How to use the Image J for quantification of histological sections such as Oil red O & Hematoxylin staining.

1. Image J を用いた
Oil Red O & Hematoxylin 染色等の
染色像の定量解析
東京理科大学大学院 薬学研究科 薬科学専攻
東京理科大学 総合研究院 戦略的環境次世代健康科学研究基盤センター
小野田 淳人 (3b13624@alumni.tus.ac.jp)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Oil red O Hematoxylin
Areaµm2

2. 組織像の定量解析は、統計的な “違い” を示すためにも
有効な解析手法の一つです
A B
C D
ほんまに？ よぅわからへんなぁ
演 者
聴 衆
D 群は、A 群とC 群に比べて
脂質蓄積量（赤）が増加したんやで
※著作権の関係上、画像は適当なものを使用しています

3. D 群は、A 群とC 群に比べて
脂質蓄積量（赤）が増加したんやで
ほんまや！ よーさん増えとるやんか！
演 者
聴 衆
A B
C D
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
A B C D
Red Areaµm2
組織像の定量解析は、統計的な “違い” を示すためにも
有効な解析手法の一つです
※著作権の関係上、画像は適当なものを使用しています ※著作権の関係上、グラフの数値は適当です
では、どのようにすれば定量化ができるのか、Image Jを例に見ていきましょう。

4. 染色像の定量化までの流れ
I. Image J の基礎（参考資料）
II. Scale の単位変換
III. 三原色の分離： Split Channels
IV. 赤色の輝度から青色の輝度を引く
V. 測定領域の指定：閾値の決定
VI. 測定領域の定量化
今回は Hematoxylin による核染色を施した Oil Red O 染色を例に
2色ある染色像の定量方法を述べていきます。
また、単染色法や免疫蛍光法などの画像を定量解析する際にも、
同様の手法を適用することができます。

5. Image J の基礎：他力本願
http://www.slideshare.net/nmaro/imagej20116
バイオイメージング研究のためのImage J によるデジタル画像解析入門
朽津 夏麿（東京大学大学院）
http://seesaawiki.jp/w/imagej/d/ImageJ%A5%DE%A5%CB%A5
%E5%A5%A2%A5%EB%A1%A7%A5%C1%A5%E5%A1%BC%A5
%C8%A5%EA%A5%A2%A5%EB%A4%C8%BC%C2%CE%E3
Image J マニュアル：チュートリアルと実例
インストールから実例まで、これらの資料を読めば、
たいていのことはできるようになります。

6. Image J の基礎：組織解析の注意点
組織切片における定量評価では、
絶対的な定量値にさほどの価値はありません。
大切なのは、対照群との比較解析です。
比較解析では、
染色効率が各切片で同一であることを前提にして成り立ちます。
そのため、
① 組織固定の不十分など、変性による artifact がない切片
② 染色態度を左右する固定時間、切片厚等が同一である切片
③ 基本的に、同一試薬を用いて、同じ操作で、同時に染色した切片
④ 同じ設定の同じ顕微鏡で撮影した画像*
*③を満たしている場合に限る
これらの条件を満たしていることが、
染色像の定量解析には必須となります。

7. Scale の単位変換
最終的に定量化するときは、基本的に『m』単位を用いますが、
Image J の初期設定では『pixel』になっています。
Image J の初期設定

8. Scale の単位変換
１．Image J を起動
起動直後の画面→
２．”File” → “Open” を選択し、解析対象の画像を開く
３．虫眼鏡のマークを選び、
画像を拡大する

9. Scale の単位変換
４．Straight line selections
を選択する
５．画像のスケールバーに合わせて、線を引く（黄色）
６．”Analyze” → “Measure” をクリックするとResultsウィンドウが出てくる
７．この場合、50 µmが
293.750 pixelである
ことを示している。

10. Scale の単位変換
８．”Analyze” → “Set Scale” をクリックするとSet Scaleウィンドウが出る
９．Distance in pixels に先ほど測定したpixel数を、
Known distance にスケールバーの長さを、
Unit of length にスケールバーの単位を入力する
１０．OKをクリックして、
Scaleの単位設定を終了する
※この時の値（○○ pixels/µm など）を
メモしておくと、後で楽になる

11. 三原色の分離： Split Channels
１１．再度、解析対象の同じ画像を開きなおす
１２．”Image” → “Color” → “Split Channels” を選択
１３．Red, Green, Blue に分かれた3つの画像が表示される
Red Green Blue初期画像
例えばRedの画像なら、赤の色調（波長）を多く含むところほど輝度が高く、
赤の色調（波長）が少ないところほど輝度が低く示される
低 高
まず、各色の輝度を抽出するために、色の分離を行います。

12. 赤色の輝度から青色の輝度を引く
１４．今回用いた Oil red O & Hematoxylin 染色は、
赤色と青色の色調が強いため、
Redの画像とBlueの画像を残す
１５．”Process” → “Image Caluculator” を
クリックして開く
１６．Redの画像からBlueの画像が
減算（Subtract）されるように設定する
１７．OKをクリックすると
赤の波長の強いところが白色になり、
それ以外は黒色になった画像が入手できる
（場合によっては、さらに Green を減算することもある）
Red - Blue
１８．”File” → “Save as” で
任意のフォルダに保存する
定量したい色の輝度から不要な色の輝度を減算します。

13. 赤色の輝度から青色の輝度を引く：簡単な原理
Blue
Red
Red-Blue
初期画像
Split
Subtract
赤（Oil red O）
青（Hematoxylin）
白（血管腔）
赤の波長が強い赤色と白色の輝度が高い
青の波長が強い青色と白色の輝度が高い
赤の輝度大ー青の輝度小＝
輝度大（白で示される）
赤の輝度小ー青の輝度大＝
輝度は負の値（黒）
赤の輝度大ー青の輝度大＝
輝度小（黒）
赤の輝度ー青の輝度＝
減算後の輝度
結果的に、減算後の画像では赤色の部分だけが高い輝度（白色）で示される

14. 測定領域の指定：閾値の設定
１９．減算によって得られた画像を開く
２０．”Image” → “Adjust” → “Threshold”を
クリックして開く
２１．閾値となる値を設定する（次スライド参照）
※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて
同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。
２２．値を決定した後、
Applyをクリックして適用する。
２３． ”File” → “Save as” で
任意のフォルダに保存する
※この画像は
手法を示す際に、もとの画像と比較して
論文に使用されることが多い
数値化する領域を決定するために閾値を定めます。

15. 測定領域の指定：閾値の決定
２１．閾値となる値を設定する
※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて
同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。
10 25 40

16. 測定領域の指定：閾値の決定
２１．閾値となる値を設定する
※比較解析をするためには、この値を定量する全てのFigにおいて
同一にしなければならない。値はもとの画像と比較して熟考する。
重ね合わせた結果、25-255の値が実際の Oil Red O 陽性脂肪滴に近いため、
この画像をもとに定量することができる。この実験系の全ての画像に対して
25-255を適用しなければ、適切な比較解析はできない。

17. 測定領域の定量化
２４．再び、減算後の画像を開く
※ “Threshold” 後の画像を
利用してもよいが、使いにくい
２５．再び ”Image” → “Adjust” → “Threshold”を
クリックしてThresholdを開く
２６．決定した閾値を入力する
２７．指定した部分が赤くなる
２８． ”Analyze” → “Set Scale” を開いて
スケールを確認する
※場合によっては、
最初にメモした値を入力し直す
指定した領域を定量化します。

18. 測定領域の定量化
２９． ”Analyze” → “Set Measurement” を
クリックして、測定項目と範囲を選択する
３０．まずは、画像全体の面積を測定するため、
“Area” のみにチェックを入れる
３１． ”Analyze” → “Measure” をクリックすると
指定した範囲の面積が示される
※この場合は画像全体の面積が示される

19. 測定領域の定量化
３２． ”Analyze” → “Set Measurement” を
クリックして、測定項目と範囲を選択する
３３．指定した領域の面積を測定するため、
“Area” と ” Limit to Threshold” に
チェックを入れる
３４． ”Analyze” → “Measure” をクリックすると
指定した範囲の面積が示される
※この場合は指定した領域（赤い部分）の
面積が示される
３５．研究内容に応じて、定量値をそのまま、
あるいは面積比を算出して用いる。

20. ちなみに：各閾値の場合の定量値
10 25 40
22074.669 12056.887 6793.291
同じ画像からでも閾値に応じて異なる結果が得られるので、
細心の注意をはらって閾値を決定する

21. 測定領域の定量化
３６．Resultsのウィンドウを消去する際に保存するか問われるため
“Yes” を選択する
３７．保存されるファイルは .xls 形式なのでエクセルとして使用可能
３８．得られた数値をもとにFigure、あるいはTableを作成し、
論文に用いる
３９．Accept される

22. おわりに
今回は Hematoxylin による核染色を施した Oil Red O 染色を例に
2色ある染色像の定量方法を述べましたが、
単染色法や免疫蛍光法などの画像を定量解析する際にも、
同じ手法を適用することができます。
また、
3種以上の色が存在する場合、
黄色や緑、茶色等、原色から遠い色を定量化する場合など、
条件が厳しい画像の際、Image J による定量化の前に
Photoshop を用いて画像編集を施すことで
定量化が可能になる場合があります。
そちらの方は、またの機会にお話しできればと思います。
何か、ご質問等のある方はこちらまで連絡を下さい。
→ 3b13624@alumni.tus.ac.jp