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1. Medir 25 mL de agua o pesar 25 g de pescado...
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La incidencia de daños en alimentos enlatados es...
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4.1 TOMA DE MUESTRA: 
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V. ESQUEMA DE TRABAJO: 
En el presente experimento se utilizo 2 la...
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VI. RESULTADOS: 
- Anaerobio  3 (–) No cumple con el control de e...
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Se la denominación de cereal a las plantas gramí...
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El protocolo de análisis microbiológico de cereales y productos de...
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IV. PROCEDIMIENTO: 
4.1 TOMA DE MUESTRA: 
Las muestras de granos o...
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V. ESQUEMA DE TRABAJO: 
Se coloca 45 ml de agua peptonada en una b...
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  1. 1. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRÁCTICA # 01 – RECUENTO EN PLACA CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA ALUMNO : CAVA SALINAS, MARCO CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  2. 2. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN: El método de recuento en placa, permite la determinación de los microorganismos viables presentes en una muestra, siempre que se utilice un medio de cultivo adecuado y que las condiciones de incubación sean correctas (nutrientes, atmósferas y temperatura). Por lo tanto, este método puede aplicarse al recuento de grupos distintos de microorganismos. Así tenemos: microorganismos psicrófilos, mesófilos, termófilos, mohos y levaduras, enterocococos, estafilocococos, enterobacterias, etc. (Pelczar19). Las técnicas de siembra más comúnmente usadas para el recuento de microorganismos viables, son el recuento estándar en placa por siembra por incorporación y el recuento en placa de siembra por extensión en superficie. Es necesario indicar, que ninguna de estas formas de siembra es capaz de poner de manifiesto todos los microorganismos viables presentes en una muestra, debido a la variedad de necesidades nutritivas y condiciones físicas exigidas por los diferentes tipos de microorganismos, por lo cual el recuento en placa proporciona sólo una aproximación de la población total presente en la muestra. Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, para expresar el resultado se utiliza el término: “unidades formadoras de colonias” (u.f.c). Además, a fin de que todas las células que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa. Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimación del recuento. Para estimar los materiales sólidos que son solubles en el agua o que forman suspensiones finas en este medio (como por ejemplo harina, leche en polvo, azúcar), se suspende o se disuelve por agitación en un diluyente estéril una cantidad dada de muestra. Ciertos materiales sólidos como el queso y la carne, deben se triturados hasta pequeñas partículas en diluyente estéril. Entre los diluyentes más comúnmente empleados se encuentran la solución Ringer diluida a un cuarto, el diluyente agua de peptona y la Solución Salina Fisiológica Peptonada (S.S.F.P). II. OBJETIVOS: a. Adiestrar al estudiante con el método b. Determinar el número de microorganismos viables presentes en una muestra de alimento.
  3. 3. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT III. MATERIAL: 1. BIOLÓGICO: - Muestra: Agua 2. DE LABORATORIO: - Placas de petri estériles. - pipetas. - mechero - Tubos de ensayo. 3. MEDIOS DE CULTIVO: - Agar cuenta gérmenes (PCA) - Solución Salina Fisiológica Peptonada (SSFP) 4. EQUIPOS: - Contador Quebeck - Incubadora regulada a 35 – 37ºC. IV. PROCEDIMIENTO: La muestra debe llegar al laboratorio convenientemente identificada cumpliendo los requisitos de muestreo. 4.1 SIMBRA POR INCORPORACIÓN: 1. Desinfectar al lugar de trabajo con alcohol Yodado. 2. identificar la muestra con los siguientes datos: Nombre y/o número del lote, dilución, volumen sembrado, técnica de siembra, fecha, operador, etc. 3. Según la carga microbiana esperada elegir las diluciones a sembrar. Realizar no menos de tres diluciones consecutivas: 1:10, 1:10, 1:1000. Cada vez que se prepara una dilución cargar y descargar la pipeta cuando menos tres veces. 4. depositar 1Ml de cada dilución en placas estériles, vacías, por duplicado.
  4. 4. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 5. Adicionar a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear (por ejemplo PCA, para bacterias aerobias mesófilas viables, u otro medio de cultivo de acuerdo al microorganismos que se desee contar), previamente licuado y enfriado a 45ºC. 6. Mezclar cuidadosamente el medio y el inoculo mediante una combinación de movimiento giratorios y de vaivén, cobre la superficie de la mesa de trabajo. Deben tomarse precauciones para que durante estos movimientos, el agar no toque la tapa de la placa de Petri. Dejar solidificar. 7. Después de solidificado el agar, incubar las placas a 37ºC durante 24 a 48 horas. 8. Para el recuento, escoger las placas en las que ha desarrollado entre 30 a 300 u.f.c. 4.2 SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN SUPERFICIE: Si la siembra es en superficie, se deposita en la superficie de las placas que ya contiene el medio de cultivo solidificado, 0,1 mL de cada dilución. Se siembra por duplicado para cada dilución. Luego de colocada la muestra, se procede a extenderla sobre la superficie de las placas con un asa adecuada. Incubar las placas a 37°C por 24 a 48 horas, luego hacer la lectura e informar el resultado. La técnica de siembra por extensión en superficie es más adecuada para recuentos de psicrótrofos y psicrófilos, o muestras en las que se supone hay patógenos para que los microbios no se inactiven con la temperatura del agar licuado. V. ESQUEMA DE TRABAJO.  1° Paso: Se procede a desinfectar las manos con el del que va a realizar el experimento con el alcohol iodado y a desinfectar el ambiente con un mechero encendido por donde se han de pasar de manera cuidadosa los instrumentos a utilizar como lo grafica el siguiente esquema:
  5. 5. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT  2° Paso: Acá se procede a tomar 1 ml de muestra con la pipeta y colocar en 1º lugar a uno de los dos tubos que contienen a la solución salina fisiológica para obtener la 1º solución 10-1 y de donde después se a de tomar 1 ml par ser agregado en 2º lugar al segundo tubo para obtener la 2º solución 10-2:  3° Paso: Aquí se tomo como 1 ml de cada solución y se coloco en una placa petrix que a su vez contenía de 12 a 15 ml de agar. En este caso se graficado como si se hubiese realizado en dos placas pero en realidad solo se realizo una en la primera fecha del experimento:  4° Paso: Como paso final se coloco a las placas petrix en una estufa a 37º C x 48 horas para que incube y así puedan formar las colonias:
  6. 6. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT M uestr a 10-12 ml. Agar PCA Homogenizar Lectura
  7. 7. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VI. RESULTADO. En el presente experimento se obtuvo como resultado del recuento de bacterias la cantidad de 2000 u.f.c. / mL. Abajo observamos la placa con las colonias: VII. COMENTARIO. Este método es muy sencillo y práctico ya que nos permite detectar la presencia de microorganismos viables en los alimentos, como bacterias aeróbias mesófilas, coliformes, clostridium, etc. sin ninguna dificultad. La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso una única célula viva. Además, el recuento en placa no requiere un equipo complicado. Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muy preciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado de colonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan, ya que disminuye el error debido al muestreo. VIII. CUESTIONARIO. 1. ¿Cuál es el fundamento del método de recuento en placa? Este método se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo sólido, donde se ha sembrado un volumen conocido de agua, transcurrido un tiempo y a una temperatura de incubación determinados. 2. ¿Por qué, para el recuento de bacterias viables, se escogen las placas que han desarrollado entre 30 y 300 u.f.c.? Por razones estadísticas. Para obtener resultados estadísticamente significativos. Para que ello sea posible, en el momento de la siembra debe tenerse una idea aproximada del número de bacterias presentes en la muestra a fin de realizar las diluciones adecuadas. A la cantidad de bacterias contadas en los recuentos se le debe de multiplicar por el inverso del factor de dilución y así poder reportar el resultado en UFC.
  8. 8. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las siembras por incorporación y superficie? POR INCORPORACION POR SUPERFICIE Mayor cantidad de muestra a procesar. Menor cantidad de muestra a procesar. Menor error. Mayor error. Mejor aprovechamiento de nutrientes por parte de los microorganismos. Peor aprovechamiento de nutrientes por parte de los microorganismos. Dificultad para subcultivar colonias. Facilidad para subcultivar colonias. Difícil visualización de colonias. Fácil visualización. La temperatura del agar puede afectar a ciertos m.o. No se afectan las células termosensibles. Se desarrollan microaerofílicos. En aerobiosis solo crecen aerobios y anaerobios facultativos. 4. ¿Por qué se utiliza el término “unidades formadora de colonias” (u.f.c.)? Este término se utiliza pues las colonias pueden originarse tanto de la célula como de un grupo de células. Además en las colonias son formadas a partir de un microorganismo y se multiplican tan rápido hasta formar una colonia Por ejemplo en el recuento en placa con una disponibilidad adecuada de nutrientes, se establece que el recuento bajo condiciones óptimas se logra desarrollar entre 30 y 300 colonias por placa. 5. ¿Por qué el método de recuento en placa, no nos permite determinar el total de la población viable de bacterias presentes en una muestra de alimento? Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una población, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"), bajo las condiciones del medio. Se basa en el principio de que una única célula viable originará una colonia visible, cuando se siembre en una placa de agar; por lo tanto no será posible la determinación del total de viables, debido a que en un alimento existe una variada gama de microorganismos con requerimientos nutritivos y ambientales diferentes, si alguno de ellos posee las condiciones adecuadas para su desarrollo, otro de ellos puede no contar con estas.
  9. 9. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso una única célula viva. Además, el recuento en placa no requiere un equipo complicado. Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muy preciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado de colonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan, ya que disminuye el error debido al muestreo. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petrix con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original.
  10. 10. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRACTICA # 02: RECUENTO POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBLABLE CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA ALUMNO : GUEVARA ENRIQUEZ, JUAN CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  11. 11. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN: El método del Número Más Probable (NMP), o llamado también llamado método de los tubos múltiples, es un método alternativo que permite efectuar el recuento de cifras bajas de microorganismos, viables, por ejemplo, menos de uno por mL. Proporciona una idea aproximada del número de bacterias vivas presentes en una muestra de alimento, que pueden multiplicarse en una medio de cultivo líquido determinado. El medio de cultivo a elegir depende del tipo de microorganismo que se desea contar, por tanto se pueden utilizar medios de enriquecimiento selectivos, ó medios de propagación. El método del NMP, es útil para determinar el número de diversos tipos de microorganismos presentes en una muestra de alimento. Así, utilizando los medios de cultivo apropiados, se puede determinar el número de coliformes y E. Coli, enterococos, estafilococos, salmonella, etc. El método se fundamente en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra en la que todavía hay crecimiento microbiano. Este método es útil para determinar cargas microbianas bajas, pero tamicen puede emplearse para determinar cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Así mismo, es el único método a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el método de filtración ni recomendable el de placas debido a la presencia de partículas. Se prefiere también este método cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecación, etc.). Es posible enumerar también microorganismos anaerobio utilizando medio pre reducido, que se cubren con vaselina o parafina luego de inocular o incubar en condiciones anaerobias. II. OBJETIVOS: 1. Adiestrar al estudiante en el método del Número Más Probable. 2. Determinar el número aproximado de bacterias viables presentes en una muestra III. MATERIAL: 1. BIOLÓGICO: - Muestra: Agua
  12. 12. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 2. DE LABORATORIO: - Placas de petri estériles. - Tubos de ensayo 16 x 150 - Tubos de ensayo 13 x 100 - pipetas de 10 y 1 mL - Campanas Durham de 10 x 75 - Mechero 3. MEDIOS DE CULTIVO: - Caldo lactosado bilis verde brillante (BRILLA) - Agar Violeta Rojo Bilis (VRBA) - Agar Tres Azúcares Hierro (TSI) - Caldo Triptonado o peptonado 4. EQUIPOS: - Estufa regulada a 35 – 37 ºC - Baño maría regulado a 44 ± 0.1ºC. 5. REACTIVOS: - Kovac’s IV. PROCEDIMIENTO: El procedimiento a seguir, depende del tipo de microorganismos que se quiere enumerar en la muestra de alimento. Así para la presente práctica, se determinará en una muestra de agua el número de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes) y E. Coli fecal. 4.1 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES: 1. Desinfectar a mesa de trabajo con alcohol yodado. 2. Identificar la muestra. 3. Agitar el frasco que contiene la muestra.
  13. 13. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 4. Pipetear 10 mL de caldo BRILA doble concentrado, 1 ml a los tres siguientes tubos conteniendo BRILA a concentración normal y 0.1 mL a los tres tubos restantes con BRILA a concentración normal. 5. Homogeneizar la siembra adecuadamente e incubar los tubos a 35-37 ºC durante 24 a 48 horas. 6. Anotar como positivos los tubos que muestren producción de gas en las campanas de Durham. 7. Obtener el Número Más Probable (NMP) de la siguiente manera Para valores de 3, 1 y 0 respectivamente, la tabla indica un NMP de 43 /100 mL (Según tabla del NMP) 4.2 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES FECALES Y E. Coli. 1. De cada tubo positivo (presencia de gas) del paso anterior, sembrar una alícuota en caldo Brila (Concentración simple) y otra alícuota en caldo triptonado. 2. Incubar en baño maría a 44 + 0.1 ºC durante 24-48 horas. 3. Luego del tiempo de incubación, efectuar la prueba del indol en los tubos con caldo triptonado, para lo cual se adiciona 2 a 3 gotas de reactivo de Kovacs. 4. Agitar el tubo y Observar la Formación de un anillo color grosella en la interface del medio de cultivo (reacción positiva); un color naranja, indica la presencia probable de escatol y puede ser reportado también como una prueba positva. 5. los cultivos (tubos) que muestren producción de gas en caldo BRILA y la formación de indol en caldo triptonado son positivos a E, Coli fecal. 6. Los cultivos que sólo muestren producción de gas más no producción de indol se consideran coliformes fecales. 7. Determinación del NMP de coliformes fecales y E. Coli en la tabla del NMP.
  14. 14. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT V. ESQUEMA DE TRABAJO.  1° Paso: En este primer paso se tomo 1 ml de muestra (agua potable) y se formaron dos soluciones de 10+1 y 10+2 respectivamente en cada tubo:  2° Paso: Como segundo paso se coloco 10 ml de muestra en los tres primeros tubos que contenían la solución brilla, luego se coloco 1 ml de solución 10-1 en cada uno de los tres tubos siguientes y finalmente 0.1 ml de solución 10-2 en los tres tubos finales:  3° Paso: Finalmente se deja incubar en una estufa por el periodo de 48 horas a una 37ºC para luego observar los resultados:
  15. 15. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Tubos 1 Incubación 37ºC (24-48h.) Incubació n 37ºC (24-48h.) Tubos 2 Tubos 3 VI. RESULTADO. M uestr a El resultado obtenido este caso fue de 3+, 3+, 0-, lo cual nos indica que el NMP es de 240/100ml y con un límite de confianza entre 36 y 1300. Abajo se muestra los tubos de ensayo del experimento:
  16. 16. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VII. COMENTARIO. Es un método útil para determinar cargas microbianas bajas, puede ser utilizado para cantidades mayores pero con diluciones apropiadas especialmente para muestras de polvos. Esta técnica se usa principalmente para la estimación de bacilos coliformes, empleando caldo de MacConkey, pero puede utilizarse casi para toda clase de gérmenes en muestras líquidas si puede observarse fácilmente el crecimiento, por ejemplo, si hay turbidez y producción de ácido. Ejemplos de ellos son las levaduras y hongos en jugos y bebidas de frutas, clostridios en emulsiones de alimentos, cadenas de esporos en suspensiones de harina. El método es popular aunque poco exacto. VIII. CUESTIONARIO. 1.- ¿Qué otras formas conoce, para realizar el método del NMP? Existen diversas formas de realizar este método, en la práctica se realizaron diluciones consecutivas (10-1, 10-2, 10-3) de las 1 ml de muestras en 9 ml de agua pectonada (1%) en tres tubos, de los cuales se tomo para cada caso 1 ml de dilución y se le agregó a otros tres con caldo BRILA a concentración normal. Otra forma es transferirse de la muestra original 10 ml a los tres primeros tubos conteniendo 10 ml de caldo BRILA doble concentrado, 1ml a los tres siguientes y 0.1 ml a los tres restantes; ambos a concentración normal. La muestra puede ser diluida ser seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de caldo. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10. Se puede dividir la placa petrix en cinco zonas de igual tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inoculado. Transferir 5 μl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta operación cinco veces por cada dilución. Permitir que el inoculó seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días. Las muestras a analizar no solo son liquidas, muchas veces son sólidas, en estos casos suele agregarse 10 g de muestra en 90 g de agua, se agita y al sedimentarse se trabaja con el sobrenadante, a partir de este se podrá realizar las diluciones o trabajar directamente como el procedimiento antes mencionado. En algunas ocasiones realizar tres diluciones consecutivas no es suficiente, por lo que es conveniente realizar las diluciones necesarias hasta obtener resultados más precisos.
  17. 17. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 2.- ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método de NMP?  VENTAJAS: - La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad). - Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados. - Determina solo organismos vivos y activos metabólicamente. - Suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros. - Determina cargas microbianas baja, pero también pueden emplearse para determinar cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. - Presenta ventajas frente a otros métodos para el caso de muestras como polvos insolubles. - Preferible para microorganismos que presentan crecimiento lento o han sido sometidos a condiciones adversas. - Es posible enumerar microorganismos anaeróbicos utilizando medio pre reducido, cubriendo con vaselina.  DESVENTAJAS: - No detectan las poblaciones con menos de una célula por mililitro, sólo permite microorganismos viables. 3.- ¿Qué otras formas de lectura, permiten determinar tubos positivos en el método de NMP? - Cambio de color (Verde brillante a verde celestino (verde nilo)). - Cambio de aspecto (transparencia a turbidez). - Por pruebas presuntiva y prueba confirmativa done existe formación de gas. - Formación de ácido.
  18. 18. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRÁCTICA # 04: RECUENTO EN TUBO DE ANAEROBIOS SULFITO REDUCTORES CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA ALUMNO : LEÓN PICÓN, BRUCE CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  19. 19. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN: El método de recuento en tubo, es otro método que permite la determinación del número de microorganismos viables presentes en muestras de alimentos. Este método, es particularmente útil para el recuento de microorganismos anaerobios, tales como los clostridios sulfito reductores, siempre y cuando se utilice el medio adecuado y las correctas condiciones de incubación. En este método, es necesario colocar la muestra o una dilución de la misma, en un tubo estéril, para luego, homogeneizar. Con la finalidad de darle las condiciones de anaerobios, después de solidificado el medio de cultivo, se debe agregar una sobrecapa de agar agar o del mismo medio de cultivo empleado. Después de la incubación se calcula el número de bacterias por mililitro o gramo de muestra original contando las colonias negras que se observan en el tubo. Los medios de cultivo empleados para el recuento de anaerobios (por ejemplo clostridios sulfito reductores), son el medio Triptona Sulfito Neomicina Agae (TSN Agar), o el medio Sulfito Polimixina Sulfadiacina Agar (SPS Agar) Es pertinente aclarar, que el recuento de microorganismos anaerobios, también se puede realizar por el método de recuento en placa, para lo cual se debe emplear el medio cultivo adecuado y las adecuadas condiciones de incubación y se pueden contar de igual manera esporos de anaerobios sulfito reductores, pasteurizando la muestra original o las diluciones por 10 minutos a 80oC antes de añadir el medio de cultivo. II. OBJETIVOS. 1. Adiestrar al estudiante con el manejo del método de recuento en tubo para anaerobios. 2. Determinar el número de microorganismos viables (anaerobios sulfito reductores) presentes en una muestra de alimento.
  20. 20. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT III. MATERIAL. 1. BIOLÓGICO: - Muestra (Por ejm., agua estancada). 2. DE LABORATORIO: - Tubos con agua de dilución (9 mL de agua peptonada). - Tubos de ensayo de 15 x 150 vacios estériles. - Pipetas de 1 y 5 mL. - Gradilla. 3. MADIOS DE CULTIVO: - Agar SPS ó Agar TSN. - Agar agar. 4. EQUIPO: - Incubadora regulada 35 – 37°C. IV. PROCEDIMIENTO.: 1. A partir de la muestra de agua estancada realizar tres diluciones consecutivas 10-1 10-2 y 10-3. 2. De cada una de las 3 diluciones pipetear por duplicado 1 mL en cada uno de los tubos estériles. 3. Verter en cada tubo 12 a 15 mL de SPS ó TSN fundido a una temperatura aproximada de 45°C y homogeneizar suavemente sin agitar. Dejar solidificar los tubos en posición vertical. 4. Adicionar una capa de 2 a 3 mL de SPS ó agar agar. 5. Dejar solidificar. Incubar a 37°C por 24 a 48 hs. 6. Después del periodo de incubación, contar las colonias negras, seleccionando los tubos que presenten entre 1 a 20 colonias; sacar el promedio y multiplicar por el inverso de la dilución. 7. Informar como anaerobios sulfito reductores totales por mililitro de muestra. Nota: a. Para el recuento de esporulados realizar un previo calentamiento de la muestra (paso 2) a 80°C durante 5 a 10 minutos y luego seguir el mismo procedimiento que para anaerobios sulfito reductores totales. b. Si se desea identificar el tipo anaerobio sulfito reductor, seleccionar cinco colonias negras al azar y sembrarlas en caldo tioglicolato.
  21. 21. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Incubar en baño maría a 46 ± 0.1°C durante 3 a 4 horas, no siendo necesario incubar en condiciones de anaerobiosis. Realizar la coloración Gram y determinar: La fermentación de la lactosa, movilidad, licuefacción de la gelatina y reducción de nitratos. V. ESQUEMA DE TRABAJO.  1° Paso: Se toma 1 ml de la muestra y se forma soluciones 10-1 y 10-2:  2° Paso: En cada uno de los tubos anteriores se coloca 2 ml de agar agua y 12 agar previamente calentados:  3° Paso: Una vez que se ha solidificado se lleva a incubación por 18-24 horas a 37 ºC:
  22. 22. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Desinfección de manos e instrumentos a usar Agua potable 1 ml Toma de muestra Tubos estériles Adición a cada tubo de agar agua y agar SPS (los que previamente fueron calentados hasta fundirse) Agar agua Agar SPS 10 ml 2 – 3 ml Se deja solidificar y luego se lleva a incubar a 37°C por 3 días. Se hace lectura contando las colonias negras
  23. 23. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VI. RESULTADO. Se encontró que si existían colonias de bacteria y se observaron por la formación de puntos negros que es producido por la reducción de sulfitos. Abajo se observa el tubo con las colonias que son los puntos negros: Se obtuvo en promedio 68 colonias por mililitro de muestra VII. COMENTARIO. En este experimento se ha demostrado que es útil para el recuento de colonias de bacterias especialmente anaerobias en especial los clostridium sulfito reductores. Este método nos permite determinar el número de microorganismos viables presentes en alimentos, es útil particularmente útil para el recuento de microorganismos anaerobios, tales como los clostridios sulfito reductores, siempre y cuando empleemos un medio adecuado y las correctas condiciones de incubación. VIII. CUESTIONARIO. 1.- ¿Qué otros microorganismos se puede enumerar mediante el método de recuento en tubo? Se pueden enumerar los siguientes:  E. Coli  Bacillaceae Anaerobios  Clostridium Perfingers.  Clostridium Sulfito Reductores  Esporas de Clostridium Sulfito Reductores
  24. 24. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 2.- ¿Cuál es la importancia de enumerar microorganismos anaerobios en una muestra de alimento? Para tener en consideración en qué grado de contaminación se encuentra la muestra de alimento y poder decidir si es capaz de producir intoxicación, además que sirve como método de identificación de indicadores de contaminación fecal. 3.- ¿A que se deber el color negro de las colonias que aparecen en el medio de cultivo? Como los microorganismos se encuentran en estado de anaerobiosis y su alimento se encuentra en el medio el cual contiene sulfito, dichos microorganismos consumen los sulfitos mediante la reducción a dichos sulfitos.
  25. 25. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRÁCTICA #05: INVESTIGACIÓN DE Salmonella EN ALIMENTOS CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA ALUMNO : GASTAÑADUÍ VÁSQUEZ, ROBERTO CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  26. 26. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN: Las salmonellas pertenecen a la familia de Enterobacteriaceae. Son bacilos Gram (-), oxidasa (-), móviles o inmóviles. Hasta el momento existen más de 2 200 tipos serológicamente diferentes y continuamente se añaden a la lista de serotipos nuevos. No obstante se observan de manera regular unos 100 serotipos. La presencia de cualquiera de los serotipos de salmonellas en una alimento deberá ser considerado como peligro potencial. Estudios de administración por la vía orla de cultivos puros con los alimentos han demostrado que se requieren comúnmente grandes dosis de microorganismos para producir la enfermedad en adultos. No obstante, en niños, ancianos y personas debilitadas; números reducidos de células son suficientes para determinar la enfermedad; por esta razón, la presencia de salmonellas cualquiera que sea su número en un alimento preparado yapara el consumo se considera siempre como un peligro grave para la salud. Las salmonelosis puede ser dividida en dos grupos principales: (1) las infecciones septicémicas que producen fiebres tifoideas y paratifoideas, producidas por Salmonella typhi y S. Paratyphi A, B y C, y (2) las infecciones entéricas no septicémicas producidas por la otras salmonellas. Esta división la usa la OMS en su sistema de estadísticas sanitarias. La puerta de entrada de las salmonellas, lo mismo que la de otros agentes de infecciones gastrointestinales, es casi exclusivamente la vía oral. El microorganismo se transmite por la excretas, principalmente por la heces del hombre y algunos animales, peri también por la orina. La epidemiología de la salmonelosis es extremadamente compleja. Por ejemplo S. typhi y S. Paratyphi infectan al hombre principalmente, mientras que otras salmonellas infectan a un gran número de animales, tanto de sangre caliente como de sangre fría. Por lo general, los animales, son solo portadores que eliminan salmonellas de forma regular aunque en pequeña cantidad. El medio ambiente humano y animal se contaminan por excretas humanos y animales. A través de aguas superficiales, de los insectos, las aves, y los roedores, pueden contaminarse tanto como los piensos, estableciéndose así ciclos de infección.
  27. 27. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Prácticamente todos los alimentos de origen animal pueden ser vehículo de transmisión de salmonellas al hombre. Además, las salmonellas pueden ser a veces vehiculizadas por alimentos de origen vegetal, tales como los cereales y los frutos del cocotero, y por productos farmacéuticos. Sin embrago, los vehículos dominantes son la carne (ternera, cerdo, aves, etc.), los huevos, la leche y los productos industrializados que contienen estas materias primas básicas. Los métodos para el aislamiento e identificación de salmonellas a partir de los alimentos pueden considerarse divididos en siete etapas sucesivas: 1. Enriquecimiento no selectivo. 2. Enriquecimiento selectivo. 3. Aislamiento selectivo. 4. Bioquímica presuntiva. 5. Bioquímica confirmativa. 6. Serología. 7. Tipificación por medio de bacteriófagos. El enriquecimiento no selectivo tiene por finalidad la revitalización de las salmonellas dañadas por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento. El enriquecimiento selectivo sirve para favorecer el crecimiento de las salmonellas en una ambiente que puede contener gran número de bacterias diferentes de ellas mismas. La siembra en placa, (aislamiento selectivo), permite la “visualización” de las colonias sospechosas, por su aspecto característico. El valor de los resultados, como en cualquier procedimiento analítico, dependerá de la adecuada elección de la muestra en representación del lote y de la cantidad de alimento muestreado. II. OBJETIVO: -Muestra (por ejemplo agua u algún alimento sólido)
  28. 28. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT III. MATERIAL. 1. BIOLÓGICO: - Muestra (Por ejm., agua u algún alimento sólido). 2. DE LABORATORIO: - Tubos de ensayo de 13 x 100 - Tubos de ensayo de 15 x 150 vacios estériles. - Pipetas de 1 y 5 mL. - Placas de petri estériles. - Matraz de 500 Ml. 3. MEDIOS DE CULTIVO: - Caldo Lactosado - Caldo selenito. - Caldo tetrationato verde brillante. - Agar Salmonella-Shigella (SS) - Agar VRBA ó Mac Conkey - Agar TSI. - Agar LIA. - Agar Común. 4. REACTIVOS: - Solución de yodo y yoduro de potasio. - Solución de verde brillante 5. EQUIPO: - Estufa regulada 35 – 37°C. IV. PROCEDIMIENTO: 4.1 Enriquecimiento no selectivo: Pipetear 25 mL de agua a analizar y vertido en 225 mL caldo lactosado. Incubar a 35-37ºC por 6 a 8 horas. 4.2 Enriquecimiento selectivo: Llevar 1 mL del cultivo anterior a 10 mL de caldo selenito y a 10 mL de solución yodo yodura. Incubar a 37°C por 24 horas. 4.3 Aislamiento en medios sólidos selectivos: a. A partir de los cultivos incubados sembrar en agar SS y agar VRBA ó Mac Conkey por estría. Incubar a 35-37°C por 24 a 48 horas.
  29. 29. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT b. Después del periodo de incubación examinar en las placas las colonias sospechosas de salmonella. En agar SS las colonias incoloras y transparentes corresponden a la mayoría de las Salmonelas; las colonias transparentes con centro negro corresponden a Proteus y algunas salmonelas. En agar VRBA se eligen las colonias transparentes (lactosas negativas). Elegir 2 ó más colonias sospechosas de cada placa. c. Sembrar en agar común inclinado e incubar a 35-37°C por 24 horas Comprobar la pureza de los cultivos mediante coloración Gram. d. Inocular en agar TSI y LIA Incubar a 35-37°C por 24 horas (Bioquímica Presuntiva). Los cultivos sospechosos de ser salmonella en agar TSI presentan reacción alcalina en la parte superior del medio (lactosa y sacarosa negativos) y reacción ácida en la columna de agar (color amarillo a consecuencia de la degradación de la glucosa) (K/A) con o sin producción de H2S (ennegrecimiento del medio). En agar LIA los tubos son de color púrpura con o sin ennegrecimiento. e. La identificación serológica de las cepas sospechosas se realiza mediante el uso del antisuero O polivalente, de los antisueros O específicos de grupo y de los antisueros H. algunas salmoneras cuentan con antígenos capsulares (K), conocidos como Vi, que pueden interferir en la aglutinación por antisueros O.
  30. 30. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT V. ESQUEMA DE TRABAJO.  1° Paso: Se toma una pequeña muestra de caldo lactosado (crecimiento no selectivo) para luego ser colocado en los tubos de ensayo que contienen caldo tetrationato verde brillante y caldo selenito. Previamente antes de cada experimento se desinfecta el ambiente y los utensilios con alcohol y fuego con el mechero:  2° Paso: Luego se toma una gota de cada tubo y se extiende en una placa petrix que contiene agar salmonella-shigella y se deja incubar a 37 ºC por 24 horas:  3° Paso: Después que se ha incubado la placa y se observa lo que podría ser las colonias de salmonella y shigella, se toma una pequeña muestra y se coloca en un tubo de ensayo conteniendo TSI y se pone a incubar nuevamente a 37 ºC por 24 horas:
  31. 31. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Enriquecimiento no selectivo Se pipeteó 25 ml de agua y se vertió en 225 ml de caldo lactosado, luego se incubo a 37 °C x 8 h. Se lleva 1 ml de la muestra anterior a 10 ml de caldo selenito y a 10 ml de caldo tetrationato verde brillante al que se le añadió 0.1 ml de solución yodo yodurada. Se incuba a 37°C por 24h. Aislamiento en medios sólidos selectivos caldo selenito caldo tetrationato verde brillante. Se siembra cada cultivo en agar SS y agar VRBA ó Mac Conkey por estría. Se incuba a 37 °C por 48 horas, luego se hace lectura En agar SS, las colonias rojas corresponden a las shigelas y en agar VRBA las colonias rojas son Lactosa + En agar SS, las colonias incoloras y transparentes corresponden a las salmonellas y en agar VRBA las colonias transparentes son Lactosa -
  32. 32. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT L S G VI. RESULTADO. Bioquímica presuntiva Se tomó una colonia de la placa anterior y se lo estrío en la superficie en un tubo que contenía TSI (Tres azucares hierro: Glucosa, Lactosa y sacarosa), luego se lo incubo a 37°C y luego se hizo la lectura. LACTOSA - H2S + GLUCOSA + Se obtuvo como resultado en la placa puntos blanquecinos que son considerados como lactosa positivos y puntos rojizos claros que son lactosa negativos. Luego en el tubo de TSI observamos que si existía la presencia de salmonella además de la formación de gas y acido sulfhídrico. Abajo se muestra el tubo del experimento: Como se puede observar existe presencia de glucosa el cual se identifica por el color amarillo y una coloración amarilla lo cual indica que se ha metabolizado la lactosa por tanto podemos decir que es una presencia de salmonella. VII. COMENTARIO. La presencia de salmonellas en un alimento deberá considerare como un peligro potencial, por lo cual su identificación es de vital importancia. Estudios de administración por vía oral de cultivos puros con los alimentos has demostrado que se requieren comúnmente grandes dosis para producir la enfermedad en adultos. No obstante, en niños, ancianos y personas debilitadas; números reducidos de células son suficientes para determinar la enfermedad, por esta razón la presencia de salmonellas cualquiera que sea su número en un alimento preparado ya para el consumo se considera siempre como un peligro grave para la salud.
  33. 33. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Por las razones antes mencionadas es importante que los alumnos sepan como identificar este tipo de microorganismo para ser así más competitivos a nivel laboral. Este método es útil para la detección de salmonellas que son se encuentran afectando a los alimentos que consumimos y se observa que mediante este método se puede detectar la presencia de estos. VIII. CUESTIONARIO. 1.- ¿Qué alimentos que se consumen en nuestro medio, están relacionados con Salmonella? Una de las fuentes principales son los alimentos de origen animal y los vegetales regados con aguas contaminadas con éste microrganismo especialmente los alimentos. Es responsable de millones de casos al año de enfermedades transmitidas por alimentos; Origen: huevo crudo y mal cocido, pollos y carnes mal cocidas, productos lácteos, mariscos, frutas y vegetales. Los alimentos que se consumen en nuestro medio son los comúnmente asociados a intoxicaciones:  carne (vacuno, cerdo, pollo),  productos cárneos (jamón, salame, vienesas),  ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo),  productos de pastelería (cremas) y  productos lácteos (queso, queso de cabra, etc).
  34. 34. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Todos los alimentos, principalmente de origen; animal (carnes, aves y huevo) o verduras crudas o que sea sospechoso de brotes de intoxicaciones: Queso de Cabra, Embutidos, Comidas preparadas, pasteles, Aguas, Mariscos frescos o congelados, Leche en polvo, Verduras crudas y congeladas. 2.- ¿Cuál es la importancia del enriquecimiento no selectivo, en el aislamiento de Salmonella? Es importante porque el número de células son usualmente bajas en los laboratorios esto debido a los procesos tecnológicos que se aplican a los alimentos debilitan a la bacteria, la constitución propia del alimento: nutrientes, pH, aw influyen en la sobrevivencia o en su multiplicación, la presencia en el alimentos de substancias tóxicas para las bacterias por lo tanto aquí se preenriquecen las células en medios líquidos. 3.- ¿Cuál es la importancia del enriquecimiento selectivo, en el aislamiento de Salmonella? El enriquecimiento selectivo está destinado a inhibir la flora acompañante. Al estar adicionados de substancias químicas inhibidoras y sumado a los tiempos y temperatura de incubación óptimas permite su desarrollo por sobre otros microorganismos, lo que se confirma en los medios selectivos elegidos o por otras pruebas de identificación. Normalmente el rango de Tº de incubación vá de 35ºC a 43ºC por períodos de 16 a 24 h. Comúnmente los caldos selectivos usados son selenito con cistina (SC), verde brillante, tetrationato (TT), y el caldo cloruro de magnesio-verde malaquita de Rappaport-Vassiliadis (RV). 4.- De modo general, ¿Cuáles son los pasos para el aislamiento e identificación de Salmonella?  Enriquecimiento no selectivo.  Enriquecimiento selectivo.  Aislamiento selectivo.  Bioquímica presuntiva.  Bioquímica confirmativa.
  35. 35. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT  Serología.  Tipificación por medio de bacteriófagos.
  36. 36. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRACTICA # 06: INVESTIGACIÓN DE Vibrio Cholerae Y Vibrio parahaemolyticus EN ALIMENTOS CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA ALUMNO : NEIRA BERNALES, JORGE CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  37. 37. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN: El género Vibrio está formado por bacilos Gram negativos, oxidasa positivos, curvados o rectos, anaerobios facultativos. Muchas especies de vibrios son patógenos para el hombre y han sido implicadas en enfermedades transmitidas por los alimentos. Las especies de vibrio que no sean V. Cholerae y V. mimicus no crecen en medios a los que no se les haya añadido cloruro de sodio, y son denominadas “halofílicas” (ICMF 200) V. Cholerae fue descrito por primera vez por Pacini como la causa del cólera en 1854, y en 1960 el mundo sufrió la séptima pandemia del cólera. Cuando se ingiere un gran número de células de V. Cholerae, estas se multiplican en el revestimiento intestinal segregue grandes cantidades de fluido que se excreta en forma de diarrea acuosa en la que hay hasta 108 células de V. Cholerae por mL. Sin embargo, la mayoría de las heces de los pacientes de cólera en periodo de convalecencia pasada de una semana son negativas y en casi todos los casos a las tres semanas. La resistencia de V. cholerae a las influencias ambientales no es grande, sin embargo, este microorganismo puede sobrevivir en los alimentos y en el agua el tiempo suficiente para transmitir la enfermedad e igualmente pueden sobrevivir en alimentos refrigerados con actividad de agua elevada y acidez escasa por un periodo de dos semanas o más. El tiempo de supervivencia en alimentos de acidez elevada es generalmente menor de un día y en alimentos deshidratados menor de dos días. En utensilios y equipos de 4 a 48 horas. V. Cholerae no se multiplica en el agua pero sobrevive en este elemento desde algunos días a semanas, dependiendo del número de organismos existentes en el agua, de la disponibilidad de oxígeno, de la temperatura, del pH, del contenido en sal, de la materia orgánica, de la irradiación solar, de la presencia de bacterias competidoras, etc. Sobrevive muy bien en agua de mar y por tiempos mayores en cubitos de hielo que en agua fresca no congelada. Debido a que esta especie puede crecer en medios carentes de cloruro de sodio no es considerado un vibrio halofílico, aunque se requiere de trazas de ión de sodio para determinar su crecimiento. V. parahaeolyticus es un microorganismo Gram negativo halofílico encontrada naturalmente en aguas de estuarios marinos y animales. Fue descrita primero como la causa de una intoxicación alimentaria en Japón originada por el consumo de pescado y moluscos crudos.
  38. 38. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Tiene una distribución a nivel mundial en ambientes de estuarios y costeros y ha sido aislada a muchas especies de peces, moluscos y crustáceos. V. Parahaemolyticus ha sido implicado en numerosos brotes de gastroenteritis transmitida por el consumo de mariscos en los EEUU, que pueden haber sido originados por el consumo de mariscos crudos o insuficientemente cocidos, o mariscos apropiadamente cosidos contaminados después de su cocción (Norma Técnica Peruana NTP). El agar tiosulfato –citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS) es uno de los medios de cultivo empleados para el aislamiento de V. Cholerae, V. Parahaemolyticus y otros vibrios en donde las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, así como el medio fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las enterobacteriáceas. La bilis del buey y el colato reprimen, sobre todo, a los enterococos. Los coliformes que eventualmente pueden crecer no degradan a la sacarosa. Únicamente algunas razas de Proteus sacarosa-positivos pueden dar lugar a la aparición de colonias amarillas, semejante a las de los vibriones. El indicador azul de bromotimol-Azul de timol presenta un claro viraje a amarillo por la producción de ácido, incluso en medio fuertemente alcalino. II. OBJETIVO: - Adiestrar el estudiante con la metodología para el aislamiento e identificación de V. cholerae y V. Parahaemolyticus. III. MATERIAL. 1. BIOLÓGICO: - Muestra (Por ejm., agua o pescado). 2. DE LABORATORIO: - Placas petri estériles. - Tubos de ensayo de 13 x 100 - Balones de 300 mL. 3. MEDIOS DE CULTIVO: - Agua Peptonada Alcalina (APA) al 3% de cloruro de sodio. - Agua Peptonada Alcalina (APA) al 0.5% de cloruro de sodio. - Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa (TCBS). - Agar TSI. 4. EQUIPOS: - Estufa regulada a 35-37°.
  39. 39. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT IV. PROCEDIMIENTO. 1. Medir 25 mL de agua o pesar 25 g de pescado y ponerlos en 225 mL de APA al 0.5% de NaCl y 25 g en APA al 3% de NaCl. 2. Incubar a 35 – 37 °C durante 10 – 12 horas. 3. Transcurrido el periodo de incubación y sin agitar el frasco, transferir una asada e inóculo a partir de la película (crecimiento superficial) a dos placas de agar TCBS. 4. Incubar a 35-37°C drante 18-24 horas. 5. Examinar las placas para determinar las características de las colonias. Realizar lectura: - V. cholerae (El tor y clásico): colonias de color amarillo (sacarosa positivas), de bordes regulares, aspecto cremoso, ligeramente planas, grandes (2 – 3 mm de diámetro), con centros opacos y periferie translúcida. - V. parahaemolyticus: colonias con el centro de color verde azuladas (sacarosa negativas) pequeñas, de bordes regulares, filantes. 6. Realizar la bioquímica presuntiva de cada una de las colonias características sembrando en agar TSI. Incubar a 35-37 °C durante 18 a 24 horas: V. parahaemolyticus: K/a--, sin gas, H2S negativo. V. cholerae: A/A--, sin gas, H2S negativo. 7. Realizar la bioquímica confirmativa realizando las siguientes pruebas: Voges Proskauer, Rojo de Metilo (VPRM), test de oxidasa, arginina dihidrolasa, indol, etc. 8. Realizar la serología con sueros polivalentes y monovalentes.
  40. 40. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT V. ESQUEMA DE TRABAJO.  1° Paso: Se toma una muestra de agua peptonada alcalina (sembrado) y se coloca en una medio TCBS (agar tiosulfato citrato bilis sacarosa) y se pone a incubar a 37 ºC por 24 horas: Colocar 25 ml o 25 g de la muestra en 225 ml de APA al 0.5% de NaCl ó en APA al 3% de NaCl. Luego se incuba a 37°C por 12 horas. APA Después de incubar y sin agitar el frasco, se transfirió una asada de inóculo a partir de la película (crecimiento superficial) a dos placas de agar TCBS. Se estrió en 4 cuadrantes. Se incuba a 37°C por 24 horas y luego se hace lectura. Agar TCBS Las colonias con el centro de color verde azuladas (sacarosa negativa) pequeñas, de bordes regulares y filantes, indican la presencia de vibrio parahaemolyticus. Las colonias de color amarillo (sacarosa positiva), grandes, de bordes regulares, aspecto cremoso, ligeramente planas, con centros opacos y periferie translúcida, indican la presencia de vibrio cholerae.
  41. 41. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT L S G Se tomó una colonia de cada placa anterior y se lo estrío en la superficie en un tubo que contenía TSI (Tres azucares hierro: Glucosa, Lactosa y sacarosa), luego se lo incubo a 37°C y luego se hizo la lectura. VI. RESULTADO. Bioquímica presuntiva LACTOSA + SACAROSA + GLUCOSA + vibrio cholerae LACTOSA - SACAROSA - GLUCOSA + vibrio parahaemolyticus En este caso se observo la presencia de vibrión choleare y de vibrión parahemolyticus. Abajo se puede observar como el vibrión choleare degrado la sacarosa y se torno de color amarillento, mientras que en el otro caso el vibrión parahemolyticus se observa por la formación de los puntos blancos en la placa. Se puede observar que en el vibrio choleraeun color casi uniforme de amarillo con una pequeña definición de color rojo lo que indica una metabolización de la sacarosa a diferencia de vibrio parahaemolyticus que se observa un color más definido a rojo lo que indica presencia de glucosa (+) y un color negro indica sulfihidro (-). VII. COMENTARIO. Este es un método fácil y económico de realizar para investigar y reconocer vibrio choleraeun y vibrio parahaemolyticus. Estos microorganismos son capaces de crecer en medio TCBS (tiosulfato-citrato-sales biliares-sucrosa), el cual es específico a dichos organismos.
  42. 42. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Es un buen método de detección del v. choleare y v. parahemolyticus debido a las reaccione que estos tienen frente a la sacarosa, lactosa y glucosa y que nos permite detectar su presencia. Para estudiar su distribución en sus medios naturales marinos se utiliza la técnica de inmunoflourescencia, usada principalmente cuando los métodos de cultivo han sido poco efectivos. VIII. CUESTIONARIO. 1. Que alimentos que se consumen en nuestro medio están relacionados con v. choleare y parahemolyticus:  Aquellos que se consumen crudos.  Aquellos que se sospechara de alguna forma que podrían estar contaminados por haber sido irrigados con aguas no potables (ya se trataran directamente de aguas servidas o de aguas de sistemas de riego contaminados con excretas).  Y otros como acelga, albahaca, apio, berro, cebolla, espinaca, frutilla, lechuga, perejil, repollo, tomate, zanahoria y zapallito. 2. Cuáles son las formas de contaminación con v. choleare y parahemolyticus: En el caso del de v. choleare se produce por manipulación de los alimentos después de haber realizado las necesidades fisiológicas y no haber tenido una adecuad limpieza posterior y de esta forma haberse contaminado con las heces fecales, además aquellos productos que son regados con aguas servidas también son focos de infección. En el caso del v. parahemolyticus se produce más que todo por el consumo de productos provenientes del mar como pescado, moluscos, etc. 3. Como se explica el color que toman las colonias de v. choleare y v. parahemolyticus en el agar TCBS: Es este el medio selectivo más adecuado para el aislamiento de las especies de Vibrio e inhibidor para la mayoría de las enterobacterias. Esta inhibición se basa en las altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de las sales biliares y un pH fuertemente alcalino. La degradación de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y las colonias son verdes para las cepas que no utilizan la sacarosa y amarillas para aquellas que producen ácido a partir de este azúcar. Sin embargo la proporción de la sacarosa en el medio está equilibrada en forma tal que no les inhiba el crecimiento por exceso de ácido. Aumentando la concentración de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubación, pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria.
  43. 43. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 4. De modo general cuales son los pasos para el aislamiento de v. choleare y v. parahemolyticus: Tomar una muestra de agua y colocarla en un medio de cultivo APA y dejarlo incubar, luego tomar una asada de la APA y colocarlo en una placa con TCBS y dejarlo incubar a 37 ºC por 24 horas y luego observar los resultados. Características del medio  Medio preparado: verde azulado.
  44. 44. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRACTICA #08: ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA POTABLE CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA ALUMNO : PUGLISEVICH SALAZAR, JUAN CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  45. 45. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN El análisis bacteriológico del agua, se lleva a cabo con la finalidad de probar su potabilidad. Las bacterias que se encuentran en el agua son principalmente de tres tipos: bacterias naturales, microorganismos residentes en el suelo y microorganismos que normalmente habitan el intestino del hombre y otros animales. La transmisión a través del agua de microorganismos patógenos ha sido la fuente más grave de epidemias de algunas enfermedades. Entre las enfermedades más conocidas cuyos gérmenes pueden ser transmitidos por el agua están las siguientes: fiebre tifoidea y paratifoidea, cólera, gastroenterítitis, disentería amebiana, giardiasis, criptosporidiosis, diarrea viral, hepatitis infecciosa, etc. A los fines de determinar la potabilidad de un suministro de agua, es necesario establecer que el agua no se halla contaminada con microorganismos patógenos. Por lo tanto el análisis bacteriológico del agua es vital en la prevención de epidemias como resultado de la contaminación del agua. El examen bacteriológico de abastecimientos de agua no implica la búsqueda directa de los gérmenes patógenos. El ensayo se basa en el supuesto de que todas las aguas contaminadas con aguas residuales son potencialmente peligrosas. Por consiguiente, el control sanitario del agua se hace con métodos bacteriológicos para determinar la presencia de contaminación fecal. Ensayos para determinación de patógenos no se usan rutinariamente debido a que detectarlos en diluciones altas es muy difícil y además se encuentran en número muy inferior al de las bacterias entéricas las cuales tienen una tasa de mortalidad menor. El examen bacteriológico del agua usualmente involucra dos ensayos: la estimación del número de bacterias de acuerdo con el conteo total en placa y a determinación, más significativa, de la presencia o ausencia de miembros del grupo coliforme.
  46. 46. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT Los criterios de calidad bacteriológica del agua potable que es recomendado para nuestro país es: 0 coliformes/100 mL y no más de 500 bacterias heterotróficas/ mL. II. OBJETIVOS: 1. Determinar la calidad bacteriológica del agua potable que se consume en nuestra ciudad. 2. Familiarizar al estudiante con la toma de muestra, transporte y análisis de una muestra de agua potable. III. MATERIAL. 1. BIOLÓGICO: - Agua potable 2. MEDIOS DE CULTIVO: - Agar cuanta gérmenes (PCA). - Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante (BRILA) - Agar Violeta Cristal Rojo Neutro Bilis (VRBA). - Agar tres Azúcares (TSI). - Agua triptonada ó peptonada. 3. REACTIVOS: - Reactivo de Kovac’s. 4. EQUIPOS: - Autoclave. - Contador Québec. - Estufa regulada a 35-37°. - Baño maría regulado 44,5ºC. IV. PROCEDIMIENTO: 4.1 TOMA DE MUESTRA: 1. Desinfectar el grifo con un algodón embebido en una solución de hipoclorito ó flamear el grifo a la llama del mechero. 2. Abrir el grifo, dejar correr el agua durante 2 a 3 minutos. 3. Recolectar el agua en frascos de vidrio neutro o plástico, estéril de boca ancha con tapa protectora y cierre hermético. La capacidad de los frascos recolectores debe ser por los menos 250 ml de capacidad con el objeto de dejar un espacio que facilite la homogenización de la muestra antes del análisis.
  47. 47. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 4. Para inactivar el cloro residual presente en el agua potable, agregar tiosulfato de sodio en cantidad de 0.1 ml de una solución al 10% por cada 100 ml de muestra en l frasco antes de esterilizar. 5. Rotular la muestra, conteniendo los siguientes datos: Lugar de muestreo, fecha, hora exacta del mismo, y alguna condición especial que pueda sugerir la posibilidad de contaminación a fin de orientar el análisis. 4.2 TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA: 1. Después del acopio de la muestra ésta debe transportarte al laboratorio a una temperatura aproximada de 4ºC. 2. Al llegar la muestra al laboratorio debe ser refrigerada y/o analizada inmediatamente, caso contrario, debe conservarse en refrigeración a la misma temperatura hasta por un tiempo máximo de 6 horas. 4.3 ANÁLISIS DE LA MUESTRA: 1. Agitar el frasco que contiene la muestra y anotar las características de la misma. 2. Prepara las diluciones decimales con agua peptonada. 3. Efectuar las siguientes determinaciones: a) Numeración de bacterias heterótrofas (RTBAMV). b) Numeración de bacterias coliformes totales: Determinación mediante el método del Número Más Probable (NMP). c) Numeración de coliformes fecales: Dterminación mediante el método del NMP.
  48. 48. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT V. ESQUEMA DE TRABAJO: Se procede a desinfectar la zona de trabajo con alcohol iodado. Una vez realizado esto se procede a tomar una muestra de agua potable de 10 ml. Y se coloca en 3 tubos de ensayo que contienen BRILLA 2M, después se forman diluciones 10-1 y 10-2, de las cuales se van a colocar 1 ml de cada una en 3 tubos que contienen cada una de ellas el BRILLA normal y es colocada en la estufa regulada a 37º C por 24 horas. Esto se hace para la detección de microorganismos a través del método del número más probable. Y para finalizar se toma 1 ml de dilución 10-1 y se coloca en una placa petrix al cual luego se va a colocar el AGAR diluido en calor y luego es colocado en la estufa regulada a 45º C. Esto es para realizar el método del recuento en placa. En la grafica ulterior se ilustra todo el proceso seguido: Proceso de Análisis Bacteriológico de Agua Potable
  49. 49. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VI. RESULTADOS:  En el caso del método del numero más probable no se encontró ningún rastro en el los tubos (resultado negativo), lo que indica la poca o casi nula presencia de microorganismos en la muestra del agua potable.  En el caso del método del recuento en placa se encontró la presencia de 3 colonias lo que corrobora el resultado anterior con la casi nula presencia de bacterias en el agua potable, tanto para dilución de 10-2 y 10-3. VII. COMENTARIO:  Solo quedaría por mencionar la importancia de realizar los análisis del agua potable, pues como se sabe es de consumo humano y de vital importancia para la existencia del hombre.  Además estos tipos de análisis son también de gran importancia y primordiales en lo referente a la industria de los alimentos puesto que esto contribuye a tener un producto final de buena calidad y en optimas condiciones para el consumo. VIII. CUESTIONARIO: 1º. Aparte de bacterias heterotróficas (RTBAMV) y de coliformes y E. coli. ¿Qué otros microorganismos pueden investigarse en una muestra de agua potable? Se pueden investigar a las amebas que producen la amebiasis, la salmonella que produce la salmonelosis, la salmonella tiphy que causa la tifoidea, enterobacterias, gérmenes saprofilos, los virus.
  50. 50. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 2º. ¿Cómo se procede para recoger muestras de aguas y ríos? Se procede tomando varias muestras de diferentes puntos del rio en frascos estériles y sellados para evitar que se contaminen. Luego deben de ser trasladados al laboratorio para su análisis. 3º. ¿Qué pasos se siguen en la potabilización del agua, en las plantas de tratamiento de agua? En siguiente cuadro se muestran los pasos a seguir: 4º. ¿Que otros métodos se emplean para la determinación de coliformes? Tenemos el método de la membrana filtrante.
  51. 51. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRACTICA #09: CONTROL DE CALIDAD HIGIENICA DE LA LECHE: PRUEBA DE LA REDUCTASA CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA ALUMNO : ROJAS GARCÍA, HOLMER CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  52. 52. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN: La leche es un excelente medio de cultivo para el crecimiento microbiano, gracias a su elevada actividad de agua, su pH (6.4 – 6.6) y su abundante cantidad y calidad y calidad de nutrientes. Esto exige unas rigurosas normas de higiene tanto en su producción como en su tratamiento. La leche aunque proceda de vacas sanas y se haya obtenido en las mejores condiciones higiénicas, siempre está contaminada con microorganismos en mayor o menor grado. Los microorganismos que se encuentran en la leche tienen tres orígenes: el interior de la ubre, el exterior de los pezones y sus alrededores próximos, y el ordeño y los utensilios que se utilizan normalmente para manipular la leche. Normalmente, se trata de gérmenes saprofíticos del pezón y de los canales galactóforos, como micrococos, estreptococos lácticos y lactobacilos. En caso de enfermedad del animal, se pueden presentar otros microorganismos patógenos y peligrosos desde el punto de vista sanitario, por ejemplo, los agentes de la mastitis tales como: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Corinebacterium bovis, etc. Por otra parte, entre los microorganismos patógenos para el ser humano procedentes de animales se encuentran Mycobacterium bovis, M. Tuberculosis, Brucella abortus, etc. El análisis microbiológico de la leche proporciona datos muy útiles que reflejan las condiciones en las que se han obtenido y conservado. Los recuantos bacterianos elevados no inician necesariamente que la leche contenga bacterias patógenas, peri revelan intensa contaminación o temperaturas de conservación defectuosas. Toda vez que la leche fresca es un producto perecedero, no puede controlarse alicando criterios microbiológicos porque, indudablemente, el alimento habrá sido distribuido y probablemente consumido antes de conocer los resultados de los análisis microbiológicos. Por lo tanto, para tener una idea de la calidad de la leche, se recurre a la prueba de reducción de colorante (prueba de la reductasa), una prueba para la determinación rápida de la calidad higiénica de la calidad de la leche fresca. Los métodos de reducción de colorantes (prueba de la reductasa) dependen de la capacidad de los microorganismos para alterar el potencial de oxido reducción de la leche. Consecuentemente miden la actividad de los microorganismos más que su número presente en la muestra. Entre los colorantes más apropiados figura el azul de metileno y la resazurina. La cantidad de tiempo necesaria para reducir el colorante depende de la cantidad y de la actividad de las bacterias que se encuentran en la muestra, siendo más corto este tiempo
  53. 53. cuanto mayor sea el número de bacterias presentes. Existen, sin embargo, otros factores importantes, como son: la naturaleza de la muestra, el medio utilizado y el tipo de bacteria presente. Uno de los indicadores de oxido reducción que se emplea para la prueba de la reductasa, es el azul de metileno, que en su forma oxidada es azul y en su forma reducida es incoloro. II. OBJETIVOS: 1. Determinar la calidad higiénica de la leche fresca empleando azul de metileno como indicador de óxido reducción. 2. Familiarizar al estudiante con la realización de la prueba de la reductasa. III. MATERIAL. 1. BIOLÓGICO: - Leche 2. DE LABORATORIO: - Tubos de 150x15 mm con tapones de jebe o tapa rosca. - pipetas de 1 y 10 mL. - Gradilla de acero inoxidable. 3. EQUIPOS: - Baño maría regulado a 35-37ºC. 4. COLORANTE: - Solución de azul de metileno al 2.5% de la solución madre. IV. PROCEDIMIENTO: 4.1 CONTROL POSITIVO: Pipetear 1 mL de agua destilada estéril y 10 mL de leche hervida a un tubo estéril. Invertir el tubo suavemente sin agitar. 4.2 CONTROL NEGATIVO: Pipetear 1 mL de azul de metileno y 10 mL de leche hervida a un tubo estéril. Invertir el tubo suavemente sin agitar.
  54. 54. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 4.3 TUBO CON MUESTRA PROBLEMA: 1. Pipetear 1 mL de azul de metileno y 10 mL de leche cruda a un tubo estéril. Invertir el tubo suavemente sin agitar. 2. Colocar todos los tubos en una gradilla y llevarlos a baño marçia a 35- 37 ºC. 3. Realizar la primera lectura a los 30 minutos. Ver si hay decoloración (reducción) del azul de metileno. 4. Cada 30 minutos invertir los tubos que no muestren reducción y colocarlos en posición normal en el baño. 4.4 INTERPRETACIÓN: Durante la incubación se observan cambios de color, dependiendo del tiempo transcurrido desde el inicio de la incubación hasta decoloración completa. Se considera el inicio de la reducción por comparación de los tubos que contienen la muestra con el tubo negativo y como decoloración completa a la comparación con el tubo que indica el final de la reducción (tubo positivo) ó si presentan color blanco a partir de 0.5 cm debajo de la superficie. Cualquier vestigio o residuo de color en el fondo del tubo carece de valor si no se extiende hacia arriba más de 5 mm. Los tubos en que ha comenzado la decoloración deben permanecer en el baño sin invertir hasta que la decoloración sea completa, los demás tubos deben invertirse una vez para redistribuir la crema superficial en la leche y se vuelven a colocar al baño maría. La inversión excesiva debe evitarse desde el momento que origina la reoxidación del azul de metileno y en consecuencia invalida el resultado. TABLA DE CALIFICACIÓN DE LA LECHE CRUDA (Según Ratto, 1983) Más de 4 horas Muy buena A De 3 a 4 horas Buena B Más de 30 minutos y Menos de 3 horas Aceptable C
  55. 55. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT IV. ESQUEMA DE TRABAJO: El siguiente experimento se dividió en 2 partes: con leche hervida y leche sin hervir.  Leche hervida: En este caso se procedió a hervir la leche y luego a tomar 10 ml de leche y colocarlo en 1 tuvo. A continuación se procedió a hacer la prueba de la reductasa agregando el azul de metileno en el tubo, para luego ser llevado a baño maría por 30 minutos.  Leche sin hervir: En este caso se utilizo la leche sin hervir, el procedimiento es el mismo que en el caso anterior. En el presente grafico se muestran los dos pasos seguidos:  Para el caso de leche hervida el procedimiento sigue el siguiente esquema:
  56. 56. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT  Para el caso de leche sin hervir o cruda el procedimiento sigue el siguiente esquema: V. RESULTADOS: El resultado fue el siguiente: Nosotros trabajamos con leche cruda, en ambos tubos puestos a incubar a 30 – 37ºC, decimos que los dos tubos pertenecientes al control positivo que contenía la leche cruda, el color azulino viró a blanco después de media hora lo que indicaba que la leche no era aceptable para el consumo (no apta para el consumo humano), tal como indica la tabla de calificación de la leche cruda. Si se hubiese esperado más tiempo quizás se hubiese visto como resultado final que la leche realmente si era no apta para el consumo humano, con lo cual hubiéramos perdido tiempo en el análisis. En nuestro experimento se trabajo con leche cruda únicamente, en la anterior figura apreciamos que los dos tubos de ensayos a los cuales se le agregó azul de metileno y se les llevó a incubar a Tº de 30 – 37ºC, viro el color a blanco, esto nos indica que no es apta para el consumo humano
  57. 57. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VI. COMENTARIOS: No cabe duda que el análisis de la leche es de gran importancia para determinar la calidad de esta y esto debido a que el consumo de esta en especial de aquellas que provienen directamente de las vacas suelen estar expuestas a muchos agentes de contaminación que pueden hacer que esta resulte ser dañina para el consumidor. También es muy importante este análisis en leche a usarse en la elaboración de productos industriales de consumo masivo para la obtención de un buen producto final. VII. CUESTIONARIO: 1º. ¿Cuáles son los factores de los que depende la variación del potencial oxido reducción de la leche, durante la prueba de la reductasa? Entre los factores tenemos:  El medio utilizado.  El tipo de bacteria que se va a detectar.  La naturaleza de la muestra. 2º. ¿Cuáles son las precauciones que se deben de tener durante la prueba de la reductasa? Se deben de tener las siguientes precauciones:  No se debe de exponer a la luz solar porque es oxidante.  No se debe de agitar el tubo problema.  Se debe de observar la muestra cada 20 minutos.  El agua no debe de exceder la cantidad de la leche en el tubo.  Se debe de estar atento al viraje de la muestra analizada. 3º. ¿En que otros tipos de alimento se puede realizar la prueba de la reductasa? Se pueden realizar no solo en la leche sino en todos los productos derivados de la leche como queso, yogurt, etc. 4º. ¿Cuáles son las limitaciones que presenta los métodos de reducción de colorantes? Sus limitantes son:  La naturaleza de la muestra.  El método utilizado.  El tipo de bacteria presente.
  58. 58. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRÁCTICA # 12 – CONTROL DE ESTERILIDAD MICROBIOLÓGICA DE CONSERVAS CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA INTEGRANTES : CAVA SALINAS, MARCO GASTAÑADUÍ VÁSQUEZ, ROBERTO GUEVARA ENRIQUEZ, JUAN LEÓN PICÓN, BRUCE NEIRA BERNALES, JORGE PUGLISEVICH SALAZAR, JUAN ROJAS GARCÍA, HOLMER CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  59. 59. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN: La incidencia de daños en alimentos enlatados es baja, pero cuando ocurre debe ser investigada apropiadamente. Las latas hinchadas indican que el producto está dañado. Durante el daño las latas pueden ir de normales a saltadoras, lanzadoras, a levemente hinchadas, y fuertemente hinchadas. Como fuere que el daño microbiano no es la única causa de latas anormales, el sobrellenado, el mal sellado, las abolladuras o el cerrado al frío pueden ser también las responsables. El desarrollo microbiano y el hidrógeno producido por la interacción del ácido del alimento con los metales de la lata, son las principales fuentes de hinchazón. Algunos microorganismos que crecen en los alimentos enlatados no producen gas y por lo tanto no causan una apariencia anormal de la lata, no obstante causan daño en el producto. El daño es causado por el crecimiento de microorganismos es, usualmente, debido a fugas o a un proceso deficiente. El agua de enfriamiento contaminada a veces fluye hacia el interior a través de agujeros a costuras pobres e introduce la bacteria que causa el daño. Una microflora mixta de cocos viables y bacilos bacterianos es indicadora de escapes, los que pueden ser usualmente confirmados con un examen de la lata. Un proceso deficiente puede ser causado por una cocción deficiente; por operaciones rutinarias que fallan por la inexactitud o el funcionamiento inapropiado de algún equipo o por excesiva contaminación del producto para el cual, los procesos normalmente adecuados son insuficientes; por cambios en la formulación o tratamiento del producto que resulta en un producto más viscoso o en un empaque más compacto en el envase, con la consecuente prolongación del tiempo de penetración del calor, o, a veces por desviaciones accidentales de las operaciones de rutina. Cuando la lata contiene un producto dañado el proceso o los microorganismos causantes del daño han podido morir durante el almacenamiento. Las latas con procesos deficientes o con fugas son de mayor importancia y ambas plantean riesgos potenciales para la salud. Normalmente si se encuentran Clostridium botulinum (esporas, toxina o ambas), el riesgo es obvio. Las latas intactas que contienen sólo bacilos mesófilos, Gram positivos formadores de esporas serán consideradas deficientemente procesadas, a menos que se pruebe lo contrario. Se debe determinar que la lata esté intacta (costuras comercialmente aceptables y sin microfugas) y que otros factores que pueden conducir a un proceso deficiente, como el peso drenado y la formulación del producto, hayan sido evaluados.
  60. 60. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT El número de latas examinadas bacteriológicamente deberá ser suficientemente grande como para obtener resultados confiables. Cuando la causa del daño está definida puede ser adecuado analizar 4-6 latas, pero en algunos casos puede ser necesario analizar 10 a 15 latas antes de que la causa del daño sea determinada. En ocasiones especiales, estos procedimientos no pueden producir toda la información requerida y tiene que trazarse test adicionales para recolectar los datos necesarios. Puede examinarse bacteriológicamente latas no dañadas para determinar la presencia de organismos viables pero latentes. II. OBJETIVOS: - Familiarizar al estudiante de Ingeniería Agroindustrial con el análisis, que son muy frecuentes en el campo alimentario. III. MATERIAL. 1. BIOLÓGICO: - Lata de conserva (Graté, fruta en almíbar, puré, etc.) 2. DE LABORATORIO: - Abrelatas. - Placas petri estériles. - Papel de filtro. - Embudo. - Tubos de ensayo - Jabón, cepillo, toalla estéril. - Gradilla. -Espátula. 3. MEDIOS DE CULTIVO: - Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI). - Agar nutritivo. - Agar casoy. - Agar cisteinado. 4. EQUIPOS: - Estufas reguladas a: 37 º C y 55 º C - Cámara de flujo laminar. 5. COLORANTES: - Azul de metileno, cristal violeta ó colorante Gram.
  61. 61. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT 6. Otros: - Parafina. IV. PROCEDIMIENTO. 4.1 TOMA DE MUESTRA: Se debe seleccionar un número representativo de envases de cada lote. Llevar al laboratorio para su análisis previa identificación. 4.2 PRE – INCUBACIÓN (Latas normales): a. Remover etiquetas. b. Con el lapicero marcador transferir subnúmeros al lado de la plata para ayudar en el hallazgo correlativo con los códigos. c. Marcar las etiquetas de tal forma que puedan ser repuestas en su posición original en la lata para ayudar a localizar defectos indicados por tintes en la etiqueta. d. Separar todas la latas por números codificados y registrar tamaño del envase, código, producto, condición evidencia de escapes, agujeros o mohos, abolladuras, curvados u otra anormalidad, y todas las marcas de identificación en la etiqueta. e. Antes de observar las latas para su clasificación, asegurarse de que ellas estén a temperatura ambiente. f. Lavar las latas con abundante agua y jabón y sacr bien las superficies de la misma. Incubar las latas entre dos hojas de papel de filtro, una a 55 º C por 10 días y la otra a 35 º C por 3 o 4 semanas. g. Si durante la incubación de las latas se presentaran manifestaciones de crecimiento microbiano, ejemplo, abombamiento o microfugas, retirar las latas con tales alteraciones y proceder a su examen. 4.3 APERTURA DE LA LATA: Abrir la lata en una cámara de flujo laminar a. Latas con hinchazón leve, latas con hinchazón fuerte y latas saltarinas. b. Latas lanzadoras y planas. c. Siembra. d. Examen microscópico. e. Lectura.
  62. 62. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT V. ESQUEMA DE TRABAJO: En el presente experimento se utilizo 2 latas de conservas de atún a las cuales se les retiro en primer lugar la etiqueta, ya que esta por ser la que mas contacto tiene con las manos de las personas es la que tiene la mayor cantidad de microorganismos patógenos. Una vez hecho esto se procedió a lavar las latas con detergente, esto ante la ausencia de a jabón, pero que también sirvió como desinfectante. Luego se envolvieron con papel para evitar que se vuelvan a contaminar. Luego fueron guardados a una Tº de 37-38 ºC x 21 días para una de las latas y a la otra a 55ºC x 10 días. Esto para detectar a los microorganismos anaerobios y aerobios que se pudieran encontrar en las conservas. En el siguiente grafico se puede observar el proceso:
  63. 63. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VI. RESULTADOS: - Anaerobio  3 (–) No cumple con el control de esterilidad por los aerobios. Al encontrar 2 probablemente se acepte, pero 3, ya es inaceptable. - Aerobio  3 (+)
  64. 64. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VII. COMENTARIO: Ha sido muy interesante el analizar microbiológicamente una conserva, ya que estas muchas veces por su apariencia externa suelen dar la apariencia de encontrarse en buen estado, pero en realidad al interior de esta se pueden llegar a producir una gran variedad de alteraciones que son nocivas para la salud del consumidor. VIII. CUESTIONARIO: 1º. ¿Qué diferencia hay entre esterilidad biológica y esterilidad comercial?  En la esterilidad biológica debe de existir ausencia total de microorganismos. También decimos que elimina a todos los microorganismos existentes en el producto, como patógenos y viables, a temperatura desde 60ºC hasta 90ºC.  En la esterilidad comercial debe de existir toda ausencia de formas vegetativas de bacterias. De igual modo para este caso decimos que elimina sólo a los microorganismos causantes del deterioro del producto almacenado 2º. Defina control de estabilidad y cuál es su interpretación: Es aquella que le da la vida útil al producto y se interpreta como el tiempo de inhibición de microorganismos que no son capaces de desarrollar. Se dice que es el resultado de la autorregulación, la cual depende del grado de complejidad y heterogeneidad del ecosistema. La estabilidad de un ecosistema es relativa, ya que se encuentra en un equilibrio dinámico, en el cuál los consumidores bióticos, se van adaptando a las variaciones bióticas y abióticas del medio. Cuando el hombre lo permite, los sistemas evolucionan hacia una mayor estabilidad. 3º. ¿Cuando se considera que un producto es estable comercialmente y estable microbiológicamente? Se da cuando la esterilidad comercial y la esterilidad biológica están en forma paralela y cumplen sus objetivos. También se lleva a cabo cuando el producto responde óptimamente a las condiciones de almacenamiento a los que se somete, sin producirse alteraciones de ningún tipo.
  65. 65. Facultad de Ciencias Agropecuarias Escuela Académico-Profesional de Ingeniería Agroindustrial PRÁCTICA # 13: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CEREALES Y PRODUCTOS DERIVADOS CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI. DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA INTEGRANTES : CAVA SALINAS, MARCO GASTAÑADUÍ VÁSQUEZ, ROBERTO GUEVARA ENRIQUEZ, JUAN LEÓN PICÓN, BRUCE NEIRA BERNALES, JORGE PUGLISEVICH SALAZAR, JUAN ROJAS GARCÍA, HOLMER CICLO : VII TRUJILLO – PERÚ 2008
  66. 66. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT I. INTRODUCCIÓN: Se la denominación de cereal a las plantas gramíneas y a sus frutos maduros, enteros, sanos y secos, que debido a sus características, en la mayoría de los casos los cereales no pueden ser consumidos tal como se producen en la naturaleza, sino que tienen que estar previamente transformados. El consumo de cereales enteros con fines nutricionales es excepcional en nuestro medio, salvo el caso del arroz y en menor medida el del maíz. Lo habitual es que los cereales sean molidos y transformados en harina para elaborar un gran número de productos. Las características físico químicas de los cereales, tal como su escaso contenido acuoso, impide la multiplicación bacteriana en el interior del grano y limita mucho la proliferación de mohos, siempre que se hayan recolectado en buenas condiciones higiénicas, se hayan desecado rápidamente hasta alcanzar una actividad de agua que impida la absorción de humedad. En la práctica, todas estas premisas a veces no se cumplen y puede observarse con relativa frecuencia crecimiento de mohos. Entre ellos, los que provocan una mayor preocupación son los productores de micotoxinas. El procesado que pueden sufrir los granos y las harinas es muy variable y esta circunstancia también afectará a los niveles de mohos presentes en estos alimentos. La enumeración de mohos en semillas y harinas puede proporcionar datos muy útiles para decidir en qué alimentos formularse y en cuáles no. Las salmonellas son contaminantes reconocidos de semillas y harinas de oleaginosas, así como de concentrados (por ejemplo semillas de soja). A pesar del tratamiento térmico antes de su consumo, pueden ser fuente de contaminación con salmonellas. Bacillus cereus es un microorganismo del suelo y se le considera un contaminante inevitable de harinas y granos de cereales. Aunque la cantidad de de B. cereus en estos alimentos puede controlarse y reducirse en cierta medida mediante el lavado de los granos, su eliminación total resulta imposible. Es muy frecuente detectar bacterias termófilas esporuladas en harinas y, sobre todo, en almidones; estas bacterias pueden causar la alteración de los alimentos enlatados cuando la temperatura de almacenamiento sobrepasa los 37 ºC. Las variantes mucoides de Bacillus subtilis y B. licheniformis, son las bacterias causantes del ahilado del pan las que más preocupan en la industria de la panificación.
  67. 67. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT El protocolo de análisis microbiológico de cereales y productos derivados influye: 1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables (RTBAMV). 2. Recuento de enterobacteriáceas totales. 3. Recuento de E. Coli. 4. Recuento de B. cereus. 5. Investigación de Salmonella y, 6. Recuento de mohos y levaduras. Los límites recomendados para cereales y harina de cereales son: Mohos, entre 102 a 104, salmonella, debe de estar ausente; B cereus, 103/gramo. II. OBJETIVOS: 1. Determinar la calidad microbiológica de harinas que se consumen en nuestro medio. 2. Familiarizar al estudiante con la toma de muestra, transporte y análisis de una muestra de harina. III. MATERIAL. 1. BIOLÓGICO: - Muestra de cereal (grano o harina) 2. DE LABORATORIO: - Placas petri estériles. - Pipetas de 1 mL. - Asa extensora de vidrio. 3. MEDIOS DE CULTIVO: - Agar selectivo para B. cereus. - PCA (Agar cuanta gérmenes). - OGA (Agar Glucosa Oxitetraciclina). - Solución Salina Fisiológica Peptonada (SSFP) 4. EQUIPOS: - Estufas reguladas a: 35 º C y 37 º C - Autoclave. - Contador de Québec.
  68. 68. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT IV. PROCEDIMIENTO: 4.1 TOMA DE MUESTRA: Las muestras de granos o harinas se deben recepcionar en bolsas de plástico de primer uso y trasladadas al laboratorio para su análisis. 4.2 TRANSPORTE DE LA MUESTRA. Mayormente no se necesita mayor cuidado, sin embrago, debe cuidarse que no haya contaminación adicional. 4.3 ANÁLISIS DE LA MUESTRA: 1. Homogeneizar adecuadamente la muestra. 2. Pesar 25 gramos y preparar una dilución al 1/100 en SSFP. 3. Preparar las diluciones decimales que sean pertinentes, en SSFP. 4. Efectuar las siguientes determinaciones: a) Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas. Mediante el Método de Recuento en Placa en PCA. b) Recuento de B. cereus. Mediante el Método de Recuento en Placa en Agar Selectivo para Bacillus cereus. c) Recuento de Mohos y levaduras. Mediante el Método de Recuento en Placa en OGA.
  69. 69. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT V. ESQUEMA DE TRABAJO: Se coloca 45 ml de agua peptonada en una botella para luego agregarle 5 g. de avena. Luego se le agita y se deja reposar. A continuación se toma 0.1 ml de esta muestra y se le coloca en una placa petrix que contiene oxitetraciclina (sirve como inhibidor de bacterias). En el siguiente esquema se muestra el proceso: Homogeneizamos adecuadamente la muestra, posteriormente pesamos 25 gramos y preparamos las diluciones 1/10, para efectuar nuestras respectivas determinaciones.
  70. 70. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VI. RESULTADOS: Como podemos observar en las figuras que representan los resultados, se realizó un Recuento en Placa en PCA, para hacer un recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas presentes en nuestro cereal, el cual resulto en 120 u.f.c/ gramos de producto. También Se realizó Mediante el Método de Recuento en Placa en OGA, un recuento de Mohos y Levaduras presentes en nuestro cereal, el cual resulto en la presencia de 4 colonias de hongos. VII. COMENTARIOS: Es de importancia para un estudiante de Ingeniería Agroindustrial saber la metodología del proceso que conlleva el análisis microbiológico de cereales y productos derivados, dado que en el procesamiento que requiere un cereal para ser transformado se dan lugar condiciones que influyen con relativa frecuencia al crecimiento de mohos. Entre ellos los que provocan una mayor preocupación son los productores de micotoxinas, es allí donde este conocimiento cumple efecto proporcionando una solución preventiva que nos puede ser muy benéfica en varios aspectos.
  71. 71. Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT VIII. CUESTIONARIO: 1. Cuál es la importancia de detectar bacterias termófilas esporuladas en cereales y harinas: Porque estas pueden formar enterotoxinas como las esporas de B. cereus que resisten al tratamiento térmico y afectan el sistema digestivo del hombre produciendo la gastroenteritis al consumirlas y que las encontramos en los cereales y arroz mal refrigerados. 2. En que tipos de productos derivados de cereales se justifica la investigación de staphylococcus aureus: En el pan, pasteles con relleno, galletas, pastas, etc. Que han sido mal refrigeradas. 3. Haga un breve comentario sobre la importancia de microorganismos en granos de cereales: Es importante el estudio de estos puesto que gran parte de estos están relacionados con bacterias termófilas resistentes a tratamientos térmicos y que hacen de los cereales y sus derivados, fuentes de cultivo y posteriormente causantes de fuertes enfermedades en sus principales consumidores que son las personas.

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