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Doseamento microbiologico

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Treinamento sobre doseamento microbiológico.

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Doseamento microbiologico

  1. 1. Todos os direitos reservados - 2012
  2. 2. INTRODUÇÃO A potência (atividade) de um agenteantimicrobiano é determinada comparando-se a dose que inibe o crescimento do microrganismo sensível com a dose da preparação padrão do agente que produz inibição similar. Click Farna– E-learning farmacêutico
  3. 3. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA DOSAGEM DE ANTIBIÓTICOSo Método da diluição em série o Macrodiluição o Microdiluiçãoo Método turbidimétricoo Método de difusão em ágar Click Farna– E-learning farmacêutico
  4. 4. DILUIÇÃO EM SÉRIE - MACRODILUIÇÃOResposta: “tudo ou nada” MIC Click Farna– E-learning farmacêutico MIC
  5. 5. DILUIÇÃO EM SÉRIE - MICRODILUIÇÃO Click Farna– E-learning farmacêutico
  6. 6. DILUIÇÃO EM SÉRIEPotência Testa-se concomitantemente padrão e amostra: P = CIMA X 100 CIMP Para maior precisão, ensaia-se concentrações intermediárias entre o tubo com concentração inibitória mínima e o imediatamente anterior. Click Farna– E-learning farmacêutico
  7. 7. DILUIÇÃO EM SÉRIEVantagenso Mais sensível a baixas concentrações que outros métodoso Fornece a CIM ativa da substância analisadaDesvantagenso A precisão está relacionada ao intervalo de concentração utilizadao Há interferência de soluções turvas ou coradaso Há necessidade do padrão e amostra serem estéreisNÃO É MUITO UTILIZADO Click Farna– E-learning farmacêutico
  8. 8. MÉTODO TURBIDIMÉTRICOo Baseia-se na inibição do crescimento microbiano medido através da turbidez (transmitância ou absorvância) da suspensão de microrganismos adequados/sensíveis ao composto contido em um meio com o antibiótico.o A resposta do microrganismo é função direta da concentração da substância. Click Farna– E-learning farmacêutico
  9. 9. MÉTODO TURBIDIMÉTRICOPadronização do microrganismo para utilização no doseamento 35 2 ºC 20-24 h 25% transmitância 530 nm + Sol. fisiológica 35 2 ºC 20-24 h Click Farna– E-learning farmacêutico
  10. 10. MÉTODO TURBIDIMÉTRICO Progressão geométrica Triplicata Click Farna– E-learning farmacêutico
  11. 11. MÉTODO TURBIDIMÉTRICO35 2 ºC3 a 4 horas 0,5 mL de formaldeído 12% Click Farna– E-learning farmacêutico Λ = 530 nm
  12. 12. MÉTODO TURBIDIMÉTRICOPotência P Calcula-se a potência através de métodos estatísticos Click Farna– E-learning farmacêutico
  13. 13. MÉTODO TURBIDIMÉTRICOVantagensMais rápidoDesvantagenso O pH pode influenciar o crescimento do microrganismoo Há interferência de soluções turvas ou coradas (padrão e amostra não devem precipitar em contato com o meio)o Padrão e amostra devem ser solúveis em água ou em solventes miscíveis em concentração tal que não interfira no crescimentoo Há necessidade do padrão e amostra serem estéreis (substâncias termolábeis não podem ser ensaiadas por esta técnica) Click Farna– E-learning farmacêutico
  14. 14. DIFUSÃO EM ÁGARConsiderações gerais Relaciona o tamanho da zona de inibição com a dose da substância ensaiada. O método emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído em placas, em sistema de bicamada, através do qual a substância teste se difunde. É fundamentalmente um método físico, no qual o microrganismo é usado como revelador. Mas está sujeito a muitos outros fatores físicos e químicos além da simples interação entre o fármaco e o microrganismo: Natureza do meio Capacidade de difusão Tamanho da molécula Estabilidade da amostra É essencial que se trabalhe com réplicas, de forma a compensar os desvios, inerentes ao ensaio ou acidentais. Click Farna– E-learning farmacêutico
  15. 15. DIFUSÃO EM ÁGARMétodo- Testes preliminares A partir de parâmetros especificados em ensaios anteriores e referentes a determinação da potência de antibióticos descritos pela Farm. Bras. IV, USP e FDA, são realizados testes preliminares para padronizar as condições a serem utilizadas verificando parâmetros como: Microrganismo Concentração do inóculo Meio de cultura Concentração do fármaco Solução diluente Click Farna– E-learning farmacêutico
  16. 16. DIFUSÃO EM ÁGAREnsaio do tipo quantitativo: 2X2 5X1 P A1 A5 A1 A2 A2 A4 P1 P2 3X3 A3 P1 A1 A3 P3 P2 A2 Click Farna– E-learning farmacêutico
  17. 17. DIFUSÃO EM ÁGARCultura de manutenção Repique deve ser feito a cada 7 dias Conservação: refrigerador a 4 ºC Click Farna– E-learning farmacêutico
  18. 18. DIFUSÃO EM ÁGARRepique do microrganismo para utilização no doseamento 35 2 ºC 20-24 h 25% transmitância 580 nm + Sol. fisiológica 35 2 ºC 20-24 h Click Farna– E-learning farmacêutico
  19. 19. DIFUSÃO EM ÁGAR Preparo das placas Papel de filtro 21 mL Ágar 4 mLÁgar inoculado (47 ºC) Click Farna– E-learning farmacêutico
  20. 20. DIFUSÃO EM ÁGAR Ensaio Utilizando placas de Petri, em capela de fluxo laminar, transfere-se 21,0 mL de meio para cada placa (camada base). Após a solidificação desta camada, adiciona-se 4,0 mL de meio inoculado. Assim que esta camada se solidificar, distribuir os cilindros ou templates de aço inoxidável. Com auxílio de pipetador automático transfere-se as alíquotas de padrões e amostras, 200 µL, para cada orifício. P1A1 A3 As placas devem ser incubadas a 35ºC 2ºC e após 18-20 horas medem-se os diâmetros dos halos de inibição com auxílio de um paquímetro.P3 P2 A2 Click Farna– E-learning farmacêutico
  21. 21. DIFUSÃO EM ÁGARPreparo das placas Click Farna– E-learning farmacêutico
  22. 22. DIFUSÃO EM ÁGARPreparo das soluções padrão e amostra 10mg do padrão primário ou o equivalente em relação ao peso médio [100µg/mL] BV 100mL 0,8mL 1,6mL 3,2mL BV 10mL BV 10mL BV 10mL [8µg/mL] [16µg/mL] [32µg/mL] Click Farna– E-learning farmacêutico
  23. 23. DIFUSÃO EM ÁGARE. coli B. subtilis Diâmetro do halo é função da concentração do antibiótico •Relação linear: diâmetro do halo (mm) X log da concentração S. luteus Click Farna– E-learning farmacêutico
  24. 24. DIFUSÃO EM ÁGARA maneira como o antibiótico é colocado em contato com o meiode cultura define as seguintes técnicas utilizadas para difusão emágar: técnica de cilindros em placas técnica de orifícios ou poçinhos técnica de disco ou papel técnica de gotas ou depósito em superfície Click Farna– E-learning farmacêutico
  25. 25. DIFUSÃO EM ÁGAR – CILINDROS EM PLACACilindros de vidro, porcelana, aço inoxidável, alumínioetc Diâmetro interno: 6,0 mm 0,1 mm Diâmetro externo: 8,0 mm 0,1 mm Altura: 10,0 mm 0,1 mm Click Farna– E-learning farmacêutico
  26. 26. DIFUSÃO EM ÁGAR – TEMPLATE OU MOLDES DE AÇOo São moldes de aço inoxidável com orifícios nos quais são colocados as soluções padrão e amostrao É o mesmo princípio da técnica cilindros em placa, porém o manuseio é mais prático Click Farna– E-learning farmacêutico
  27. 27. DIFUSÃO EM ÁGAR – ORIFÍCIOS OU POÇINHOSo São perfurados pequenos poços no meio de cultura através de instrumento adequado de maneira que forme um cilindro embutido no meio sólidoo Os halos podem ser irregulares se o instrumento que servirá para a construção dos orifícios não for padronizado Click Farna– E-learning farmacêutico
  28. 28. DIFUSÃO EM ÁGAR – DISCO DE PAPELo Discos de papel com 13 mm de diâmetroo 60 µLo Solução P e A com pipeta ou imersão por tempo pré definidoo Os discos podem ser colocados manualmente com auxílio de pinça estéril sobre a superfície do meio ou através de equipamento apropriado sobre o meio inoculadoo Amostra com alta concentração de solvente orgânico Click Farna– E-learning farmacêutico
  29. 29. DIFUSÃO EM ÁGAR – GOTAS OU DEPÓSITO EM SUPERFÍCIEo Adiciona-se 2 a 3 µL da solução P e A na superfície do ágar com microsseringao Permite automaçãoo Pouco utilizadoo A superfície do gel deve estar seca Click Farna– E-learning farmacêutico
  30. 30. DIFUSÃO EM ÁGARVantagenso Em todas as técnicas deste método as amostras não precisam estar estéreiso As técnicas de cilindro e de orifício mostram-se mais sensíveis à pequenas concentrações que a de discoo Técnica de disco é mais simples, rápida e de melhor precisão, além de permitir o ensaio com altas concentrações de solvente orgânicoDesvantagenso As técnicas de cilindro e de orifício são mais trabalhosas e necessitam de cuidados extremos no manuseio das placaso Suspensões interferem nas técnicas de cilindro e de disco Click Farna– E-learning farmacêutico
  31. 31. DIFUSÃO EM ÁGARFatores que interferem no ensaio: Conteúdo de água presente no meio Qualidade do ágar Densidade do inóculo pH do meio e das soluções utilizadas Tempo e temperatura de incubação Forma ativa da substância Coeficiente de difusão da substância e velocidade de crescimento do microrganismo Halos pequenos: deixar a substância difundir antes de incubar Halos grandes: incubar as placas antes de colocar as amostras Click Farna– E-learning farmacêutico
  32. 32. DIFUSÃO EM ÁGARCálculo dos resultados Pot = Antilog M x 100M = F/b b = E/I I = log R F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)] E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)] Click Farna– E-learning farmacêutico
  33. 33. DIFUSÃO EM ÁGARCálculo dos resultados P1 P2 P3 A1 A2 A3 I 14,0 15,5 16,4 13,2 15,2 17,0 II 13,0 15,3 16,6 13,3 15,0 16,3 III 13,0 15,2 16,4 13,2 15,0 16,0 IV 13,2 15,4 16,6 13,1 15,3 16,4 V 13,0 15,0 16,6 13,2 15,2 16,2 VI 13,2 15,4 16,2 13,2 15,1 16,6 Soma 79,4 91,8 98,8 79,2 90,8 98,5 Média 13,23 15,30 16,47 13,20 15,13 16,42 Click Farna– E-learning farmacêutico
  34. 34. DIFUSÃO EM ÁGARCálculo dos resultados - exemploI = log R (R=2) E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)] b = E/II = log 2 E = ¼[(32,88-26,43)] b = 1,6125/0,301I = 0,301 E = 1,6125 b = 5,3571 F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)] M = F/b F = 1/3[(44,75-45,00)] M = -0,0833/5,3571 F = -0,0833 M = -0,01556 Pot = Antilog M x 100 Pot = Antilog -0,01556 x 100 Pot = 96,49% Click Farna– E-learning farmacêutico
  35. 35. CONCLUSÃOo A necessidade de confirmação da eficácia terapêutica dos produtos medicamentosos constitui-se em aspecto de preocupação. E ainda há que se considerar o aspecto econômico, assim como o de falsificação com moléculas estruturalmente similares.o Os bioensaios são extremamente necessários para que se tenha um controle de qualidade eficaz destes antimicrobianos de uso tão difundido. Click Farna– E-learning farmacêutico
  36. 36. Todos os direitos reservados - 2012

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