SP Tests antipaludogrammes - Conférence de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Marie Ange RASON et Milijaona RANDRIANARIVELO JOSIA
Guide d’élaboration d’un plan de gestion des achats et des stocks (Global Fun...
SP Tests antipaludogrammes
1. 1
Travaux pratiquesTravaux pratiques
Test de chimiosensibilitTest de chimiosensibilitéé in vitro pourin vitro pour
ll’é’évaluation de la sensibilitvaluation de la sensibilitéé dede PlasmodiumPlasmodium
falciparumfalciparum aux extraits de plantesaux extraits de plantes
Marie Ange Rason, Laetitia Morin, Michel RatsimbasonMarie Ange Rason, Laetitia Morin, Michel Ratsimbason
et Milijaona Randrianarivelojosiaet Milijaona Randrianarivelojosia
Atelier PaludismeAtelier Paludisme –– 5eme5eme ééditiondition
19 F19 Féévrier au 30 Mars 2007vrier au 30 Mars 2007
2. 2
Photo:Randrianarivelojosia&Tall,Nov.Photo:Randrianarivelojosia&Tall,Nov.20032003
…… il y a un besoin permanent en nouveaux antipaludiquesil y a un besoin permanent en nouveaux antipaludiques
Antipaludiques, outil de lutte contre le paludisme :Antipaludiques, outil de lutte contre le paludisme :
nombre limitnombre limitéé et det dééfifiéés par la rs par la réésistance des parasitessistance des parasites
3. 3ÉÉtapes cltapes cléé dans le ddans le dééveloppement de mveloppement de méédicamentsdicaments
5. 5
MMéédecine traditionnelle : traitement des symptômesdecine traditionnelle : traitement des symptômes
(page 73)
TazoTazo (fi(fièèvre, frisson, cvre, frisson, cééphalphaléée, lombalgie, fatiguee, lombalgie, fatigue ……))
nn’’est pas forcement du paludismeest pas forcement du paludisme
6. 6
Plantes, paludisme et antipaludiquesPlantes, paludisme et antipaludiques
AmAméérique latine :rique latine :
QuinineQuinine
Asie :Asie :
ArtemisinineArtemisinine
7. 7
Photo:Randrianarivelojosia,2003
?
PaludismePaludisme etet plantesplantes
africainesafricaines
Plantes mPlantes méédicinales en Afrique :dicinales en Afrique :
superstition ? rsuperstition ? rééalitalitéé ??
Comment dComment déécouvrir descouvrir des
molmoléécules antipaludiquescules antipaludiques àà
partir des plantes ?partir des plantes ?
MMéédicaments obtenusdicaments obtenus àà partirpartir
des plantes de Madagascardes plantes de Madagascar
CatharanthusCatharanthus roseusroseus donne desdonne des
antianti--leucleucéémiquesmiques
CentellaCentella asiaticaasiatica donne un cicatrisantdonne un cicatrisant
8. 8
Plantes de Madagascar et de lPlantes de Madagascar et de l’’Afrique,Afrique, éétuditudiéées rigoureusementes rigoureusement
par des grands laboratoirespar des grands laboratoires
9. 9
Premier pas :Premier pas : identifier des extraits ou des molidentifier des extraits ou des molééculescules
antiplasmodialesantiplasmodiales àà partir des plantespartir des plantes
CC
HH
II
MM
II
EE
PlantesPlantes BiologieBiologie
10. 10
Premier pas :Premier pas : identifier des extraits ou des molidentifier des extraits ou des molééculescules
antiplasmodialesantiplasmodiales àà partir des plantespartir des plantes
CC
HH
II
MM
II
EE
EthnobotaniqueEthnobotanique
chimiotaxonomiechimiotaxonomie
Collection deCollection de plantesplantes
Test antiplasmodial in vitroTest antiplasmodial in vitro
PlantesPlantes BiologieBiologie
11. 11
Premier pas :Premier pas : identifier des extraits ou des molidentifier des extraits ou des molééculescules
antiplasmodialesantiplasmodiales àà partir des plantespartir des plantes
CC
HH
II
MM
II
EE
EthnobotaniqueEthnobotanique
chimiotaxonomiechimiotaxonomie
Collection deCollection de plantesplantes
Test antiplasmodial in vitroTest antiplasmodial in vitro
Test de cytotoxicitTest de cytotoxicitéé in vitroin vitro
Test in vivo chez laTest in vivo chez la sourissouris
((antipaludiqueantipaludique,, toxicittoxicitéé))
PlantesPlantes BiologieBiologie
12. 12
Premier pas :Premier pas : identifier des extraits ou des molidentifier des extraits ou des molééculescules
antiplasmodialesantiplasmodiales àà partir des plantespartir des plantes
CC
HH
II
MM
II
EE
Collection deCollection de plantesplantes
Test antiplasmodial in vitroTest antiplasmodial in vitro
Test de cytotoxicitTest de cytotoxicitéé in vitroin vitro
Test in vivo chez laTest in vivo chez la sourissouris
((antipaludiqueantipaludique,, toxicittoxicitéé))
PlantesPlantes BiologieBiologie
13. 13
Premiers pas :Premiers pas : Identification des extraits actifs in vitroIdentification des extraits actifs in vitro
contrecontre Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum
SSéélectionlection
des plantesdes plantes
CollecteCollecte
des plantesdes plantes
PrPrééparationparation
des ddes déécoctcoctééss
14. 14
Premiers pas :Premiers pas : Identification des extraits actifs in vitroIdentification des extraits actifs in vitro
contrecontre Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum
SSéélectionlection
des plantesdes plantes
Culture de
Plasmodium falciparum
CollecteCollecte
des plantesdes plantes
PrPrééparationparation
des ddes déécoctcoctééss
15. 15
Premiers pas :Premiers pas : Identification des extraits actifs in vitroIdentification des extraits actifs in vitro
contrecontre Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum
SSéélectionlection
des plantesdes plantes
Culture de
Plasmodium falciparum
CollecteCollecte
des plantesdes plantes
Test
anti-Plasmodium
in vitro
PrPrééparationparation
des ddes déécoctcoctééss
Evaluation
de l’activité
antiplasmodiale
(Extrait aqueux ou organique)(Extrait aqueux ou organique)
16. 16
Premiers pas :Premiers pas : Identification des extraits actifs in vitroIdentification des extraits actifs in vitro
contrecontre Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum
Culture de
Plasmodium falciparum
Test
anti-Plasmodium
in vitro
Evaluation
de l’activité
antiplasmodiale
SSéélection deslection des
extraitsextraits àà fractionnerfractionner
FractionnementFractionnement
(chromatographie)(chromatographie)
(fractions(fractions
ou molou moléécules pures)cules pures)
17. 17
Premiers pas :Premiers pas : Identification des extraits actifs in vitroIdentification des extraits actifs in vitro
contrecontre Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum
Culture de
Plasmodium falciparum
Test
anti-Plasmodium
in vitro
Chimie de planteChimie de plante
(purification)(purification)
Evaluation
de l’activité
antiplasmodiale
(mol(moléécules isolcules isoléées)es)
18. 18
ActivitActivitéé intrinsintrinsèèque antique anti--
PlasmodiumPlasmodium des extraitsdes extraits
de plantesde plantes
Effet des extraits deEffet des extraits de
plantes sur lplantes sur l’’activitactivitéé desdes
antipaludiques standardantipaludiques standard
Premiers pas :Premiers pas : Que peutQue peut--on chercheron chercher in vitroin vitro ??
19. 19
Cycle biologique des plasmodies infectant lCycle biologique des plasmodies infectant l’’hommehomme
20. 20
Culture continue deCulture continue de Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum
(reproduction in vitro du stade(reproduction in vitro du stade erythrocytaireerythrocytaire))
21. 21
Tests antiplasmodialTests antiplasmodial in vitroin vitro
MicroscopiqueMicroscopique
OMS, CTD/MAL/97.20OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001
ColorimColoriméétrique (pLDH, HRPII)trique (pLDH, HRPII)
Moreno etMoreno et alal.. MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757
NoedlNoedl etet alal.. AntimicrobAntimicrob AgentsAgents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--6464
Isotopique (hypoxanthine tritiIsotopique (hypoxanthine tritiéée)e)
Desjardins, ClinDesjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929
Le Bras,Le Bras, AmAm J TropJ Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151
Mise en cultureMise en culture
des parasitesdes parasites
CytomCytoméétrie en fluxtrie en flux
PattanapanyasatPattanapanyasat etet alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191
MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen,, SybergreenSybergreen))
Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
22. 22
Contraintes logistique et technique (communes)Contraintes logistique et technique (communes)
•• Clone de parasitesClone de parasites
•• ÉÉquipements de laboratoirequipements de laboratoire
•• Personnel compPersonnel compéétanttant
•• Bonnes pratiques de laboratoireBonnes pratiques de laboratoire
•• Souches de rSouches de rééfféérence derence de P. falciparumP. falciparum ((3D7, FCM29, D63D7, FCM29, D6 ……))
Questionnements :Questionnements :
-- laboratoires rlaboratoires réégionaux en Afrique ?gionaux en Afrique ?
-- collaborationscollaborations sudsud--nordnord ??
23. 23
Tests de chimiosensibilitTests de chimiosensibilitéé in vitroin vitro
MicroscopiqueMicroscopique
OMS, CTD/MAL/97.20OMS, CTD/MAL/97.20 RevRev. 2 2001. 2 2001
ColorimColoriméétrique (pLDH, HRPII)trique (pLDH, HRPII)
Moreno etMoreno et alal.. MedMed Trop 2001; 61:545Trop 2001; 61:545--5757
NoedlNoedl etet alal.. AntimicrobAntimicrob AgentsAgents ChemotherChemother 2002; 46:16582002; 46:1658--6464
Isotopique (hypoxanthine tritiIsotopique (hypoxanthine tritiéée)e)
Desjardins, ClinDesjardins, Clin PharmacolPharmacol TherTher 1979; 26:3271979; 26:327--2929
Le Bras,Le Bras, AmAm J TropJ Trop MedMed HygHyg 1983; 32: 4471983; 32: 447--5151
CytomCytoméétrie en fluxtrie en flux
PattanapanyasatPattanapanyasat etet alal.. CytometryCytometry 1997; 27: 841997; 27: 84--9191
MicrofluorimetriqueMicrofluorimetrique ((PicoGreenPicoGreen,, SybergreenSybergreen))
Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
24. 24
ProcProcéédure:dure:
Randrianarivelojosia etRandrianarivelojosia et alal, 2002, 2002
Le Bras & Deloron, 1983Le Bras & Deloron, 1983
Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum (synchronis(synchroniséé))
PrPrééparation de la suspension parasitaire dans du RPSH (200paration de la suspension parasitaire dans du RPSH (200µµll
par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de parasitpar puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de parasitéémie; 1,5%mie; 1,5%
dd’’hhéématocrite; hypoxanthine tritimatocrite; hypoxanthine tritiéée 0,5e 0,5 µµCiCi/puits)/puits)
Incubation 42hIncubation 42h àà 3737°°C (atmosphC (atmosphèère micro are micro aéérophile et humide)rophile et humide)
Evaluation de la radioactivitEvaluation de la radioactivitéé incorporincorporéée et calcul des CI50e et calcul des CI50
Conduite du test isotopiqueConduite du test isotopique in vitroin vitro
25. 25
SchSchéématisation de lmatisation de l’’incorporation de lincorporation de l ’’hypoxanthinehypoxanthine
trititritiéée dans le dans l’’ADN du parasiteADN du parasite
+
Hypoxanthine-3H
ADN plasmodialADN plasmodial
(d(déébut du test)but du test) ADN marquADN marquéé auau
tritiumtritium
26. 26
CompteurCompteur àà scintillation liquide pilotscintillation liquide pilotéé par ordinateurpar ordinateur
. Comptage de la radioactivit. Comptage de la radioactivitéé((cpmcpm))
àà ll ’’aide duaide du MicrobetaMicrobeta
.. Calcul desCalcul des CI50CI50 (concentration(concentration
inhibitrice 50%)inhibitrice 50%)
27. 27
IllustrationIllustration
EvaluationEvaluation de l'activitde l'activitéé antiplasmodialeantiplasmodiale
de plantes malgaches amde plantes malgaches amèères de la famille desres de la famille des
Gentianaceae et des MeliaceaeGentianaceae et des Meliaceae
ThThèèse de Pharmaciese de Pharmacie
LLääetitiaetitia MorinMorin
Le 18 dLe 18 déécembre 2006cembre 2006
28. 28
SSéélection des Planteslection des Plantes àà éétudiertudier
Tachiadenus longiflorusTachiadenus longiflorus
(Gentianaceae)(Gentianaceae)
felampelanafelampelana ouou kifelapelanakifelapelana
( celle qui a de jolies fleurs)( celle qui a de jolies fleurs)
SSéélectionnlectionnéée sur la base dese sur la base des
renseignements ethnobotaniquesrenseignements ethnobotaniques
UtilisUtiliséée contre la fie contre la fièèvre (vre (tazotazo ouou
tazomokatazomoka en malgache)en malgache)
29. 29
PlantesPlantes éétuditudiééeses
Tachiadenus carinatusTachiadenus carinatus
(Gentianaceae)(Gentianaceae)
Elle nElle n’’est pas utilisest pas utiliséée contre lee contre le
«« tazotazo »»
SSéélectionnlectionnéée sur la base de lae sur la base de la
chimiotaxonomiechimiotaxonomie
30. 30
PlantesPlantes éétuditudiééeses
Exacum quinquenerviumExacum quinquenervium
(Gentianaceae)(Gentianaceae)
mamoahelymamoahely ( celle qui fructifie en( celle qui fructifie en
éétant petite)tant petite)
UtilisUtiliséée contre lee contre le «« tazotazo »»
32. 32
Plante antipaludique de rPlante antipaludique de rééfféérencerence
Artemisia annuaArtemisia annua
((AsteraceaeAsteraceae))
Fournie gracieusementFournie gracieusement
par la socipar la sociééttéé BionexxBionexx
33. 33
6 g de mat6 g de matéériel vriel vééggéétal + 40 ml dtal + 40 ml d’’eau distilleau distillééee
EbullitionEbullition pendant 5 minpendant 5 min
Laisser refroidir 1hLaisser refroidir 1h àà temptempéérature ambianterature ambiante
Centrifugations puis filtrationCentrifugations puis filtration
SSééchage dchage d’’1 ml du d1 ml du déécoctcoctéé (estimation quantit(estimation quantitéé de matide matièère)re)
Filtration stFiltration stéérilisante du reste de drilisante du reste de déécoctcoctéé sous hottesous hotte
Dilutions en cascade (6 concentrations dDilutions en cascade (6 concentrations d’’extraits de plantes)extraits de plantes)
PrPrééparation des dparation des déécoctcoctééss
34. 34
Points importants :Points importants :
Entretenir quotidiennement les culturesEntretenir quotidiennement les cultures
Eviter les contaminations (bactEviter les contaminations (bactééries ou champignons)ries ou champignons)
Surveiller les charges parasitairesSurveiller les charges parasitaires
Respecter les bonnes pratiquesRespecter les bonnes pratiques
de laboratoirede laboratoire
Culture continue deCulture continue de Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum
35. 35
Test de sensibilitTest de sensibilitéé sur 2 souches :sur 2 souches :
P. falciparumP. falciparum FCM29FCM29 (r(réésistantsistant àà la chloroquine)la chloroquine)
P. falciparumP. falciparum 3D7 (sensible3D7 (sensible àà la chloroquine)la chloroquine)
MMééthode isotopiquethode isotopique
BasBaséée sur le sur l’’inhibition de linhibition de l’’incorporation de lincorporation de l’’hypoxanthinehypoxanthine trititritiééee
Conditions du testConditions du test
Synchronisation au sorbitolSynchronisation au sorbitol àà 5%5%
Test antiplasmodial in vitroTest antiplasmodial in vitro
36. 36
RRéépartition sur la plaque 96 puitspartition sur la plaque 96 puits
RPMI-1640 glucoséPuits Témoin
T
(extrait aqueux brut)(extrait aqueux brut)(extrait aqueux brut)
Plante A. fruitsPlante A. tigesPlante A. racines
H
TS1S1TS1S1TS1S1G
TS2S2TS2S2TS2S2F
S3S3S3S3S3S3S3S3S3E
S4S4S4S4S4S4S4S4S4D
S5S5S5S5S5S5S5S5S5C
TS6S6TS6S6TS6S6B
A
121110987654321
37. 37
Comptage de la radioactivitComptage de la radioactivitéé
((cpmcpm)) àà ll’’aide du compteuraide du compteur
MicrobetaMicrobeta
Calcul desCalcul des CI50CI50
(concentration inhibitrice(concentration inhibitrice
50%)50%)
Incubation des plaquesIncubation des plaques
pendant 24 hpendant 24 h àà 3737°°C;C;
atmosphatmosphèère humidere humide
microamicroaéérophilerophile
CongCongéélationlation--ddéécongcongéélationlation desdes
plaquesplaques
Collecte des parasites sur filtreCollecte des parasites sur filtre
en fibre de verreen fibre de verre
38. 38
Illustration des résultats de test antiplasmodial
avec les extraits de plantes
Décocté de feuilles de Artemisia annua contre la souche
chloroquinorésistante Plasmodium falciparum FCM29
956613,48
966291,74
937550,87
7317860,43
3537350,22
652080,11
0,0055150*
Inhibition
de croissance de parasite
en 24 h (%)
Moyenne de
radioactivité
(coups/min)
Concentration de l’extrait
(en µg/ml dans le puits)
CI50
39. 39
Inhibition
de croissance de parasite
en 24 h (%)
Moyenne de
radioactivité
(coups/min)
Concentration de l’extrait
(en µg/ml dans le puits)
9414081418,7
872685709,4
676375354,7
3711717177,3
191493888,7
221446444,3
0185570*
Illustration des résultats de test antiplasmodial
avec les extraits de plantes
Décocté d’écorce de tiges de Malleastrum gracile contre la souche
chloroquinorésistante Plasmodium falciparum FCM29
CI50
41. 41
ActivitActivitéé antianti--PlasmodiumPlasmodium des fractions obtenuesdes fractions obtenues
àà partir des extraits aqueux des plantes testpartir des extraits aqueux des plantes testééeses
Parasite utilisParasite utiliséé ::
Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum FCM29 (FCM29 (chloroquinorchloroquinoréésistantsistant))
42. 42
Obtention des fractionsObtention des fractions àà partirpartir
des extraits aqueuxdes extraits aqueux
Culture de
P. falciparum
Test
anti-Plasmodium
DDéécoctcoctééss
Evaluation
de l’activité
antiplasmodiale
extraitsextraits
àà fractionnerfractionner
FractionsFractions
ChromatographieChromatographie
Colonne de chromatographie
Cuve de CCM
43. 43
Front de solvant
Ligne de dépôt
AE/MeOH/H2O
77/15/8Plante X
T A B C D E F
UV à 365nm
UV à 254nm
Acide sulfurique 50%
Regroupement des fractionsRegroupement des fractions mmééthanoliquesthanoliques similaires obtenuessimilaires obtenues àà partir despartir des
extraits aqueuxextraits aqueux
A et B fraction F1
C et D fraction F2
E et F fraction F3
44. 44
2424> 100> 100F2F2--MeOH sans tanninsMeOH sans tannins
2626> 100> 100F2F2--MeOHMeOH
3030> 100> 100F1F1--MeOH sans tanninsMeOH sans tannins
1919> 100> 100F1F1--MeOHMeOH
4949> 100> 100DichloromDichloromééthanethane
3636> 100> 100HexaneHexaneFractionsFractions
504,1504,1 ±± 112.9112.9Extrait aqueux brutExtrait aqueux brut
àà 100100 µµg/ml (%)g/ml (%)((µµg/ml)g/ml)Produits testProduits testééss
Inhibition maximaleInhibition maximaleCI50CI50
ActivitActivitéés antis anti--PlasmodiumPlasmodium des fractions obtenuesdes fractions obtenues àà partir dupartir du
ddéécoctcoctéé de tiges dede tiges de Exacum quinquenerviumExacum quinquenervium
45. 45
Que pouvonsQue pouvons--nous tirer de cettenous tirer de cette éétude ?tude ?
Les extraits des quatre plantes malgaches sLes extraits des quatre plantes malgaches séélectionnlectionnéées etes et
testtestéées nes n’’ont pas dont pas d’’activitactivitéé antiplasmodialeantiplasmodiale
Pourtant les Meliaceae et les Gentianaceae sont aussi connues poPourtant les Meliaceae et les Gentianaceae sont aussi connues pourur
leurs vertus antipaludiques dans dleurs vertus antipaludiques dans d’’autres paysautres pays
KhayaKhaya grandifoliagrandifolia (Meliaceae), utilis(Meliaceae), utiliséée au Cameroune au Cameroun
AzadirachtaAzadirachta indicaindica (Meliaceae)(Meliaceae)
Mais extraction avec des solvants organiques.Mais extraction avec des solvants organiques.
46. 46
Que pouvonsQue pouvons--nous tirer de cettenous tirer de cette éétude ?tude ?
Nos rNos réésultats ne justifient pas lsultats ne justifient pas l’’utilisation des plantesutilisation des plantes
éétuditudiéées pour traiter le paludismees pour traiter le paludisme
«« TazoTazo »» ddéésigne plutôtsigne plutôt «« la fila fièèvrevre »»
Donc ces plantes pourraient soitDonc ces plantes pourraient soit
-- agiragir sur la fisur la fièèvrevre, activit, activitéé antipyrantipyréétiquetique
-- ou agirou agir sur dsur d’’autres pathogautres pathogèènesnes pouvant donner des maladiespouvant donner des maladies
dont les signes cliniques comprennent la fidont les signes cliniques comprennent la fièèvrevre
47. 47
Que pouvonsQue pouvons--nous tirer de cettenous tirer de cette éétude ?tude ?
Pour notre laboratoire d’accueil,
nous avons contribué à
ll’é’établissement de proctablissement de procééduresdures
pour tester les décoctés des plantes
dites « antipaludiques »
Inutile (perte de temps etInutile (perte de temps et
dd’’argent) de fractionner lesargent) de fractionner les
extraits aqueux avec desextraits aqueux avec des CI50>CI50>
1010µµg/mlg/ml
48. 48
CC
HH
II
MM
II
EE
Ethnobotanique,Ethnobotanique,
taxonomietaxonomie
SSéélection de plantelection de plante
Test antiTest anti--PlasmodiumPlasmodium
Test de cytotoxicitTest de cytotoxicitéé in vitroin vitro
Test antipaludiqueTest antipaludique in vivoin vivo (souris)(souris)
Autres modAutres modèèlesles (inhibition de la(inhibition de la
polympolyméérisation de hrisation de héématine, stadematine, stade
hepatiquehepatique……))
PlantesPlantes
BiologieBiologie ((efficacité? Innocuité?)
Chercher des molChercher des moléécules actives = cribler un grand nombrecules actives = cribler un grand nombre
de plantes, criblagede plantes, criblage àà haut dhaut déébit, etbit, et éélargir les testslargir les tests
biologiquesbiologiques
PerspectivesPerspectives ……
50. 50
DDéécouverte de nouveaux mcouverte de nouveaux méédicaments : processus long et cherdicaments : processus long et cher
51. 51
Travaux pratiquesTravaux pratiques
Test de chimiosensibilitTest de chimiosensibilitéé in vitro pourin vitro pour
ll’é’évaluation de la sensibilitvaluation de la sensibilitéé dede PlasmodiumPlasmodium
falciparumfalciparum aux extraits de plantesaux extraits de plantes
Marie Ange Rason, Laetitia Morin, Michel RatsimbasonMarie Ange Rason, Laetitia Morin, Michel Ratsimbason
et Milijaona Randrianarivelojosiaet Milijaona Randrianarivelojosia
Atelier PaludismeAtelier Paludisme –– 5eme5eme ééditiondition
19 F19 Féévrier au 30 Mars 2007vrier au 30 Mars 2007