendshoj El reactivo liberador es ácido sulfúrico. El reactivo fijador es NaOH. Tiempo de difusión: 3 – 4hs. a temperatura ambiente
  • 15. 15 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Para su cuantificación se utiliza la reacción de Aldridge pero difieren los reactivos. Los reactivos que se utilizan son fosfato monosódicopara regular el pH, cloramina T en lugar de Br2 acuoso, finalmente se agrega piridina – ácido barbitúrico. Por reacción con la Cloramina T se forma el cloruro de cianopiridina que se descompone y reacciona con el ácido barbitúrico. Se lee la absorbancia del compuesto formado a 580 nm (color lila-violeta). Valores normales de CN- en un individuo adulto Hasta 15 μg% el CN- aparece como producto del catabolismo normal en pequeñas cantidades. En la intoxicación por inhalación de ácido cianhídrico. Valores mayores de 100 μg% suelen ser fatales, pero esto varía de un individuo a otro. En la intoxicación por ingestión de cianuros los valores suelen ser mayores aún 1-2 mg%. La ingestión de 200 mg de CNNa puede provocar la muerte de un individuo adulto. En muestras de sangre cadavérica el CN- desaparece rápidamente por acción enzimática y bacteriana. Debe conservarse la muestra con FNa al 1% para evitar dichas acciones.
  • 16. 16 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos 1.3- TRABAJO PRÁCTICO Nº 1: MONÓXIDO DE CARBONO Y ÁCIDO CIANHÍDRICO Y CIANUROS ALCALINOS 1.3.1-TRABAJO PRÁCTICO: MONÓXIDO DE CARBONO Desarrollo del trabajo práctico- Actividades a realizar  Los alumnos serán divididos en grupos de trabajo.  A cada grupo se le asignarán distintas muestras que deberán analizar.  Al finalizar el TP, cada grupo deberá presentar un informe con los resultados analíticos y una discusión en base a los datos obtenidos. 1.3.1.1- Determinación Cuantitativa de Monóxido de Carbono Método de Feldstein-Klendshoj (en sangre por Microdifusión) Medidas de seguridad Cada reactivo debe ser considerado como un peligro potencial a la salud y la exposición a estos compuestos debe ser minimizada con buenas prácticas de laboratorio. Fundamento Se basa en el poder reductor del monóxido de carbono, que actuando sobre una solución de Cl2Pd, lo transforma en Pd°. La sal de paladio origina, con el ion ioduro, un complejo coloreado de máxima absorción a 500 nm. Conociendo la absorbancia del complejo formado a partir de la solución blanco de Cl2Pd y la que reaccionó con el CO se establece la concentración de COHb presente en la muestra. Muestra Sangre entera (un volumen mínimo de 5 ml) obtenida por punción venosa con heparina como anticoagulante. Una vez extraída la muestra rotular el recipiente que la contiene. Si se trasvasa la sangre a un tubo, éste deberá estar limpio, seco y cerrarse herméticamente. Conservación de la muestra. Cuando no se realice el análisis en forma inmediata se puede conservar durante 3 días entre 2 y 8ºC. Reactivos  Solución de cloruro de paladio 0,01N: Disolver 0,222 g de cloruro de paladio en c.s. de ácido clorhídrico 0,01N, calentando si fuera necesario. Completar a 250 con dicha solución.  Ácido sulfúrico 10% (v/v)  Goma arábiga al 0,1% (p/v)  Solución de ioduro de potasio al 15% (p/v) Materiales  Cámara de Conway  Matraces aforados de 10,0 ml El habitual de laboratorio que se incluirá en el procedimiento. El tratamiento del material de vidrio será mediante lavado con detergente y enjuagado con agua de grifo, 3 veces. Luego enjuagado con agua destilada, 3 veces y secado en estufa. Tratamiento del material de trabajo Lavado con detergente y enjuagado con agua de grifo, 3 veces Enjuagado con agua destilada, 3 veces Secado en estufa Instrumental Espectrofotómetro UV-visible.
  • 17. 17 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Procedimiento  En una unidad de Conway, colocar en el compartimiento interno, 2,0 ml de la solución de cloruro de paladio 0,01N y en el compartimiento externo, 1 ml de sangre y 1 ml de ácido sulfúrico al 10%, en la parte opuesta a la que se colocó la sangre.  Cubrir la cámara con la respectiva tapa de cierre ya preparada con la vaselina siliconada a fin de asegurar un cierre hermético y mezclar la sangre con el ácido sulfúrico mediante un suave movimiento de rotación.  Dejar difundir 1 hora a temperatura ambiente. Si no hay cambio en el aspecto de la solución reactiva, el ensayo puede considerarse negativo. De existir monóxido de carbono aparece, en la superficie de la solución de Pd+2, una pátina plateada debido a la formación de paladio metálico. Determinación espectrofotométrica  Con una pipeta capilar extraer la totalidad de la solución del compartimiento interno de la cámara de Conway, compuesta por paladio metálico y exceso de la solución de Pd+2, y colocar en un tubo de centrífuga.  Centrifugar a 3000 rpm, para separar el precipitado de Pdo.  Trasvasar 0,1 ml del sobrenadante a un matraz aforado de 10,0 ml. (ver esquema de trabajo)  En otro matraz de 10,0 ml colocar 0,1 ml de la solución de paladio 0,01N el que se utilizará como blanco.  A cada matraz agregar 1 ml de solución de goma arábiga al 0,1% y 1 ml de IK al 15%.  Mezclar bien y llevar a volumen con agua destilada.  Determinar la densidad óptica a 500 nm llevando a 0 con agua destilada en el espectrofotómetro. Esquema de trabajo para la determinación espectrofotométrica de la COHb En matraz aforado de 10 ml Muestra Blanco Sobrenadante 0,1 ml - Solución de Paladio - 0,1 ml goma arábiga al 0,1% 1 ml 1 ml IK al 15% 1 ml 1 ml Agua destilada Llevar a 10 ml Mezclar Leer absorbancia a 500 nm El exceso de la sal de paladio, Pd2+, origina con el ión ioduro, un complejo coloreado de máxima absorción a 500 nm. Cálculos La concentración de CO expresada en mg% se calcula de acuerdo a la ecuación: Ejemplo: En una determinación practicada en una muestra de sangre de un sujeto fallecido por inhalación de monóxido de carbono se hallaron los siguientes valores para las lecturas de absorbancia:
  • 18. 18 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos por lo cual Luego, Para expresar el resultado en por ciento de saturación (porcentaje de saturación de la hemoglobina), es necesario conocer el tenor en hemoglobina. En el caso citado, la muestra acusó un tenor de 13 gramos por ciento de hemoglobina, entonces: Como 1 g de hemoglobina fija 1,34 ml de monóxido de carbono, 13 gramos fijarán: 13x1,34 = 17,42 ml. Luego, 1.3.2- TRABAJO PRÁCTICO: CIANUROS 1.3.2.1- Ensayos inmediatos Muestra Cualquiera fuere su naturaleza (vísceras, líquidos biológicos, alimentos) deben acondicionarse en recipientes bien limpios y secos, sin agregado de sustancia alguna como conservador. El único medio de conservación aplicable es el frío. La identificación inmediata del ácido cianhídrico de cianuros alcalinos se efectúa en forma directa en la atmósfera del recipiente que contiene el material a analizar. La liberación del ácido cianhídrico se debe a un proceso hidrolítico que prosigue en variada magnitud según las condiciones del medio. Ensayo con o-Tolidina Fundamento del método Se basa en la misma interpretación dada para el ensayo guayaco-cúprico. El color azul es imputable a un derivado de estructura meriquinoide, similar al que produce la bencidina.
  • 19. 19 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Reactivos  Solución acuosa de sulfato de cobre al 0,5%.  Solución alcohólica de o-Tolidina al 1%. Materiales  Papel de filtro de 2 x 15 cm.  Cápsula de porcelana.  Varilla de vidrio. Procedimiento  Humectar una tercera parte del papel de filtro con la solución de sulfato de cobre 0,5% y luego, mediante una varilla de vidrio, extender sobre la superficie humectada I gota de solución alcohólica de o-tolidina al 1%.  Colocar el papel en el interior del recipiente que contiene el material a analizar.  En presencia de ácido cianhídrico se observa en forma inmediata color azul verdoso que rápidamente vira al azul neto.  La aparición de color azul tenue por exposición prolongada no tiene significación analítica. Interferencias  Oxidantes directos de la o-tolidina  Reductores que actúen de la misma forma que el cianuro sobre las sales de cobre. Valor analítico del ensayo Tiene valor cuando es negativo ya que es una reacción inespecífica. Cuando es positivo requiere confirmación por ensayos específicos. Sensibilidad: es una reacción altamente sensible. Ensayo de Magnin Fundamento del método Se basa en la obtención del denominado azul de Prusia Reactivos  Solución acuosa de hidróxido de sodio al 2%  Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% (preparación reciente)  Ácido clorhídrico concentrado pa Materiales  Papel de filtro de 2 x 15 cm  Cápsula de porcelana Procedimiento  Impregnar el papel de filtro con I-II gotas de la solución de hidróxido de sodio al 2% y exponer en el interior del recipiente durante algunos minutos.  Retirar y extender sobre una cápsula de porcelana.  Distribuir sobre la superficie expuesta IV gotas de solución de sulfato ferroso 2%: aparece un precipitado verde (hidróxido de Fe+2), que se oscurece paulatinamente (hidróxido de Fe+3)  Dejar al aire unos minutos para favorecer la oxidación del ión ferroso.  Acidificar con unas gotas de ácido clorhídrico concentrado: en presencia de ión cianuro aparece precipitado azul de Prusia. Valor analítico El ensayo de Magnin constituye un recurso analítico categórico para demostrar la existencia de ácido cianhídrico dada su especificidad. Sensibilidad: es un ensayo menos sensible que los descriptos anteriormente. 1.3.2.2-Ensayos Mediatos Se trata del aislamiento e identificación del ácido cianhídrico a partir de los cianuros alcalinos.
  • 20. 20 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos El aislamiento se realiza por destilación simple en medio ácido (se acidifica el material conácido tartárico al 10%), recogiendo el destilado en solución acuosa de hidróxido de sodio al 10%. Los ensayos mediatos se efectúan sobre el destilado. Ensayo de Azul de Prusia directo Fundamento El ensayo se basa en la formación del precipitado azul por formación del azul de Prusia sobre el destilado. Reactivos  Solución acuosa de sulfato ferroso al 2% (preparación reciente).  Ácido clorhídrico concentrado pa. Procedimiento  Colocar en un tubo de ensayo unos 2-4 mililitros del destilado y agregar IV gotas de la solución de sulfato ferroso al 2%.  Calentar suavemente a ebullición hasta aparición del precipitado color castaño de hidróxido férrico.  Enfriar y agregar c.s. de ácido clorhídrico concentrado.  En presencia de ión cianuro aparece color o precipitado azul. En ausencia de ión cianuro aparece color amarillo débil (ión férrico). Sensibilidad: 1:10000 Reacción de Aldridge Fundamento Por acción del bromo, el ión cianuro se transforma en bromuro de cianógeno, que reacciona con la piridina para originar el bromuro de cianopiridina. La acción hidrolítica determina la apertura del anillo pirídico, para dar lugar a la formación del aldehído glutacónico. Cuando este derivado se acopla con aminas primarias cíclicas (ej: bencidina) se obtienen compuestos coloreados (bases de Schiff) Reactivos  Ácido acético glacial p.a.  Solución saturada de agua bromo.  Solución acuosa de arsenito de sodio al 1,5%.  Reactivo pirídico: a 50 ml de agua destilada se agregan 5 ml de piridina y 2 ml de ácido clorhídrico concentrado, completando a 100 ml con agua destilada.  Solución acética saturada de bencidina. Procedimiento  Acidificar ligeramente 1 ml del destilado con ácido acético concentrado y agregar 0,5 ml de agua de bromo a saturación.  Incorporar a continuación 0,5 ml de solución de arsenito de sodio al 1.5% y luego agregar 5 ml del reactivo pirídico, mezclar bien e incorporar por último 0,2 ml de la solución acética de bencidina. Si existe ión cianuro aparece color naranja que pasa a rojo. Sensibilidad: hasta 3 microgramos de ión cianuro.
  • 21. 21 Seminario y trabajo práctico Nº 1: Monóxido de carbono -Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos Bibliografía:  Albiano, N.F. (2011) Gases asfixiantes químicos (sección 4- Cap. 13) en Toxicología Laboral, Ed. Superintendencia de Riesgos del Trabajo, Buenos Aires.  Conway, E.J. (1962)Microdiffusion analysis and volumetric error. (5th ed.), Crosby Lockwood and Sons, London, UK.  Fabre y Truhaut, R. (1977) Toxicología. Paraninfo – Madrid.  Frejaville, J. P.; Buordon, R. (1979) Toxicología Clínica y Analítica. Editorial Jims. Barcelona.  Guatelli, M. (1971)Intoxicación oxicarbonada. Estudio bioquímico y metodología analítica. EUDEBA. Buenos Aires.  Guatelli, M. (2005) Ácido cianhídrico y cianuros alcalinos: Guía de Trabajos Prácticos – Cátedra de Toxicología y Química Legal – Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. 104 pp.  Fiorenza Biancucci, G.; González, D.; Pérez, A.; Ridolfi, A.; Strobl, A (2008) Manual de procedimientos analíticos Toxicológicos para laboratorios de baja complejidad.Eds: Asociación Toxicológica Argentina (ATA),OPS/OMS.Ciudad de Buenos Aires.186 pp.  Lauwerys, R.; Hoet, P. (1993) Industrial Chemical Exposure. (2nd ed.) Lewis Publishers. Florida, USA, 318 pp.  Leikin,J.B.; Paloucek,F.P.(1998) Poisoning and Toxicology Compendium,Lexi- Comp Inc. Hudson, Ohio, 1465 pp.  Roses, O.E. (1979) Monóxido de carbono. En El laboratorio en la clínica.Ed: Iovine-Selva, Cap. 17. Editorial Panamericana, Buenos Aires.