Uuden sukupolven sekvenssointi. Tästä käytetään nimityksiä Next Generation Sequencing (NGS) ja Massive Parallel Sequencing (MPS).

1. Massive Parallel Sequencing eli Next Generation
Sequencing (NGS)
Jotta voit ymmärtää NGS-sekvenssointimenetelmän, sinun
tulee etukäteen osata seuraavat asiat: restriktioentsyymi, nukleotidi,
emästen pariutumissäännöt, geenikoetin, dideoksynukleotidi (=dd-
nukleotidi), GFP, 3 ́-5 ́-suunta, PCR, epäsymmetrinen PCR, ssDNA,
rinnakkaissekvenssointi, Sanger-menetelmä.
Brittiläiset professorit Shankar Balasubramanian ja David Klenerman saivat vuoden
2020 Millennium-teknologiapalkinnon, miljoona euroa, NGS-sekvenssointimenetelmän
kehittämisestä.
Tässä linkki Helsingin sanomien artikkeliin:
https://www.hs.fi/tiede/art-2000007970787.html
Tässä linkki aihetta käsittelevään videoon: https://youtu.be/shoje_9IYWc
NGS:ssä on seuraavat päävaiheet:
1. Kokonais-DNA:n pilkotaan restriktioentsyymillä.
2. DNA-pilkkeitä monistetaan tavallisella PCR:llä.
3. PCR-ajo toistetaan geenisirulla.
4. Lopuksi geenisirulla tehtävässä PCR-ajossa käytetään fosforyloivia dd-nukleotideja,
jolloin emäsjärjestykset eri geenikoetintäplien kohdalta voidaan lukea
tietokoneavusteisesti.
5. Vaiheet 1 - 4 toistetaan muillakin restriktioentsyymeillä.
6. Eri geenisirujen tuottamat aineistot rinnakkaissekvenssoidaan tietokoneella.
NGS aloitetaan tavallisella PCR:llä
1) Aluksi kokonais-DNA pilkotaan jollakin restriktioentsyymillä lyhyemmiksi DNA-
jaksoiksi. Koska restriktioentsyymi katkaisee DNA:n kaikista niistä kohdista, mistä se
löytää katkaisukohdaksi sopivan emäsjärjestyksen, tuloksena on valtava määrä eri
mittaisia DNA-jaksoja.
Jokainen lyhyt jakso alkaa ja/tai päättyy emäsjärjestykseen, jonka kyseinen
restriktioentsyymi tunnistaa. Näin koeputkeen osataan lisätä katkaisukohtiin
sopivat praimerit.
2) Nyt DNA-jaksoja monistetaan PCR:llä niin, että on, ”millä mällätä”. Kaikki
erikokoiset DNA-silput monistuvat samanaikaisesti samassa koeputkessa.
3) PCR pysäytetään kuumaan vaiheeseen, jolloin DNA on yksijuosteista.
PCR:ää jatketaan geenisirun pinnalla:

2. Geenisirulla on geenikoettimia tarkkarajaisina täplämäisinä rykelminä. Koettimina
on käytettävä kyseisen restriktioentsyymin katkaisusekvenssiä. Katkaisusekvenssi voisi
olla vaikka seuraava:
3´ TAAC 5´ TACCGGTATGCTCA….
5´ ATTG 3´ ATGGCCATACGAGT….
Koettimena toimii vain se 5´- 3´-suuntainen sekvenssi, jonka 5´-pää restriktioentsyymin
käytön jälkeen jää osoittamaan kohti katkaisukohtaa. Tässä se olisi alemman juosteen
5´ ATTG 3´. Koettimet kestävöidään geenisirulle siten, että niiden 3´-pää osoittaa lasilta
ulospäin.
VAIHE 1
Kun geenisiru upotetaan sekvenssoitavaa 1-juosteista DNA:ta sisältävään liuokseen,
DNA-juosteet kiinnittyvät sirulla oleviin koettimiin emäspariperiaatteen mukaisesti.
5´ ATTG 3´-koettimiin voivat kiinnittyä vain ylemmän juosteen mukaiset emäsjärjestykset:
3´ TAAC 5´ TACCGGTATGCTCA….. Ne kiinnittyvät koettimiin siten, että niiden 5´- pää
osoittaa lasilta ulospäin. Pariutumattomia juosteita ei tarvita, joten ne huljutellaan lasilta
pois.
Upottaminen tehdään sen verran laimennettuun liuokseen, että DNA-jaksoja kiinnittyy
sirulla oleviin koettimiin mieluiten korkeintaan yksi kutakin täplämäistä
geenikoetinrykelmää kohti.
VAIHE 2

3. Kun yksijuosteiset DNA-jaksot ovat emäspariutuneet omiin koettimiinsa, geenikoettimet
toimivat praimereina. Näin PCR:ää voidaan jatkaa geenisirun pinnalla. Ainoa ero
tavalliseen PCR:ään nähden on, että praimeri on kiinni lasilevyssä.
VAIHE 3
PCR-kopioinnin tuloksena syntyy sirun pinnalta sojottava kaksijuosteinen DNA-jakso,
joka kuuman vaiheen aikana avautuu 1-juosteiseksi. Uusi DNA-juoste on lasilla niin,
että sen 3 ́-pää sojottaa ulospäin vapaana.
VAIHE 4
Seuraavalla PCR-kierroksella nämä 3 ́- päät taipuvat nyt vuorostaan vähän niin
kuin mittarimadot kohti lasilla olevia koettimia kiinnittyen niihin emäspariperiaatteen
mukaisesti.

4. VAIHEET 5-7
Taas koettimet toimivat praimereina. PCR:n tuloksena syntyy kaksijuosteinen DNA-
molekyyli, toistuu kuuma vaihe, jolloin vapaat 3´-päät pariutuvat geenikoettimiin jne.

5. VAIHEET 8 JA 9
Joka kierroksella syntyy yksi uusi kopio edellisellä kierroksella tuotetusta kopiosta.
Nyt on tärkeätä tiedostaa, että emäsjärjestystensä osalta uudet kopiot ovat aina
edellisen kierroksen negatiiveja.
Jos siis kopiossa 1 on emäsjärjestys AACGCTA, on kopion kaksi emäsjärjestys
TTGCGAT. Silloin kopioon 3 emäsjärjestykseksi tulee uudelleen AACGCTA ja
kopioon 4 emäsjärjestykseksi TTGCGAT (sama kuin oli kopiossa kaksi) jne..

6. Kuvissa on tarkasteltu vain yhtä geenisirulla olevaa koetinsaareketta. Muista kuitenkin,
että jokainen geenisirulla oleva geenikoetinsaareke sisältää hieman eri mittaisia
jaksoja kokonais-DNA:sta. Alussahan kokonais-DNA pilkottiin restriksioentsyymillä
silpuksi. Eri saarekkeilla etenee siis eri mittaisia ”mittarimatoja”.
ssDNA:n tuottaminen
Aikaisemmin tuli jo esille, että lasille kopioituu joka toisella kierroksella alkuperäisen
emäsjärjestyksen negatiivi ja joka toisella kierroksella taas sama alkuperäinen
emäsjärjestys (positiivi). Vuorotellen tehdään siis positiivista negatiivi, negatiivista

7. positiivi, positiivista negatiivi jne. emästen pariutumissäännön A-T, CG mukaisessa
merkityksessä.
Jotta lasille muodostuvat DNA-juosteet voidaan sekvenssoida, tuleekin lasilta lopuksi
poistaa joko parittomilla tai parillisilla kierroksilla syntyneet juosteet. Jäljelle jäävät
juosteet kestävöidään lasiin kiinni 5´-päästään, jolloin niiden 3´-pää jää vapaaksi. Vasta
tällä tavalla saadaan sekvenssointikelpoista ssDNA:ta.
Sekvenssointi
1) Sekvenssointia varten siru upotetaan fluoresoivia dd-nukleotideja ja DNA
polymeraasia sisältävään liuokseen.
2) Käynnistetään uudelleen PCR geenisirun pinnalla. ssDNA-juosteiden 3 ́-
päät emäspariutuvat vapaiksi jääneiden geenikoettimien kanssa mittarimatojen tapaan,
kuten aikaisemminkin.
3) DNA-polymeraasi liittää yhden fluoresoivan nukleotidin koettimen jatkoksi. Koska
kyseessä on dd-nukleotidi, PCR pysähtyy heti tähän.
4) Jokainen dd-nukleotidi (A, T, C, G) on leimattu esim. GFP:llä siten, että ne fluoresoivat
eri värisinä. Väri todennetaan optisella lukulaitteella.
5) Kun väri kaikista eri saarekkeista on luettu, nukleotidin fluoresoiva dd-osa poistetaan.
Nyt PCR:ää jatketaan, jolloin DNA-polymeraasi liittää edellä lisättyjen nukleotidien
jatkoksi seuraavan fluoresoivan dd-nukleotidin.
6) Taas saarekkeiden väri todennetaan optisesti, fluoresoiva dd-osa poistetaan,
lisätään uusi fluoresoiva nukleotidi aikaisemmin lisättyjen jatkoksi jne.
7) Saarekkeissa hohtavan fluoresenssin väri paljastaa kulloinkin viimeisimpänä lisätyn
emäksen: A, T, C tai G.
Rinnakkaissekvenssointiin tarvitaan useita eri restriktioentsyymeihin perustuvia
geenisiruja
Kokonais-DNA:n sekvenssointi on mahdollista vasta, kun kaikki edellä kerrotut
vaiheet toteutetaan myös jollakin toisella, eri restriktioentsyymiin ja sen
tunnistussekvenssiin perustuvalla geenisirulla. Näin saadaan päällekkäin osuvia
emäsjärjestyksiä, joiden keskinäinen sijainti kokonais-DNA:ssa päätellään
haulikko- eli rinnakkaissekvenssoinnilla.

8. Tuhansien geenikoetintäplien valovälähdyssarjat tuottavat valtavia tietokantoja.
Näiden analysointi tapahtuu kokonaan tietokoneiden varassa.
ALLA VALOKUVINA PAPERIMALLI NGS-SIRUSTA SEKÄ EDELLÄ
ESITETYN PCR-KOPIOINNIN ALKUVAIHEET
Tyhjiä geenikoettimia saarekkeina geenisirulla.

9. DNA-sekvenssejä geenikoettimiin kiinnittyneinä, yksi joka saarekkeella.
Sekvenssit kiinnittyvät koettimiin 3´-pää edellä. Eri saarekkeille asettuu
tyypillisesti eri mittainen sekvenssi.
DNA-polymeraasit (punaiset pallot) rakentavat uutta kaksoisjuostetta.

10. PCR:n kuumassa vaiheessa DNA avautuu yksijuosteiseksi. Uudet
yksöisjuosteet tarttuvat 3´-päällään geenikoettimiin. Koettimet toimivat
praimereina seuraavaa PCR-kierrosta varten, jne…