CRISPR-CAS bakteereissa ja geenitekniikassa.

1. 9.2.13. CRISPR-CAS (CRISPR = Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats)
Ymmärtääksesi tässä esille tulevat asiat sinun tulisi valmiiksi osata restriktioentsyymien,
geenikoettimien, käänteistranskriptaasin ja RNA-interferenssin (RNAi) käyttötapa.
RNA-interferenssi on syytä osata siksi, että CRISPR-CAS on ikään kuin bakteereiden näkemys
RNA-interferenssistä.
CRISPR-CAS on bakteereille ja arkeille ominainen puolustusjärjestelmä viruksia vastaan. Aluksi
käymme läpi joukon aiheeseen liittyviä alakäsitteitä. Sitten katsomme yksityiskohtaisemmin,
miten -järjestelmä toimii bakteereissa. Näiden jälkeen luomme yhteenvedon siitä, miten
CRISPR-CAS-puolustusjärjestelmää hyödynnetään geenitekniikan tutkimusvälineenä.
CRISPR
CRISPR on geenisekvenssi bakteerin DNA:ssa. Se sisältää toisaalta tasaisin välimatkoin
sijaitsevia palindromisia toistojaksoja (repeats), mutta myös niiden välisiä monimuotoisempia
välikejaksoja (spacers). Seuraavaksi esittelen kummatkin näistä erikseen.
Palindromiset toistojaksot (repeats)
SAIPPUAKAUPPIAS on palindromi, sillä se tuottaa saman sanan myös takaperin luettuna.
Genetiikassa palindromisia eivät ole samat, vaan toistensa kanssa pariutumiskykyiset
emäsjaksot, jotka sijaitsevat samassa DNA-juosteessa, joskus kaukanakin toisistaan. Jakson
alussa olevan emäsjärjestyksen on oltava ”peilikuva” jakson peräpäässä olevasta
emäsjärjestyksestä. Esimerkiksi emäsjärjestys ACAATGTTGCGGTCCATTGT on
palindrominen (sinisellä merkityt emäsjärjestykset ovat toistensa kanssa pariutumiskykyisiä
emäsjärjestyksiä).
Palindromiset geenisekvenssit tulevat genetiikassa vastaan muuallakin. Esimerkiksi kolmiapilan
muotoon taipuvissa siirtäjä-RNA-molekyyleissä on palindromisia jaksoja silmukoiden alku- ja
loppukohdassa. Samoin aitotumallisten solujen geeneissä esiintyvien introni-jaksojen alussa ja
lopussa on toisiinsa sopivat palindromiset emäsjärjestykset. Näiden kohdalta snörpit (snRNA)
osaavat katkaista ja poistaa intronit.
Välikkeet (spacers)
Välikkeet (spacers) ovat CAS-proteiinin pilkkomia muutaman kymmenen nukleotidin mittaisia
DNA-jaksoja, jotka bakteeri on alunperin irrottanut viruksista ja liittänyt ne sitten oman
genominsa osiksi. Geenisekvenssistä, johon välikkeet liitetään, käytetään nimitystä CRISPR
(kuva 73). CRISPR-sekvenssi on bakteerin genomissa jakso, jossa välikkeet ja palindromiset
toistojaksot vuorottelevat.
CAS on proteiini, joka toimii endonukleaasina
CAS on proteiinirakenteinen endonukleaasi, joka katkoo nukleiinihappoja (DNA ja RNA) solun
sisällä (siitä sanan alku: endo-). Tässä mielessä se muistuttaa restriktioentsyymejä, jotka nekin

2. ovat bakteereissa esiintyviä endonukleaaseja. Yhteistä on myös se, että sekä CAS että
restriktioentsyymit ovat bakteereiden puolustautumiskeinoja bakteeriofageiksi kutsuttuja viruksia
vastaan.
CAS-proteiineja tunnetaan useita erilaisia: esim. CAS9-pilkkoo kaksijuosteista DNA:ta, CAS13
yksijuosteista RNA:ta, CAS14 puolestaan yksijuosteista DNA:ta. Eri bakteerilajeissa esiintyy
hieman toisistaan poikkeavia CAS-proteiineja.
Uuden virusperäisen DNA:n liittäminen CRISPR-sekvenssiin (kuva 73)
Kuva 73 esittää virusinfektion etenemistä bakteerisolussa, johon kyseinen virustyyppi on
asettumassa ensimmäistä kertaa. Kyseinen virus on siis bakteerille tuntematon. Tässä
tapahtumat etenemisjärjestyksessä.
a. Bakteeri tuottaa CAS1-nimistä endonukleaasia (kuvassa kohta 3). Tämä proteiini
katkoo nukleiinihappoja, siis DNA:ta tai RNA:ta.
b. Kun bakteeriin tulee viruksen DNA:ta, CAS1 pilkkoo sen lyhyiksi pätkiksi (kuvassa
73 kohdat 1, 2 ja 3). CAS1 tunnistaa nämä, sillä virus-DNA:ssa esiintyy tiettyjä,
juuri viruksille ominaisia emäsjärjestyksiä ns. PAM-sekvenssejä.
c. CAS1 toimii yhteistyössä CAS2-proteiinin kanssa. CAS2 istuttaa CAS1:n
tuottamat lyhyet virusgenomijaksot bakteerin CRISPR-sekvenssiin. Tällöin
bakteeri "muistaa" infektion ja voi myöhemmin puolustautua sitä vastaan. CAS1 ja
CAS2 toimivat bakteereissa dimeerinä, toisin sanoen toisiinsa liittyneinä. (Samaan
tapaan dimeerinä toimivat soluissa vaikkapa ribosomin isompi ja pienempi
puolikas. Myös monet aitotumallisille soluille ominaiset transkriptiofaktorit ovat
kaksiosaisia dimeerejä.)

4. Mitä ovat tracr-RNA (trans-activating CRISPR-RNA), CAS9, pre-crRNA (pre-CRISPR-RNA),
crRNA (CRISPR-RNA) sekä sgRNA (single stranded guide-RNA) (kuva 74)?
Bakteereissa CRISPR-CAS-koneisto edellyttää kolmen eri geenin samanaikaista toimintaa.
Menetelmää käsittelevässä keskustelussa näiden geenien tuottamat molekyylit tulevat usein
esille. Siksi ne on tarpeen tässä yhteydessä selittää, vaikka solubiologisessa tutkimuksessa osa
bakteereissa toteutuvista geenitoiminnoista voidaankin ohittaa.
Tällaisia molekyylejä ja niitä koodaavia geenejä ovat tracr-RNA, pre-crRNA sekä CAS9. Lisäksi
kuvan 74 selitetekstissä esiintyvät käsitteet crRNA ja sgRNA.
Tracr-RNA ja pre-crRNA-geeni tuottavat pelkkiä RNA-molekyylejä. Näiden geenien koodaamat
RNA-molekyylit eivät siis etene translaatioon asti, joten ne eivät koodaa proteiinirakenteita.
CAS9-geeni sen sijaan tuottaa asianomaisen proteiinin CAS9. CAS9-proteiini ei pysty virusten
torjuntaan sellaisenaan, vaan sen aktivoimiseen tarvitaan samanaikaisesti kahta edellä
mainittua RNA-molekyylityyppiä: tracr- (=Trans-Activating-CRISPR-RNA) ja crRNA (=CRISPR-
RNA). crRNA syntyy pre-crRNA-molekyylin pilkkoutuessa lyhyemmiksi jaksoiksi.
Tutkijat pystyvät valmistamaan tracr- ja crRNA-molekyylien yhdistelmiä. Näitä kutsutaan nimellä
opas-RNA (sgRNA = single stranded guide-RNA). sgRNA aktivoi CAS9-proteiinin kiinnittymällä
siihen. SgRNA:ssa oleva geenikoetin voidaan muokata emäsjärjestykseltään sellaiseksi, että se
tunnistaa tutkijoiden haluamia DNA-jaksoja.
CRISPR-CAS-geenistön toiminta bakteerille jo ennestään tuttujen viruksien torjunnassa
(kuva 74)
Koska CRISPR-CAS-toimintoihin osallistuvat geenit toimivat bakteerissa samanaikaisesti, alla
olevassa kuvassa 74 esiintyvät numerot eivät suoranaisesti kuvaa toimintojen
tapahtumisjärjestystä. Siksi seuraavassa on tiivis, etenemisjärjestystä paremmin ilmentävä
yhteenveto kuvan 74 tapahtumista (selitykset myös kuvassa).
1. Aluksi bakteeri tuottaa CRISPR-sekvenssistään (kohta 10) koko sekvenssin mittaisia
pitkiä pre-crRNA-molekyylejä (kohdat 3 ja 4).
2. Samanaikaisesti CAS9-proteiinia (kohta 6) koodaava geeni (kohta 5) tuottaa CAS9-
proteiinia.
3. Myös tracr-RNA:ta (kohta 8) koodaava geeni (kohta 7) transkriptoituu hiuspinniä
muistuttavaksi RNA-molekyyliksi.
Se sisältää pre-crRNA-molekyylissä esiintyvien palindromisten (kohta 1) jaksojen
peilikuvia. Lisäksi tracr-RNA:ssa on jaksoja, joiden avulla se kiinnittyy CAS9-proteiinin
poimuihin toimien samalla CAS9-molekyylin aktivaattorina (kohta 9) (tracr-RNA on
lyhenne sanoista trans activating crRNA).
4. Toisiinsa liittyneinä tracr-RNA ja CAS9 katkovat pitkän pre-crRNA-molekyylin lyhyiksi
crRNA-molekyyleiksi (kohdat 2, 9 ja 11) palindromijaksojen osoittamista kohdista (crRNA
tulee sanoista CRISPR-RNA).

5. 5. Valmiit crRNA-molekyylit liittyvät CAS9-molekyyliin (kohta 11). Niiden sisältämä
emäsjärjestys toimii 20 nukleotidin mittaisena geenikoettimena (kohta 12). Tämä pystyy
tarvittaessa tunnistamaan virusgenomissa olevan komplementaarisen emäsjärjestyksen
ja kiinnittymään siihen (kohdat 11, 12 ja 13).
6. Jos tällaisia emäsjärjestyksiä sisältävä virus-DNA-jakso ilmestyy bakteerisoluun, CAS9
kiinnittyy tähän, pilkkoo viruksen DNA:n toimimattomaksi ja estää viruksen lisääntymisen.
7. Tutkijoiden valmistamia crRNA-molekyylejä kutsutaan nimellä opas-RNA (sgRNA =
single stranded guide-RNA). Opas-RNA-molekyylissä molemmat bakteereissa esiintyvät
RNA-jaksot (tracr- ja crRNA) ovat yhtenä yhtenäisenä RNA-molekyylinä. Tämä pystyy
sekä kiinnittymään CAS9-proteiiniin että toimimaan ohjelmoitavana geenikoettimena.
sgRNA:n emäsjärjestys voidaan nimittäin muokata tunnistamaan haluttuja DNA-jaksoja.

7. Mihin bakteeri tarvitsee CRISPR-sekvenssin tuottamia geenikoettimia, jos kerran jo CAS-
proteiinitkin toimivat restriktioentsyymien tapaan?
Kun virus infektoi bakteerin, on torjunnan tapahduttava nopeasti. Usein käykin niin, että jotkin
virusyksilöt onnistuvat ohittamaan CAS-proteiinit ja ehtivät jo istuttamaan oman genominsa
bakteerigenomin osaksi.
Virusgenomin toimiessa solulimaan alkaa pursuta virukselle ominaisia lähetti-RNA-molekyylejä.
Mutta, jos CRISPR-lokus tuottaakin crRNA-molekyylejä, joissa on viruksen lähetti-RNA-
molekyyleihin nähden komplementaarinen emäsjärjestys, tuloksena on RNA-interferenssi.
crRNA vaientaa viruksen tuottamat lähetti-RNA-molekyylit tarttumalla emäksillään niihin ja
infektio pysähtyy tähän.
CRISPR-CAS-järjestelmässä on toinenkin olennainen etu restriktioentsyymeihin verrattuna.
Restriktioentsyymit ovat proteiineja. Niistä syntyy uusia muotoja vain, jos niiden rakennetta
koodaavissa geeneissä tapahtuu mutaatioita. Mutaatiopohjainen tuotekehittely on hidasta
onnenkauppaa.
CRISPR-CAS sen sijaan pysyy aina ajan tasalla alati muuttuvassa virusekosysteemissä.
Ratkaiseva toimija on crRNA:ssa oleva emässekvenssi, jolloin proteiinirakenteen muutoksia ei
tarvita.
Bakteerin jakautuessa CRISPR-CAS-geenistö siirtyy myös bakteerin jälkeläisille. Siksipä niillä jo
syntyessään on käytettävissään ”kaiken kokeneiden” esi-isiensä hankkima geneettinen
immunologinen muisti.
PAM-sekvenssi?
CRISPR-CAS-asioissa vastaasi tulee ennen pitkää kirjainyhdistelmä PAM.
PAM on lyhenne sanoista Proto-spacer Adjacent Motif (= spacerin esimuodon vieressä oleva
emäsjärjestys). Se on lyhyt, yleensä kolmen emäksen mittainen, sekvenssi, joka esiintyy
virusgenomissa, mutta sitä ei esiinny bakteerin omassa DNA:ssa.
CAS2 havaitsee virusgenomin nimenomaan PAM-sekvenssien perusteella. Lisäksi, CRISPR-
sekvenssiin istutettavat SPACER-jaksot leikataan irti tarkalleen PAM-sekvenssin edestä. Ennen
istuttamista niitä kutsutaan proto-spacereiksi. PAM-sekvenssiä niihin ei kelpuuteta mukaan.
PAM-sekvenssiä ei esiinny bakteerin omassa geneettisessä koodissa missään, eikä sen
CRISPR-lokuksessakaan. Jos esiintyisi, CAS-proteiinit pilkkoisivat virusten lisäksi myös
bakteerin omaa DNA:ta. PAM:in perusteella bakteeri tietää PAMauttaa nenuun juuri
virusgenomia, ei vahingossakaan omaansa.
CRISPR-CAS-menetelmät geenitekniikassa (Vertaa näitäkin kuvaan 74)
CRISPR-CAS on tämän hetken merkittävin geenitekniikan tutkimusmenetelmä. Menetelmässä
on paljon yhtäläisyyksiä restriktioentsyymien, geenikoettimien ja RNA-interferenssin kanssa.
Erilaisia CAS-proteiineja tuotetaan nykyisin teollisesti ja niitä voidaan mikroinjektiona lorauttaa
myös aitotumallisiin soluihin. crRNA:n tilalle voidaan tällöin tuottaa opas-RNA-jakso. Tällaista
ihmisen valmistamaa opas-RNA-sekvenssiä merkitään sgRNA (enkuksi single stranded guide
RNA).
Opas-RNA:n avulla CAS9 päätyy kohdesolun DNA:ssa sellaisen sekvenssin luo, jossa on opas-
RNA:han sopiva emäsjärjestys (RNA-DNA-pariutumissännön mukaan). CAS katkaisee
vastaanottavan DNA:n kyseiseltä kohdalta. Lisäehtona on tähän asti ollut, että myös sopiva

8. PAM-sekvenssi osuu tuolle kohdalle. (Keväällä 2020 uutisoitiin tutkijaryhmästä, joka on
onnistunut kehittämään CAS-proteiinista myös sellaisen muodon, joka toimii lähes täysin ilman
PAM-sekvenssin asettamia rajoituksia (Near PAMless CAS). Pelkkä gRNA riittää tässä
ohjaamaan CAS-proteiinin oikeaan kohtaan kohdesolun genomissa.)
CAS tuottaa DNA:n katkaisukohtaan tylpän pään. Tylppä kohta syntyy, kun DNA-
kaksoisjuosteen molemmat puolikkaat katkeavat saman nukleotidiparin kohdalta.
Tylpät vauriot tarkoittavat sitä, että kromosomin jokin käsivarsi on kokonaan poikki. Tällöin solu
on vaarassa hukata kerralla suuren määrän geenejään. Tällainen mutaatio on solulle erityisen
vaarallinen.
Ligaasi 4 niminen DNA:ta korjaava proteiini on erikoistunut korjaamaan juuri tällaisia vaurioita.
Yleensä ligaasi 4 toiminnan tuloksena joitakin nukleotidejä kuitenkin katoaa. Koska geenin koko
lukukehys muuttuu silloin virheelliseksi, geeni ei enää tuota toimivaa proteiinirakennetta.
Tuloksena on knock out –geeni (vaiennettu geeni).
Knock out -geenien avulla voidaan tutkia, millainen merkitys jonkin geenin toiminnalla /
puuttumisella on solulle tai eliölajille.
Jos ligaasi 4 toiminta estetään ja soluun lisätään DNA-jaksoja, joiden molemmissa päissä on
katkaisukohdan molempiin puoliin sopivat lyhyetkin komplementaariset DNA-jaksot (kutsutaan
myös homologisiksi jaksoiksi), katkaisupaikkaan saadaan helposti ”napsahtamaan” siirtogeeni
tai muu haluttu DNA-jakso.
CRISPR-CAS-menetelmä on geenisiirtojen ja knock out -geenitekniikan yleisin työkalu.
Menetelmän kehittivät Jennifer Doudna Berkleyn yliopistosta ja Max Planck –instituutissa
työskentelevä Emmanuelle Charpentier.
CRISPR- CAS9-menetelmän muita käyttötapoja
CAS-proteiinista on kehitetty myös muunnoksia, joista on poistettu sen kyky katkaista DNA:ta.
Tällaisia CAS-proteiineja kutsutaan kuolleiksi ja merkitään dCAS (dead CAS).
dCAS-proteiiniin voidaan liittää transkriptiofaktoreita joko suoraan CAS:iin tai pienen linkkerin
(siis suorahkon aminohappoketjun) päähän roikkumaan. Näin opas-RNA johdattaa
transkriptiofaktorit haluttuihin geeneihin, jolloin niiden toimintaa voidaan säädellä halutulla
tavalla.
CAS:iin voidaan myös liittää valoa hohtavia proteiineja (Green Fluorescent Protein GFP), jolloin
nähdään, missä solun tai tuman osassa tietty geeni toimii.
Deaminaasi on entsyymi, joka vaihtaa DNA:n emäksiä toisiksi. Jos deaminaasi liitetään CAS:iin,
voidaan geenien emäsjärjestystä muuttaa sgRNA:han ohjelmoiduista kohdista. Geeneihin
voidaan myös lisätä kolmen emäksen mittaisia STOP-merkkejä kohtiin, joissa niitä ei
luonnostaan sijaitsisi.
CAS yhdistettynä käänteistranskriptaasiin = Prime editing (Prime-muokkaus)
Käänteistranskriptaasi on retroviruksille ominainen proteiini, joka tekee transkription väärin päin,
muodostaen RNA-molekyylistä sitä vastaavan DNA-molekyylin.
Kaupalliseen levitykseen on tuotettu yhdistelmägeeni, joka koodaa sekä CAS- että
käänteistranskriptaasiproteiinia. Yhdistelmäproteiini paitsi löytää halutun katkaisukohdan
muokattavasta DNA-jaksosta myös saman tien taikoo opas-RNA:n sisältämän emäsjärjestyksen

9. DNA-molekyyliksi katkaisupaikan kohdalle. Siksi soluun ei lainkaan tarvitse injektoida
siirtogeenisiä DNA-jaksoja. Melkoisen kätevää!
Tämä Prime editing niminen menetelmä mahdollistaa perinnöllisten sairauksien hoidon
yksinkertaisesti niin, että opas-RNA:han valitaan terveen geenin mukainen emäsjärjestys. Kovin
pitkien DNA-jaksojen muokkaamiseen tämä menetelmä ei sovellu, sillä opas-RNA on vain 20
nukleotidin mittainen. Onneksi useimmat perinnölliset sairaudet ovat yhden tai muutaman
nukleotidin mittaisia mutaatioita. Tyypillinen esimerkki yhden emäksen pistemutaatiosta on
sirppisoluanemia.
Prime-muokkauksen kehittivät Harvardin yliopistossa ja MIT:ssä David Liu ja Andrew Anzalone
tutkimusryhmineen.
Geeniajurit (=Gene drives)
Tavallisessa CRISPR-CAS9-tekniikassa siirtogeenisiä soluja tuotetaan mikroinjektoimalla
CAS9-proteiinia, sgRNA:ta sekä siirtogeenin kopioita kohdesoluun. Injektiossa siirretään siis
erikseen kolmenlaisia molekyylejä: proteiinia, RNA:ta ja DNA:ta.
Geenisiirron vaikutuksia seurataan usein vain yhdessä solussa. Tai, jos kyseessä on munasolu,
joka seuraavaksi hedelmöitetään, saattavat siinä esiintyvät siirtogeenit kopioitua alkion
muihinkin soluihin alkionkehityksen aikana.
Geeniajuriksi kutsutaan sellaista CRISPR-CAS9-mikroinjektiota, joka koostuu pelkästä
DNA:sta. Tässä DNA-jaksossa, ns. kasetissa, on CAS-proteiinia, sgRNA:ta ja siirtogeeniä
koodaava yhdistelmägeeni.
Näin soluun siirtyy kokonainen geneettinen järjestelmä, jolla on kyky ketjureaktion tavoin
istuttaa itsensä kohdekromosomiin, itsekopioitua tästä kromosomista uusiin
kohdekromosomeihin ja saada sama siirtymisen ja kopioitumisen kehä jatkumaan loputtomiin
myös siirtogeenisen yksilön jälkeläisissä.
Geeniajurissa voi olla esimerkiksi geeni, joka estää Anopheles-hyttysen hajuaistin kehittymisen.
Kun geeniajurilla varustettu yksilö parittelee luonnonvaraisen hyttysen kanssa, jälkeläinen saa
kyseisestä vastinkromosomista yhden kappaleen geenimuunnellulta emoltaan, toisen taas
luonnonvaraiselta hyttyseltä. Näin jälkeläisestä tulee heterotsygootti geeniajurin suhteen.
Kuitenkin, kun geeniajuri alkaa toimia, CAS9-proteiini ja luonnonvaraiseen geenimuotoon
sopiva opas-RNA löytävät toisensa. Opas-RNA johdattaa CAS9-proteiinin kyseiselle kohdalle
luonnonvaraiselta hyttyseltä peräisin olevassa luonnonvaraisessa vastinkromosomissa, jolloin
CAS9 katkaisee tämänkin kromosomin.
Geeniajurissa on mukana myös koodijakso, jolla solu saadaan korjaamaan katkaistu kromosomi
käyttäen mallina kasettia itseään. Näin muuntogeenin siirtokoneisto, mukanaan hajuaistin
kehittymisen estävä geeni, asettuvat toiseenkin vastinkromosomiin. Samalla heterotsygoottinen
genotyyppi muuttuu homotsygoottiseksi.
Aina, kun tällainen hyttynen tekee jälkeläisiä, niissä toteutuu sama kehityskulku. Siksi hajuaistin
tuhoava geeniversio leviää kaikkiin populaation jälkeläisiin nopeasti ja homotsygoottisesti
eivätkä hyttyset enää löydä ihmisiä veriateriansa lähteiksi. Malariatartunnat saadaan
vähenemään ilman, että kalojen, sammakkoeläinten, lintujen ja lepakoiden merkittävänä
ravinnonlähteenä toimivat hyttyset kuitenkaan katoavat luonnon ekosysteemeistä.