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E
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LINEAMIENTOS VIGILANCIA POR LABORATORIO DE DENGUE- 2013

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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR
LABORATORIO DE DENGUE
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2013
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Versión No. 02 Julio 2013
Primera edición, 2013
DENGUE–RNLSP
Este documento fue avalado por los representantes de las
instituciones que conforman el Grupo Técnico Interinstitucional del
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TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY,
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“LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE DENGUE”
VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2013.
COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE:
ISBN: EN PROCESO
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICO.
PROLONGACIÓN DE CARPIO 470, COL. SANTO TOMÁS DEL. MIGUEL HIDALGO, C. P.
11340, MÉXICO, D. F.
TEL. (55)53-42-75-50
WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX
LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE:
EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE:
IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
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Versión No. 02 Julio 2013
SECRETARÍA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ
SECRETARIO DE SALUD
DR. PABLO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. CUITLÁHUAC RUÍZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DEL INDRE
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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. DIANA ALEX FLORES ROMERO
SUBDIRECTOR DE OPERACIÓN
QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS
M EN C MAYRA GISELA MELÉNDEZ HERNÁNDEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
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LINEAMIENTOS PARA LA
VIGILANCIA POR
LABORATORIO DE DENGUE
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2013
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN .....................................................................................................................7
ANTECEDENTES.....................................................................................................................7
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE DENGUE.............9
MARCO LEGAL........................................................................................................................9
OBJETIVO GENERAL...........................................................................................................10
OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................................10
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA
VIGILANCIA DE DENGUE ..................................................................................................10
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE DENGUE ................................12
FUNCIONES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL .............................12
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD PÚBLICA (LESP) 13
DEFINICIONES OPERATIVAS............................................................................................14
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS .....................................................................15
ALGORITMO DIAGNÓSTICO .............................................................................................17
ESTÁNDAR DE CALIDAD....................................................................................................26
CAPTURA DE RESULTADOS ..............................................................................................28
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO...................................31
CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO............................................34
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO.................................................................................35
INDICACIONES ESPECIALES PARA LOS LABORATORIOS ESTATALES QUE AÚN
NO REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E
IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE..............................................35
LABORATORIOS ESTATALES QUE YA REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN
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DENGUE..................................................................................................................................36
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ...................................................................................37
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................39
ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS...............41
BIOLOGÍA MOLECULAR.....................................................................................................58
ANEXO II. CARACTERÍSTICAS DE LOS ESTUCHES COMERCIALES .......................73
ANEXO III. FORMATO PARA ENVÍO DE MATERIAL BIOLÓGICO AL InDRE ........77
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Lineamientos 2013 vigilancia LABORATORIO DENGUE

  • 1. Dengue–RNLSP/InDRE Página 1 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE DENGUE DGE-InDRE–RNLSP 2013
  • 2. Dengue–RNLSP/InDRE Página 2 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Primera edición, 2013 DENGUE–RNLSP Este documento fue avalado por los representantes de las instituciones que conforman el Grupo Técnico Interinstitucional del Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica (CoNaVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY, © INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE DENGUE” VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2013. COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICO. PROLONGACIÓN DE CARPIO 470, COL. SANTO TOMÁS DEL. MIGUEL HIDALGO, C. P. 11340, MÉXICO, D. F. TEL. (55)53-42-75-50 WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
  • 3. Dengue–RNLSP/InDRE Página 3 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 SECRETARÍA DE SALUD DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ SECRETARIO DE SALUD DR. PABLO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD DR. CUITLÁHUAC RUÍZ MATUS DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DEL INDRE
  • 4. Dengue–RNLSP/InDRE Página 4 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO LIC. DIANA ALEX FLORES ROMERO SUBDIRECTOR DE OPERACIÓN QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS M EN C MAYRA GISELA MELÉNDEZ HERNÁNDEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA M. EN C. MAURICIO VÁZQUEZ PICHARDO COORDINADOR DE ENFERMEDADES VIRALES ZOONÓTICAS Y POR VECTOR
  • 5. Dengue–RNLSP/InDRE Página 5 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE DENGUE DGE-InDRE–RNLSP 2013
  • 6. Dengue–RNLSP/InDRE Página 6 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 ÍNDICE INTRODUCCIÓN .....................................................................................................................7 ANTECEDENTES.....................................................................................................................7 RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE DENGUE.............9 MARCO LEGAL........................................................................................................................9 OBJETIVO GENERAL...........................................................................................................10 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................................10 ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE DENGUE ..................................................................................................10 FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE DENGUE ................................12 FUNCIONES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL .............................12 FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD PÚBLICA (LESP) 13 DEFINICIONES OPERATIVAS............................................................................................14 TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS .....................................................................15 ALGORITMO DIAGNÓSTICO .............................................................................................17 ESTÁNDAR DE CALIDAD....................................................................................................26 CAPTURA DE RESULTADOS ..............................................................................................28 PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO...................................31 CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO............................................34 BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO.................................................................................35 INDICACIONES ESPECIALES PARA LOS LABORATORIOS ESTATALES QUE AÚN NO REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE..............................................35 LABORATORIOS ESTATALES QUE YA REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE..................................................................................................................................36 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ...................................................................................37 BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................39 ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS...............41 BIOLOGÍA MOLECULAR.....................................................................................................58 ANEXO II. CARACTERÍSTICAS DE LOS ESTUCHES COMERCIALES .......................73 ANEXO III. FORMATO PARA ENVÍO DE MATERIAL BIOLÓGICO AL InDRE ........77
  • 7. Dengue–RNLSP/InDRE Página 7 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 INTRODUCCIÓN Las enfermedades virales transmitidas por vector están ubicadas como las enfermedades a nivel mundial con mayor repercusión en Salud Pública. Actualmente la Organización Mundial de la Salud (OMS) cataloga a las Arbovirosis como problema prioritario en Salud y en 1998 son consideradas como la décima causa de muerte en el mundo por enfermedades infecciosas. La OMS estima que los cuatro serotipos del virus del dengue constituyen una amenaza para el 40% de la población mundial que habitan en 112 países tropicales y subtropicales. Actualmente se considera que existen 50 millones de casos en todo el mundo, de los que aproximadamente 400,000 son casos graves y 25,000 fallecen a causa de esta enfermedad. En el Continente Americano el Dengue tiene un surgimiento importante en los servicios de salud desde 1989, donde el número de casos aumentó un 60% en comparación con el lustro anterior. En México es la principal enfermedad viral transmitida por vector. El Dengue es una enfermedad febril, transmitida por hembras hematófagas del género Aedes aegypti, la enfermedad es de curso autolimitado, incapacitante y con riesgo de complicaciones letales; la cual se puede presentar de manera benigna conocida como Fiebre por Dengue (FD) y de manera grave conocida como Fiebre Hemorrágica por Dengue (FHD). El presente documento establece los lineamientos de operación para la Vigilancia Epidemiológica basada en Laboratorio para Dengue, los cuales incluyen funciones y responsabilidades por nivel; toma, manejo, y envío de muestras, así como las metodologías para el análisis de muestras, evaluación del desempeño, banco de muestras así como los estándares de calidad. ANTECEDENTES La conformación de la Red de Diagnóstico de Dengue se inició en 1995 con 7 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP). El Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) ha ofrecido a esta Red cursos de capacitación, capacitaciones en servicio, supervisiones y asesorías, incluyendo el apoyo con equipo e insumos en caso de emergencias epidemiológicas y desastres. También se apoya a los LESP con el envío de reactivos e insumos para realizar la determinación de anticuerpos IgM, anticuerpos IgG y para detección de antígeno viral NS1 comerciales. Desde 1999 el Laboratorio inició un programa de control de calidad en el que la Red enviaba al InDRE el 100% de las muestras positivas y 10% de las muestras negativas para Dengue. En el 2002 la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) se incorporó al Programa Caminando a la Excelencia para evaluar el desempeño de los LESP respecto a los programas prioritarios de la salud para fomentar su desarrollo. En el año 2003 se empieza a realizar la evaluación del desempeño a través del envío de paneles de eficiencia y se establece el envío únicamente de probable Fiebre Hemorrágica por Dengue o Dengue Grave para control de calidad o en su caso muestras con serotipo no identificado en los últimos años en el estado. Esta evaluación del desempeño se actualiza y mejora, implementando paneles algorítmicos en julio de 2012, que
  • 8. Dengue–RNLSP/InDRE Página 8 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 evalúa de manera integral el desempeño de cada LESP con respecto al algoritmo de diagnóstico vigente y a partir de 2013 serán incluidos los paneles algorítmicos únicos. Durante abril del 2008 el Laboratorio implementa un nuevo algoritmo de diagnóstico que incluye la detección de antígeno NS1 (glicoproteína no estructural 1 del virus dengue) en formato de Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA); metodología que es aplicable en muestras obtenidas únicamente en fase aguda de la enfermedad y que tiene el objetivo de brindar resultados oportunos y confiables. Los resultados positivos de esta metodología, son aprovechados para realizar la Vigilancia Virológica (tipificación del virus) en un porcentaje de muestras mediante la Prueba de Retro-transcripción y de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-qPCR) en tiempo real. En marzo de 2010, el Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos del InDRE, capacitó al personal de 28 laboratorios estatales que conforman la RNLSP para dar a conocer el protocolo “Detección y Serotipificación de Virus Dengue Mediante RT-PCR Multiplex en tiempo real” validado por el Centro de Control y Prevención de Enfermedades, División Dengue [CDC, por sus siglas en Inglés-Dengue Branch] de San Juan Puerto Rico, con la finalidad de que cada LESP realice la vigilancia virológica en su entidad. El seguimiento a la implementación de esta metodología se realizó mediante la aplicación de una cédula. Trece LESP iniciaron la etapa de control de calidad para RT-PCR tiempo real para Dengue durante el 2011: Baja California Sur, Chiapas, Guerrero, Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Tabasco, Chihuahua, Sonora, Jalisco, Veracruz y Yucatán. A partir de 2012 se incorporaron 6 LESP a la Red de Vigilancia Virológica de Dengue (Michoacán, Campeche, Sonora, Sinaloa, Zacatecas y Guanajuato), contando hasta ahora con 21 LESP. Actualmente todos los estados antes mencionados cuentan con la metodología liberada, debido a que cumplieron con los parámetros de concordancia requeridos por el Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos (promedio de 95% de concordancia en fase de control de calidad y en paneles de evaluación externa del desempeño (PEED). Los LESP de Nayarit y Colima actualmente están en fase de control de calidad con resultados del más del 99.5% de concordancia, motivo por el cual en los siguientes meses recibirán la notificación de liberación de la metodología. El LESP de Hidalgo comenzó en julio de 2013 la fase de control de calidad, obteniendo un resultado del 100% de concordancia en el PEED “SMART-ONLY-DEN” 2013-01. Al momento actual el LESP de Chihuahua, ya cuenta con la implementación de la técnica, pero por ser un estado no endémico y por no tener muestras positivas al antígeno NS1, la liberación de la técnica estuvo basada en la aplicación de un panel para la evaluación externa del desempeño, mismo que obtuvo un resultado sobresaliente (90-100% de concordancia); este mismo lineamiento aplicará para aquellos LESP que estén en la misma situación como actualmente se encuentra el LESP de Durango quien obtuvo 100% de concordancia en el PEED “SMART- ONLY-DEN” 2013-01. En caso de que él porcentaje de concordancia del panel no cumpla con los requerimientos, el método no será liberado. Esto último permitirá que dichos estados tengan habilitados los métodos analíticos las herramientas para poder utilizarlos ante cualquier contingencia, al presentarse casos positivos de NS1. Todos los LESP con metodología molecular liberada son capaces de realizar la vigilancia intencionada directamente en mosquitos
  • 9. Dengue–RNLSP/InDRE Página 9 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 trasmisores del virus (vigilancia entomo-virológica). Esta última deberá ser realizada en completa coordinación con el InDRE (Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos y el Laboratorio de Entomología), el Programa de Control de Vectores Nacional y Estatal. RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE DENGUE Los estados de color rojo son aquellos que cuentan con la metodología implementada de RT- PCR Múltiplex en tiempo real y los estados de color blanco están en fase de implementación. Estrella color azul indica la implementación de aislamiento viral. Los estados de color verde cuentan con la detección serológica básica mediante detección de antígeno NS1 y anticuerpos IgM, y/o IgG. Fig. 1. Marco analítico para diagnóstico serológico y molecular de dengue (31 estados) MARCO LEGAL 1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF 05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012. 2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012. 3. NORMA Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica. DOF: 19/02/2013
  • 10. Dengue–RNLSP/InDRE Página 10 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección ambiental-salud ambiental-residuos peligrosos biológico-infecciosos- clasificación y especificaciones de manejo. 5. NORMA Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006. 6. Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010 para la Vigilancia Epidemiología, Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por Vector. 7. Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 19 de enero de 2004, última reforma publicada DOF 10 de enero de 2011 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico por Laboratorio de Fiebre por Dengue (FD) y Fiebre Hemorrágica por Dengue (FHD). OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Brindar información oportuna y veraz al Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE).  Establecer el manejo adecuado de la información generada por laboratorio, para la toma de decisiones y acciones a través de RNLSP.  Realizar una rectoría a nivel nacional respecto al diagnóstico por laboratorio para Dengue, que indique claramente funciones y responsabilidades en cada nivel.  Conformar una RNLSP para Dengue, con personal altamente capacitado y con metodologías de actualidad, capaz de responder oportunamente cualquier contingencia a nivel nacional. ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE DENGUE El marco analítico de la RNLSP para el diagnóstico de esta enfermedad está conformado por el diagnóstico serológico (31 LESP realizan determinación de anticuerpos IgM y determinación de antígeno NS1; 23 realizan también determinación de IgG, como marcador de reinfecciones activas, únicamente en regiones endémicas); todos los LESP tienen liberadas las tres metodologías serológicas. Dos LESP (Sonora y Veracruz) realizan aislamiento viral e identificación de serotipos por Inmunofluorescencia y actualmente 21 LESP tienen implementada y liberada la vigilancia virológica mediante RT-PCR en tiempo real.
  • 11. Dengue–RNLSP/InDRE Página 11 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Actualmente los estados de Coahuila, Edo de México, y Puebla, están en fase de implementación y control de calidad de la vigilancia virológica mediante RT- PCR. Los estados de Aguascalientes, Baja California y Tlaxcala, debido a la ausencia del vector, no son entidades consideradas para la implementación de la vigilancia virológica; en el D.F., el InDRE lleva a cabo cualquier identificación de casos importados que viajaron a zonas endémicas de la enfermedad.
  • 12. Dengue–RNLSP/InDRE Página 12 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Fig. 2 Flujo de trabajo de la RNLSP para el diagnóstico de Dengue FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE DENGUE FUNCIONES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL El Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos del InDRE, es el Laboratorio Nacional de Referencia y el rector normativo para el Diagnóstico de Dengue en México. Las funciones que le competen son las siguientes:  Proporcionar servicios confiables de diagnóstico, referencia y control de calidad de Dengue, dentro de los estándares de servicio indicados y ser el laboratorio de excelencia y líder.  Coordinar la RNLSP de Dengue, mediante un verdadero análisis de la información generada.  Promover una visión objetiva y autocritica, que permita la detección de áreas de oportunidad para implementar mejoras continuas en la determinación de anticuerpos IgM, IgG y antígeno NS1, aislamiento y detección molecular de dengue y otros Arbovirus.
  • 13. Dengue–RNLSP/InDRE Página 13 de 77 Versión No. 02 Julio 2013  Mantener y mejorar algoritmos de diagnóstico y referencia.  Incorporar nuevas metodologías para el diagnóstico diferencial de Dengue y otros Arbovirus.  Reglamentar los criterios de interpretación de resultados, que permitan generar resultados confiables para la toma de decisiones.  Monitorear continuamente el desempeño de la Red Nacional de Laboratorios de Diagnóstico de Dengue, mediante la aplicación del PEED.  Realizar capacitación en servicio para la formación de recursos humanos altamente capacitados en el diagnóstico de Dengue.  Supervisar y asesorar directamente a los LESP.  Desarrollar investigación operativa y desarrollo tecnológico que sea aplicable, en apoyo al SINAVE. FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD PÚBLICA  Realizar procesos analíticos para la detección de infecciones causadas por Dengue.  Asegurar la calidad del diagnóstico en el laboratorio, mediante los procedimientos, métodos y técnicas que el InDRE promueve.  Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio.  Referir muestras al InDRE para diagnóstico, referencia y control de calidad.  Referir muestras de banco de sueros al InDRE, para mantener los PEED.  Generar evidencia y notificar oportunamente al órgano normativo estatal y/o nacional los casos confirmados y descartados.  Participar como mecanismo de apoyo técnico, proporcionando la información relacionada y requerida por el programa sustantivo del área de su competencia.  Seleccionar las muestras para control de calidad del área de influencia del LESP.  Compilar las muestras de las Jurisdicciones y redes de apoyo.  Capacitar a epidemiólogos estatales, jurisdiccionales y a todo personal o institución del Sector Salud que lo demande en relación a toma, manejo y envío de muestras a través del monitoreo del desempeño en el área de influencia.  Recabar, analizar y evaluar la información sobre la prestación de servicios de diagnóstico de Dengue en su estado.  Supervisar el manejo del equipo asignado conforme a lo establecido en los documentos autorizados y manuales de operación correspondiente para el aseguramiento de la calidad en la red estatal.  Proporcionar información de importancia mediante informes, notas informativas o reportes para que sea difundida a las instancias estatales y nacionales correspondientes contribuyendo a la Vigilancia Epidemiológica Estatal y Nacional de manera veraz y oportuna.  Promover capacitación continua de su personal.  Colaborar y/o elaborar trabajos de investigación operativa que proporcione información prioritaria estatal, una vez que los protocolos sean aceptados por los comités de investigación.
  • 14. Dengue–RNLSP/InDRE Página 14 de 77 Versión No. 02 Julio 2013  Participar en la elaboración y actualización de los manuales técnicos referentes a diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos, etc.) para uso en el ámbito estatal y local. DEFINICIONES OPERATIVAS Para los propósitos de la vigilancia epidemiológica se han elaborado definiciones operacionales de caso, a efecto de unificar los criterios para la detección, notificación y clasificación de los casos de Dengue. La especificidad del diagnóstico está dada por los estudios de laboratorio, por lo que es importante contar con los resultados virológico, serológicos y de gabinete para el adecuado seguimiento del caso hasta su clasificación final. Según los lineamientos para la Vigilancia Epidemiológica de Fiebre por Dengue y Fiebre Hemorrágica por Dengue, las definiciones operativas son las siguientes: Vigilancia Epidemiológica Es el estudio permanente y dinámico del estado de salud en la población y tiene como propósito presentar opciones para la toma de decisiones. Desde el punto de vista operativo incluye la recopilación, procesamiento y análisis de los daños y riesgos en salud. Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE) Corresponde a la Dirección General Adjunta de Epidemiología (DGAE) coordinar la elaboración de las normas y procedimientos para la vigilancia epidemiológica correspondiente. El SINAVE capta, registra y analiza datos de morbilidad, mortalidad y daños y riesgos a la salud en este caso, específicamente para Dengue a través del Sistema Único de Información para la Vigilancia Epidemiológica (SUIVE), apoyado a su vez en: - La notificación semanal de casos nuevos de enfermedades - Los sistemas especiales de vigilancia epidemiológica - El Sistema Epidemiológico Estadístico de las Defunciones (SEED) Caso sospechoso de Fiebre por Dengue o Dengue no Grave Toda persona de cualquier edad que resida o proceda de una región en la que haya transmisión de la enfermedad y que presente cuadro febril inespecífico o compatible con infección viral. Caso probable de Fiebre por Dengue o Dengue Grave Todo caso sospechoso que presente fiebre y dos o más de las siguientes características: cefalea, artralgias, mialgias, exantema, dolor reto-ocular. En menores de 5 años, el único signo a considerar puede ser la fiebre. Caso confirmado de Fiebre por Dengue o Dengue no Grave Todo caso probable en el que se confirme infección reciente por virus de Dengue mediante técnicas de laboratorio, esté asociado epidemiológicamente a otro caso confirmado o no se disponga de resultado de laboratorio.
  • 15. Dengue–RNLSP/InDRE Página 15 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Caso probable de fiebre hemorrágica por Dengue o Dengue grave Toda persona que además de un cuadro probable de fiebre por Dengue, desarrolle fiebre y una o más de las siguientes características: datos de fuga de plasma, o datos de fragilidad capilar, o hemorragias, o trombocitopenia menor a 100,000 plaquetas por mm3 o hemoconcentración con uno a más de los siguientes datos: incremento del hematocrito en un 20% o más en la fase aguda; decremento de hematocrito en al menos 20% después del tratamiento: tendencia del hematocrito en muestra secuenciales (por ejemplo 40, 43, 45 etc.); relación hematocrito/hemoglobina sugestivo 3.2 a 3.4, indicativo 3.5 o mayor; o hipoalbuminemia. Caso confirmado de fiebre hemorrágica por Dengue o Dengue grave Toda persona con cuadro probable de fiebre hemorrágica por Dengue confirmado por laboratorio que además presente lo siguiente: Datos de fuga de plasma, con al menos los siguientes datos: Clínica - Edema, piel moteada, ascitis o derrame pleural Laboratorio – Elevación en 20% en etapa aguda o disminución del 20% en etapa de convalecencia o elevación del hematocrito o hemoglobina en forma secuencial (a partir del tercer día) o hipoalbuminemia. Gabinete – Ultrasonido (líquido perivisceral y en cavidad abdominal o torácica) u radiología (derrame pleural o ascitis). Datos de fragilidad capilar, prueba de torniquete positiva (petequias, equimosis, hematomas), trombocitopenia menos a 100000 plaquetas por mm3. Caso probable de Síndrome de Choque por Dengue (SCHD) o Dengue Grave Toda persona con cuadro de FD o FHD y que presente súbitamente datos de insuficiencia circulatoria, alteraciones en el estado de conciencia, tensión arterial disminuida o estado de choque profundo. Caso confirmado de Síndrome de Choque por Dengue o Dengue Grave Todo caso probable de SCHD en el que se confirme infección reciente por virus dengue mediante técnicas de laboratorio. TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS Para el diagnóstico por laboratorio de Dengue es necesario contar con suero del paciente, el cual es obtenido a través de una muestra de sangre completa extraída por venopunción, en una cantidad aproximada de 5 mililitros sin usar anticoagulante; 2.5 mL de suero serán obtenidos aproximadamente, los cuales deberán enviarse al LESP inmediatamente para realizar los ensayos correspondientes[1]. La muestra debe mantenerse siempre en refrigeración de 2- 1 El sistema básico de triple embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar,
  • 16. Dengue–RNLSP/InDRE Página 16 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 8° C desde el momento después de la toma hasta su llegada al LESP. La muestra deberá venir acompañada con el Formato Único de Envío de Muestras del InDRE, o con el Formato de Enfermedades Transmitidas por Vector o en su caso con el Formato de Informe de Seguimiento de Fiebre por Dengue y Dengue Hemorrágico el cual se genera automáticamente de la plataforma para Dengue, debidamente completados, sin datos alterados o sobre escritos y si es el caso, es conveniente que se indique la gravedad del paciente; las muestras que no cumplan con los requisitos establecidos en el Manual para la Toma, Envío y Recepción de Muestras (REMU-MA-01), serán rechazadas sin ninguna excepción. Como todos los estados ya capturan en el “Sistema de Plataforma Única para Dengue” se tiene que adjuntar un listado nominal de las muestras enviadas, indicando el folio del Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE), de lo contrario las muestras no serán aceptadas. De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010, para la Vigilancia Epidemiológica, Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por Vector, las técnicas alternativas para confirmar o descartar un caso probable en los primeros días de haber iniciado con la fiebre (0-5 días) es detectar y tipificar al virus mediante técnicas virológicas (aislamiento viral en cultivo de células e identificación por inmunofluorescencia indirecta) o moleculares (RT- PCR en tiempo real o punto final). A finales del año 2006, apareció una alternativa analítica en formato de ELISA más fácil, rápida y oportuna para aplicar en los primeros días de evolución. Esta técnica se basa en la identificación de la glicoproteína no estructural 1 del virus dengue (NS1), implicada en los procesos de replicación viral, la cual es secretada por el virus, lo que permite su detección en la muestra de suero en fase aguda de la enfermedad. Esta técnica tiene reportada una sensibilidad entre el 80-100% (dependiente del serotipo y genotipo responsable de la infección, además de la presencia de altas concentraciones de anticuerpos IgM o IgG) y una especificidad de 100% y que conjuntamente con las técnicas comerciales ya existentes para determinación de IgM (sensibilidad de 94.7% y especificidad del 97.2%) y para determinación de IgG de segundas infecciones o reinfecciones por serotipos distintos (sensibilidad del 94.5% y especificidad del 97.3%) serán las pruebas consideradas como básicas en la realización del nuevo algoritmo. Para realizar los tres ensayos inmunoenzimáticos se necesita contar con: un gabinete de bioseguridad tipo II, un lector de ELISA para placas completas con biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8° C. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete.
  • 17. Dengue–RNLSP/InDRE Página 17 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 un filtro de 450 nanómetros (nm) y otro de referencia entre 600-650 nm, un lavador para placas completas, una incubadora o baño María (28-37° C) y micropipetas multicanales y sencillas con diferentes volúmenes variables, además de todo el material requerido no incluido en los estuches de diagnóstico. Los procedimientos se deben realizar como lo indican los insertos correspondientes para poder cumplir con la validación de cada ensayo. Es importante aclarar que las muestras a procesar por cualquiera de éstas técnicas se manejen en estricta red fría, es decir que no deben permanecer a temperatura ambiente; para lo cual se sugiere sacar las muestras del refrigerador hasta el momento de realizar cada procedimiento y una vez terminado el uso de las mismas, se deben mantener almacenadas a 4° C. De ser posible, se recomienda que para el manejo de las muestras (ya sea al momento de rotularlas, usarlas en cada técnica y separar en alícuotas) se coloque la gradilla sobre una cama de hielo o de refrigerantes congelados. En caso de manejar un gran número de muestras por corrida (arriba de 50), deberá hacerse en bloques de 25 o 30 muestras para asegurar la red fría y se deberán cambiar los congelantes y el hielo durante cada bloque. El énfasis para el manejo de muestras en estrictas condiciones de red fría, radica en aumentar las posibilidades de aislamiento viral y detección de material genético, ya que los cambios de temperatura promueven la degradación de las proteínas de superficie de la partícula viral así como evitar la degradación del ARN del virus, que es altamente termolábil e inestable. ALGORITMO DIAGNÓSTICO La propuesta del algoritmo para el diagnóstico de Dengue deriva de tres premisas básicas: 1) La necesidad de mejorar el porcentaje de casos confirmados por laboratorio con respecto de los casos probables utilizando una sola muestra. 2) La necesidad de contar con un diagnóstico oportuno, que promueva una completa y mejor vigilancia virológica en el país. La implementación del algoritmo apoyará el Programa Nacional de Prevención y Control del Dengue al contar con información veraz, oportuna y de calidad para iniciar las intervenciones adecuadas, e 3) Identificar aquellas muestras que no son Dengue y promover el diagnóstico diferencial. El algoritmo propuesto fue consensuado en cuatro diferentes reuniones celebradas en México entre los laboratorios de la RNLSP y el InDRE. También fue sometido a la crítica de expertos internacionales en la reunión: American Dengue Prevention Board–Dengue Surveillance, celebrada en la Ciudad de México del 17 al 19 de enero de 2008. Durante los días 26 al 29 de febrero del mismo año, se realizó, en instalaciones del InDRE, el Taller teórico-práctico para la Implementación del nuevo algoritmo para el diagnóstico por laboratorio para Dengue, el cual fue dirigido a los 31 laboratorios estatales que conforman la RNLSP. Los últimos comentarios se discutieron durante la visita de Evaluación del Programa Nacional de Control y Prevención del Dengue en México por parte de la Organización Panamericana de la Salud, del 24 de marzo al 2 de abril de
  • 18. Dengue–RNLSP/InDRE Página 18 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 2008. La solicitud por parte del InDRE a la RNLSP fue iniciar la implementación del algoritmo a partir del mes de abril de 2008. Este algoritmo involucra la calidad y la oportunidad de la información generada por el componente de laboratorio que coadyuva en la prevención y control del Dengue; el algoritmo se muestra en la siguiente figura: Fig. 3. Algoritmo de diagnóstico por laboratorio para Dengue Clave de tabulador: 1A3512001, 1A3512002, 1A3512003 y 1A3512004 El algoritmo involucra tres metodologías serológicas básicas (NS1, IgM e IgG). La determinación de antígeno NS1 aplica únicamente en fase aguda de la enfermedad, La determinación de anticuerpos IgM e IgG es aplicada en la fase aguda y convaleciente. La Vigilancia virológica deberá ser aplicada en al menos el 10% de las muestras de FD NS1+ y en el 100% de las FHD NS1+ en los LESP que tengan liberada la metodología y para los que no deberán enviarlas al InDRE para tipificación. Todas las muestras para Diagnóstico diferencial deberán cumplir con definición de caso para cada agente etiológico a estudiar.
  • 19. Dengue–RNLSP/InDRE Página 19 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 El algoritmo diagnóstico serológico inicia con:  Muestras recibidas en el laboratorio entre 0-5 días de haber iniciado la fiebre. Determinación del antígeno viral (NS1) por ELISA (Platelia BIORAD, Catálogo 72830 o Early ELISA NS1 Inverness Medical Innovations, Catálogo E-DEN02P) Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. En este momento se da por terminado el algoritmo. No se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado (a excepción del serotipo identificado por RT-PCR, si es que fue seleccionada para la vigilancia virológica). El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 1.0 unidad. Negativo: El laboratorio reportará el resultado y se realizará la siguiente prueba indicada en el algoritmo: ELISA para IgG (cuando la muestra tenga 0-3 días de iniciada la fiebre) o ELISA para IgM (cuando la muestra tenga de 4-5 días de iniciada la fiebre). Determinación de IgM por ELISA (Panbio No. catálogo E-DEN01M), únicamente para las muestras que tengan entre 4-5 días de haber iniciado la fiebre. Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. En este momento se da por terminado el algoritmo. No se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 11.0 unidades. Negativo: El laboratorio reportará el resultado y realizará la determinación de IgG. Determinación de IgG por ELISA (Panbio, No. de catálogo E- DEN02G), únicamente para muestras que estén entre 0-3 días, infección reciente (infecciones secundarias). Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. Este resultado precisa que bajo el diseño de la prueba, permitir identificar concentraciones muy altas del marcador a analizar, que representan infección reciente y activa como sinónimo de una reinfección por dengue pero por un serotipo diferente al de la primera infección. El laboratorio reportará este resultado. En este momento se da por terminado el algoritmo. No se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 22.0 unidades. Negativo: El laboratorio reportará este resultado, asegurando que todas las pruebas antes mencionadas fueron realizadas y tuvieron un resultado negativo. En este momento se da por terminado el algoritmo. El valor reportado que representa a un negativo es menor o igual a 18.0 unidades.
  • 20. Dengue–RNLSP/InDRE Página 20 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Una muestra negativa a las tres pruebas previas se considera negativa a Dengue y se deberá realizar diagnóstico diferencial para otras Arbovirosis, las muestras serán enviadas al InDRE con base en el diagnóstico clínico y previa solicitud de Vigilancia Epidemiológica Estatal (para casos graves y defunciones), ya sea para identificación de flavivirus no Dengue o alfavirus como: Virus del Oeste del Nilo (VON), Encefalitis de San Luis (ESL), Fiebre Amarilla (FA), Encefalitis Equina del Oeste (EEO), Encefalitis Equina del Este (EEE), Encefalitis Venezolana (EEV) y virus Chikungunya (CHIKV); además de EFE’s, Leptospira, Rickettsias o Hantavirus (en caso de signos hemorrágicos). En noviembre del 2012 la RNLSP recibió la capacitación para iniciar la realización del diagnóstico diferencial serológico y molecular de Arbovirosis y con esto comenzar a implementar la “ARBO-RED” en México. Ante casos de fiebre icterohemorrágica, se sugiere realizar diagnóstico diferencial con Fiebre Amarilla a personas que viajaron a zonas endémicas. En zonas endémicas para leptospira se sugiere realizar la prueba rápida al mismo tiempo que se inicie con el algoritmo de Dengue. Una vez que se cuente con los diagnósticos implementados se ofrecerán al Sistema de Vigilancia Epidemiológica y en el momento que esté lo considere pertinente, se realizara en el InDRE la detección ampliada para otras familias de Arbovirus identificados en las Américas, como Bunyanvirus (virus Oropuche, La Crosse), Arenavirus hemorrágicos (virus Machupo, Guaranito, Junin, Lassa).  Muestras recibidas en el laboratorio con ≥6 días de haber iniciado la fiebre Se inicia el proceso con: Determinación de IgM por ELISA. Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado, en este momento se da por terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 11.0 unidades. Negativo: El laboratorio reportará el resultado y realizará la siguiente prueba indicada en el algoritmo. En este caso será determinación de IgG. Determinación de IgG por ELISA. Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. Este resultado precisa que bajo el diseño de la prueba, permitir identificar concentraciones muy altas del marcador a analizar, que representan infección reciente y activa como sinónimo de una reinfección por dengue pero por un serotipo diferente al de la primera infección. El laboratorio reportará únicamente este resultado, en este momento se da por terminado el algoritmo. NO se realizará ninguna otra prueba, ni se reportará ningún otro resultado. El valor reportado que representa a un positivo es mayor o igual a 22.0 unidades. Negativo: El laboratorio reportará este resultado, asegurando que todas las pruebas antes mencionadas fueron realizadas y tuvieron un resultado negativo.
  • 21. Dengue–RNLSP/InDRE Página 21 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 En este momento se da por terminado el algoritmo. El valor reportado que representa a un negativo es menor o igual a 18.0 unidades. Una muestra negativa a las dos pruebas previas se considera negativa a Dengue y se deberá realizar diagnóstico diferencial, las muestras serán enviadas a InDRE con base en el diagnóstico clínico y previa solicitud de vigilancia epidemiológica estatal (para casos graves y defunciones), ya sea para identificación serológica de flavivirus no Dengue o alfavirus como: Virus del Oeste del Nilo, Encefalitis de San Luis, Fiebre Amarilla, Encefalitis del Oeste, del Este, Venezolana y Virus Chikungunya; además de EFE’s, Leptospira, Rickettsias o Hantavirus (en caso de signos hemorrágicos). Ante casos de fiebre icterohemorrágica, se sugiere realizar diagnóstico diferencial con Fiebre Amarilla a personas que viajaron a zonas endémicas. En zonas endémicas para leptospira se sugiere realizar la prueba rápida al mismo tiempo que se inicie con el algoritmo de Dengue. Se pueden solicitar que se realicen otros diagnósticos según las necesidades que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica considere pertinentes. En dado caso que se obtengan resultados “indeterminados” por alguna de las técnicas mencionadas anteriormente se procederá de la siguiente forma: Indeterminado para determinación de NS1 por ELISA. No se deberá reportar el resultado como indeterminado y se procederá a procesar nuevamente la muestra por duplicado como lo indica el inserto y si se obtiene el mismo resultado (indeterminado), realizar la siguiente prueba indicada en el algoritmo según corresponda. Este resultado deberá ser reportado en plataforma una vez que este activo el campo de resultado indeterminado. Indeterminado para determinación de IgM por ELISA. No se deberá reportar el resultado como indeterminado, y se procederá a procesar nuevamente la muestra por duplicado como lo indica el inserto y si se obtiene el mismo resultado (indeterminado), realizar la siguiente prueba indicada en el algoritmo según corresponda. Este resultado deberá ser reportado en plataforma una vez que este activo el campo de resultado indeterminado. Indeterminado para determinación de IgG por ELISA. No se deberá reportar el resultado como indeterminado, y se procederá a procesar nuevamente la muestra por duplicado como lo indica el inserto y si se obtiene el mismo resultado (indeterminado) se enviará al InDRE para referencia ya que a partir de septiembre se realizara inhibición de la hemaglutinación (IH) y una vez estandarizada la metodología de microneutralización (MNT) se incorporaran las dos metodologías como Referencia para estos resultados. Este resultado deberá ser reportado en plataforma una vez que este activo el campo de resultado indeterminado. El InDRE reportará sus resultados de referencia una vez que en plataforma se encuentren activos los campos para IH y MNT. *Cualquier otra metodología diferente a la indicada y validada por el InDRE para la vigilancia serológica, NO será considerada válida y los resultados obtenidos NO serán avalados, hasta no ser enviadas al InDRE las muestras de interés.
  • 22. Dengue–RNLSP/InDRE Página 22 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 DETERMINACIÓN DE MATERIAL GENÉTICO MEDIANTE RT-PCR MÚLTIPLEX EN TIEMPO REAL Esta determinación aplica únicamente en muestras NS1 positivas que fueron seleccionadas para su tipificación. Si el resultado obtenido es: Positivo: Se reportará el serotipo identificado o serotipos identificados. El laboratorio tendrá que informar el resultado obtenido al remitente de la muestra según sea el caso. Cabe aclarar que las muestras que resulten positivas por RT-PCR Múltiplex en tiempo real ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que se deberá considerar como único caso confirmado. Esta metodología únicamente tiene el objetivo de realizar la vigilancia virológica de serotipos circulantes en México. Negativo: El laboratorio deberá también informar este tipo de resultado. Cabe aclarar que las muestras que resulten negativas por RT-PCR Múltiplex en tiempo real ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que se deberá considerar como único caso confirmado. El estándar de servicio para RT-qPCR es de 3 días. En caso de extrema urgencia, los resultados deberán ser emitidos en 24 horas una vez recibida la muestra en el laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos del InDRE o en el LESP. VIGILANCIA ENTOMO-VIROLÓGICA MEDIANTE RT-PCR EN TIEMPO REAL Esta nueva vigilancia es consecuencia de las necesidades que se identifican por la Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector del InDRE (CEZV-InDRE) y las exigencias que plantea la enfermedad y son el efecto de la implementación de la Epidemiología Inteligente basada en laboratorio que permite coadyuvar con el programa de vectores para lograr una verdadera epidemiologia oportuna y preventiva. Durante 2011 se capacitaron los LESP de Oaxaca, Morelos, San Luis Potosí, Nuevo León, Guerrero, Chiapas, Guanajuato y Zacatecas, los cuales fueron seleccionados por contar con los componentes entomológicos y virológicos. Una vez que otros LESP, hagan llegar al InDRE la indicación de que se cuenta con los dos componentes, estos serán seleccionados para la capacitación de este tipo de Vigilancia. En julio de 2102 se realizó una capacitación vía webex a toda a RNLSP para la implementación de este tipo de técnica. 1. Esta vigilancia será realizada únicamente por aquellos LESP que tengan liberada la metodología de RT-PCR Multiplex en tiempo real y que cuenten con la contraparte entomológica, quienes se harán cargo de la captura y clasificación de los especímenes, los cuales serán entregados en red fría o vivos según sea el caso al área responsable de la vigilancia virológica y estos poder llevar a cabo el macerado y clarificado de los especímenes. Este tipo de vigilancia se realizará en grupos con número de especímenes menores a 30.
  • 23. Dengue–RNLSP/InDRE Página 23 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 2. El tipo de muestra para la vigilancia Entomo-Virológica aunque puede ser de larvas o de mosquitos adultos, esta última es la más indicada. 3. En caso de captura de huevecillos, estos deberán ser cultivados para obtener mosquitos adultos; análisis que servirá para determinar zonas con transmisión vertical. Actualmente la (CEZV-InDRE) está realizando la estandarización de la detección directa en huevecillos. 4. El LESP es el responsable de notificar inmediatamente al InDRE y al Programa de Vectores de los resultados obtenidos, para la toma de acciones pertinentes. 5. Como seguimiento de los resultados, el LESP deberá enviar al InDRE el 100% de sus clarificados positivos y el 10 % de los negativos, esto NO representa un control de calidad, únicamente servirá para tener un banco de clarificados de mosquitos. El control de calidad aplicará cuando se identifique un serotipo diferente al circulante en ese momento. El estándar de servicio será de 5 días una vez que los especímenes sean recibidos en los LESP. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Si el resultado obtenido es: Positivo: Se reportará el serotipo o serotipos identificados. El laboratorio que cuente con la metodología correspondiente, tendrá que informar el resultado obtenido al remitente de la muestra, según sea el caso. Cabe señalar que las muestras que resulten positivas para aislamiento viral, ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que deberá ser considerado como un único caso confirmado. Negativo: El laboratorio deberá también informar el resultado. Cabe mencionar que las muestras que resulten negativas para aislamiento viral, ya habían sido confirmadas mediante determinación de antígeno NS1, por lo que se deberá considerar como un único caso confirmado. *Todos los resultados negativos por esta metodología deberán ser corroborados mediante RT-PCR en tiempo real. *Para aquellos laboratorios que estén realizando aislamiento viral como técnica para la vigilancia virológica de Dengue y que requieran de una evaluación mediante PEED por parte del InDRE, deberán realizar la solicitud por escrito y dirigida a la Dirección de Servicios y Apoyo del InDRE, para que se les asigne un PEED especial para esta metodología. USO DE PRUEBAS RÁPIDAS PARA EL DIAGNÓSTICO Durante situaciones de emergencia, como en las inundaciones hay sitios inaccesibles y el exceso de muestras satura el LESP, por lo que se requiere
  • 24. Dengue–RNLSP/InDRE Página 24 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 contar con un diagnóstico oportuno y confiable y con soporte costo beneficio. Para ello, se propone un algoritmo que permita confirmar casos de una forma rápida y práctica con el uso de pruebas rápidas, las cuales reportan una sensibilidad y especificidad superior al 70%. La decisión de cuándo usar esta prueba será en base al Manual de Vigilancia Epidemiológica y debe ser definido por Vigilancia Epidemiológica Estatal, previa autorización por la Dirección General Adjunta de Epidemiología, del Nivel Federal. Este tipo de metodología deberá ser realizada únicamente por los LESP. En situación normal se deberán realizar las pruebas indicadas en el algoritmo vigente. Los resultados positivos confirmaran caso únicamente y cuando se haya confirmado casos por metodologías de ELISA o moleculares. Prueba rápida Dengue Dúo Cassette (Panbio, No. de catálogo E- DEN01D). Esta prueba está diseñada para analizar los marcadores IgM e IgG y deberá ser utilizada según algoritmo vigente. Si el resultado obtenido es: Positivo: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. Se realizará una selección aleatoria, para que de uno de cada 10 casos positivos se siga el procedimiento del nuevo algoritmo. El resultado se reportará en plataforma una vez que estén activos los módulos de resultado para prueba rápida. Negativo: Se reportará el resultado en plataforma una vez que estén activos los módulos de resultado para prueba rápida. La muestra deberá ser procesada siguiendo el nuevo algoritmo con base en los días de evolución. Prueba rápida SD-Dengue duo (Dengue NS1 y anticuerpos IgM-IgG) (Panbio, No. de catálogo 11FK45 y 46. Una prueba inmunocromatográfica de un paso diseñada para detectar el antígeno del virus del dengue NS1 y los anticuerpos contra el virus del Dengue (Dengue IgG/IgM) de manera cualitativa y diferencial en sangre total, suero y plasma. Es el primer y único producto a nivel mundial con formato para los tres marcadores serológico indicados en el algoritmo vigente. Contrarresta la debilidad de solamente una prueba. Positivo a cualquiera de los tres marcadores: Confirma caso. El laboratorio reportará este resultado. Se realizará una selección aleatoria, para que de uno de cada 10 casos positivos se siga el procedimiento del nuevo algoritmo. El resultado se reportará en plataforma una vez que estén activos los módulos de resultado para prueba rápida. En caso de IgG positivos, estos evidencian la presencia de reinfecciones activas por serotipos diferentes a la primera infección, como en el formato de ELISA. Negativo para los tres marcadores: Se reportará el resultado en plataforma una vez que estén activos los módulos de resultado para prueba rápida. La muestra deberá ser procesada siguiendo el nuevo algoritmo con base en los días de evolución. Si el InDRE tuviera la evaluación de cualquier otra técnica y que cumpliera con los estándares requeridos para ser usada en el diagnóstico de Dengue en México, se informara inmediatamente a los LESP para ser utilizada en la Vigilancia Epidemiológica bajo los estándares del uso de pruebas rápidas.
  • 25. Dengue–RNLSP/InDRE Página 25 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 *Cualquier otra metodología diferente a la indicada y que no esté evaluada por el InDRE y que cumpa con los requerimientos para la vigilancia serológica, NO será considerada válida y los resultados obtenidos NO serán avalados, hasta no ser enviadas al InDRE las muestras de interés.
  • 26. Dengue–RNLSP/InDRE Página 26 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 MUESTRAS DE DEFUNCIONES La Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector del InDRE, con el objetivo de brindar mayor información al CONAVE Estatal y Nacional para una mejor dictaminación de defunciones, realiza la indicación que las muestras de suero de defunciones por probable FHD deberán ser procesadas por los LESP para los tres marcadores; NS1, IgM e IgG, en caso de muestras en fase aguda y para los dos marcadores; IgM e IgG en caso de muestras de fase convaleciente. En caso biopsias postmortem deberán ser analizadas mediante RT-qPCR. Se deben enviar al InDRE únicamente las muestras con resultado negativo para todos los marcadores serológicos o moleculares para Dengue, con la finalidad de realizar diagnóstico diferenciales para otros arbovirus, basándose en el cuadro clínico (hemorrágico, neurológico etc.) Por lo que para el dictamen de defunciones en los Comités de Vigilancia Epidemiológica, Estatal y Nacional (CEVE y CONAVE) se tomarán únicamente los resultados obtenidos en los LESP. Si se presenta el caso, el InDRE notificará los resultados del diagnóstico diferencial a los LESP. Si se requiere el envío de las muestras al InDRE por alguna circunstancia determinada en el CONAVE, se solicitará al LESP el envío de las muestras. Para aquellos laboratorios que obtengan clasificación No aceptable en la evaluación del desempeño, deberán enviar todas las muestras de defunciones al InDRE (100% de positivas y negativas), hasta que la clasificación en la evaluación del desempeño sea aprobatoria y se emita un documento al LESP en cuestión, en donde se le indicará que se suspende el envío de muestras de defunciones ya que el diagnóstico se realizará en el LESP nuevamente. El estándar del servicio para emitir un resultado será de 5 días hábiles ESTÁNDAR DE CALIDAD FASE PRE-ANALÍTICA Esta fase está relacionada con la toma de muestra, manejo y envío de la misma al laboratorio. Para cumplir con esta parte todas las muestras requeridas para realizar la detección de infecciones causadas por cualquiera de los cuatro serotipos del virus dengue, deberán cumplir con las definiciones de caso probable para FD y FHD, además de cumplir con los requisitos establecidos como lo indica el manual de recepción de muestras del InDRE (REMU-MA-01), de lo contrario las muestras serán rechazadas. A continuación se anexa una tabla con el resumen de estas especificaciones. Tabla 1. Especificaciones de las muestras Tipo de muestr a Volumen requerido Condiciones de manejo y envío Condicione s de almacenaje Característ icas Suero Mínimo 500 Tubos tipo eppendorff o crioviales con En estricta refrigeración Sin contaminació
  • 27. Dengue–RNLSP/InDRE Página 27 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 microlitros (µL) capacidad para 2.0 mililitros, etiquetados con nombre y folio. Acompañados con los formatos correspondientes y el oficio de solicitud (2-8° C) n bacteriana o fúngica, no hemolizadas, ni lipémicas Biopsia de hígado, bazo, ganglios, etc. un centímetro cúbico En frascos estériles, con solución salina al 0.85% (solución fisiológica) identificados con nombre y tipo de tejido. Acompañadas con los formatos correspondientes y el oficio de solicitud En estricta refrigeración (2-8° C) No usar formol Muestras de mosquito s (clarifica dos o adultos) 0.5 mL de clarificado o grupos de 30 especímene s adultos Para Clarificados: Tubos tipo eppendorff o crioviales con capacidad para 2.0 mililitros, etiquetados con clave o folio. Para adultos: tubos cónicos de 15 o de 50 mL etiquetados con clave o folio. En ambos casos se deberá enviar los formatos debidamente requisitados, que se indicaron en sesión webex En estricta refrigeración (2-8° C) Clarificado sin evidencias de contaminació n bacteriana o fúngica FASE ANALÍTICA En esta etapa se considera la aplicación del algoritmo de diagnóstico como está indicado, además de cumplir con el tiempo establecido para el reporte de resultados, sin tomar en cuenta la vigilancia virológica hasta finalizar con el algoritmo, es decir hasta la realización de IgG, (si fuera el caso), que será de 3 días hábiles. En caso de emergencia epidemiológica cada LESP deberá elaborar un plan de respuesta rápida en donde se incluya laborar todos los días de la semana. FASE POST-ANALÍTICA
  • 28. Dengue–RNLSP/InDRE Página 28 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 El reporte de resultados deberá ser generado inmediatamente después que se tenga el resultado correspondiente. En caso de estar dentro de la fase de control de calidad para alguna de las metodologías, los resultados deberán ser reportados únicamente cuando el InDRE emita el informe de prueba al LESP correspondiente. Con la única finalidad de conocer a nivel nacional toda la información generada en cada laboratorio y que ésta pueda ser conocida y consultada por las autoridades de este Instituto, para los fines que el Programa Nacional de Vectores y la Dirección General Adjunta de Epidemiología requieran, es obligatorio que se tenga y se aplique correctamente el sistema de información que a continuación se menciona. CAPTURA DE RESULTADOS A partir de esta versión de los lineamientos y con el objetivo de obtener datos de la eficiente aplicación y costos del algoritmo; en común acuerdo con la Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector del InDRE y el Departamento de Vigilancia Epidemiológica de Enfermedades Transmisibles por Vector de la Dirección General de Epidemiología, se deben reportar en plataforma todos los resultados obtenidos según sea el caso. Ejemplo: Para las muestras en fase aguda con menos de tres días de evolución con resultado negativo a NS1 e IgG, se deben reportar los dos resultados, o en caso de un resultado negativo a NS1 y positivo a IgG también se deben reportar los dos, y así según indicaciones del algoritmo vigente. Los resultados obtenidos deberán ser reportados inmediatamente (dentro de las siguientes 24 horas de haber sido obtenidos) en la plataforma única para Dengue, siguiendo las indicaciones del manual de usuario en la plataforma para Dengue, ubicado en el menú principal. La siguiente es la liga para ingresar al portal: www.rhove.gob.mx Información relacionada con la Plataforma Única para Dengue En el caso del reporte en plataforma única para Dengue el LESP, el laboratorio local y el InDRE tienen acceso a este sistema mediante la solicitud de una clave que fue proporcionada por Vigilancia Epidemiológica Estatal o Federal, para reportar los resultados correspondientes. El apartado correspondiente al laboratorio se describe a continuación. Estudios de laboratorio La posibilidad del análisis de laboratorio está en función de las técnicas empleadas para el diagnóstico. Se deberá llenar el procedimiento de laboratorio específico para cada caso, por lo que es necesario ingresar la fecha de toma de la muestra y cada LESP tiene la atribución de ingresar el resultado obtenido, la fecha de recepción de la muestra y la fecha en que se está reportando, así como la obligación de revisar que tenga toda la información que se requiere para poder realizar el diagnóstico de forma oportuna. Las fechas de toma y recepción de muestra, y de resultado son obligatorias. El LESP recibirá el oficio de
  • 29. Dengue–RNLSP/InDRE Página 29 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 solicitud para el diagnóstico junto con el listado de muestras enviadas (con número de folio de identificación para la plataforma y nombre), no se deberán recibir muestras que no tengan el folio de plataforma o algún dato de laboratorio que se requiera para aplicar el algoritmo. Con estos datos el laboratorio realizará la búsqueda en la opción de “seguimiento” al ingresar con su clave en plataforma única, ya habiendo ingresado podrá reportar los resultados obtenidos de cada muestra recibida, por cualquiera de las técnicas siguientes: determinación de NS1, determinación de IgM, determinación de IgG; con base en el algoritmo. También se podrá reportar aislamiento (para aquellos laboratorios que lo realicen), RT-PCR Múltiplex tiempo real o prueba rápida (previa autorización de su uso).La CEZV-InDRE está promoviendo la actualización de la plataforma a partir del primer semestre del 2013 para brindar una mejor calidad de la información. La variable “muestra” se refiere al paciente que ya cuenta con muestra para realizar el diagnóstico por laboratorio. Es importante mantener actualizado este dato ya que la plataforma considera este rubro para estimar el porcentaje de muestreo además del porcentaje de positividad. ELISA para determinación de NS1 1. Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra. 2. Anotar la fecha de recepción de muestra en el LESP una vez que el campo se habilite en plataforma. 3. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado. 4. Seleccionar el resultado: - Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más, a excepción de que posteriormente se agregue el resultado con el serotipo identificado si fuera el caso, cómo se mencionó previamente. Este resultado se debe capturar inmediatamente. - Si resulta negativo se reportará el resultado inmediatamente. El laboratorio deberá realizar la siguiente prueba indicada en el algoritmo. ELISA para determinación de IgM 1. Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra. 2. Anotar la fecha de recepción de muestra en el LESP una vez que el campo se habilite en plataforma. 3. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado. 4. Seleccionar el resultado: - Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más. Este resultado se debe capturar inmediatamente. - Si resulta negativo se reportará el resultado inmediatamente. El laboratorio deberá realizar la siguiente prueba indicada en el algoritmo. ELISA para determinación de IgG
  • 30. Dengue–RNLSP/InDRE Página 30 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 1. Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra. 2. Anotar la fecha de recepción de muestra en el LESP una vez que el campo se habilite en plataforma. 3. Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado. 4. Seleccionar el resultado: - Si resulta positivo se selecciona (+) y NO se reportará nada más. Este resultado se debe capturar inmediatamente. - Si resulta negativo se selecciona (-) y se da por terminado el algoritmo, por lo que se comprueba que todas las pruebas antes mencionadas ya se realizaron y resultaron negativas; por lo tanto el caso se descarta por laboratorio. Recordando que TODOS los resultados antes obtenidos deben ser reportados. Aislamiento viral y RT PCR en tiempo real  En el caso que se requiera ingresar resultados en este rubro la fecha de toma de muestra deberá ser la misma que la fecha que se anotó o seleccionó en el rubro de NS1, ya que será la misma muestra para identificar serotipo.  Anotar la fecha de recepción de muestra en el LESP una vez que el campo se habilite en plataforma.  Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado, que será emitido por el InDRE o por el LESP que tenga implementadas las técnicas para identificar serotipos.  Seleccionar el o los serotipos identificados (1, 2, 3 o 4). Prueba rápida: siempre y cuando esté aprobado el uso de la misma según resultados de sensibilidad y selectividad  Anotar o seleccionar del menú la fecha de toma de muestra.  Anotar la fecha de recepción de muestra en el LESP una vez que el campo se habilite en plataforma.  Anotar o seleccionar del menú la fecha de reporte del resultado.  Seleccionar el resultado (+ o -). * Es responsabilidad del LESP revisar la información que está en la plataforma semanalmente y checar que las muestras asignadas por epidemiología estatal se encuentren en el laboratorio o de lo contrario indicar en el rubro correspondiente que no se tomó la muestra, ya que aparecerán como no realizadas. En su momento se modificará el modulo para verificar que las muestras registradas en verdad son las que se tienen en el LESP. **En el caso de los informes de serotipos identificados, estos serán avalados semanalmente por el InDRE, mediante análisis de datos obtenidos en la Plataforma Única de Dengue y al envío del informe semanal al Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos; el corte se realizará los lunes a las 12:00 horas. Esta información será manejada por el InDRE, la DGAE y el Programa de Vectores, para homogenizar la información que se publicará en el Boletín Semanal de Epidemiologia.
  • 31. Dengue–RNLSP/InDRE Página 31 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO Dentro de los ensayos de aptitud se encuentran los PEED, herramienta que utiliza el InDRE para la evaluación continua de la competencia técnica y la identificación de necesidades de fortalecimiento de un individuo, de un grupo de laboratorio o de las redes de diagnóstico específico mediante el envío a intervalos regulares continuos de paneles de muestras caracterizadas. El uso de los PEED como auxiliares en la evaluación del desempeño de los laboratorios de la RNLSP requiere que operen correctamente y en armonía con los requerimientos de desarrollo de las redes de diagnóstico. La Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector del InDRE ha promovido dentro de este lineamiento para Dengue, los paneles independientes -serológicos y moleculares - los cuales a partir de julio del 2012 se enfocaran como PANELES INTELIGENTES O ALGORITMICOS y a partir del 2013 serán paneles algorítmicos únicos “SMART-ONLY-DEN” donde se evaluará en un mismo panel TODO el algoritmo es decir, se analizarán muestras para serología y biología molecular en el mismo envío del panel, siguiendo las indicaciones e instrucciones para cada muestra y bajo indicaciones del algoritmo de diagnóstico por laboratorio vigente. Laboratorios que pertenecen a la red de Dengue (LESP de apoyo al SINAVE) El procedimiento para estos laboratorios se realizará de la siguiente forma:  Envío de un primer panel de eficiencia (durante el primer semestre del año). Conformado para la determinación de anticuerpos tipo IgM, IgG y antígeno NS1 y tipificación viral según los resultados de muestras identificadas como NS1 positivas, dependiendo de la regionalización del marco analítico en cada LESP.  Envío de un segundo panel de eficiencia (durante el segundo semestre del año) Conformado para la determinación de IgM, IgG y de NS1 y tipificación viral según los resultados de muestras identificadas como NS1 positivas, dependiendo de la regionalización del marco analítico en cada LESP. El formato del panel estará basado en el algoritmo de diagnóstico vigente, en la determinación de los tres componentes serológicos y el molecular, en el cual se pondrá a prueba el marco analítico de cada LESP (paneles inteligentes únicos), lo que significa que a partir del segundo ciclo de la evaluación del desempeño en 2012, se enviaran paneles para evaluar del algoritmo vigente y no metodologías por separado. Se enviaran muestras de suero codificadas, las cuales deberán ser procesadas según el algoritmo, basándose en los días de evolución de la enfermedad que indique el instructivo del laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos. Como se mencionó anteriormente a partir del primer ciclo de paneles del 2013 se incorporará en este tipo de paneles los de NAT-DEN (RT- PCR Multiplex en tiempo real), en los cuales se incluirá la tipificación de virus dengue de aquellas muestras positivas a NS1, tal y como lo indica el algoritmo. Este tipo de panel además evaluará en la metodología molecular, la capacidad de los analistas para obtener datos de pendiente que identifican eficiencia de la reacción y con esto identificar fallas en el pipeteo que puedan promover errores
  • 32. Dengue–RNLSP/InDRE Página 32 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 además de identificar la capacidad de interpretación de curvas de amplificación en muestras con coinfección por dos serotipos. Esto permitirá a la CEZV-InDRE clasificar a algunos LESP como de EXCELENCIA que tendrá el beneficio de participar activamente en investigación epidemiológica aplicada para brindar conocimiento de Dengue y otros Arbovirus al SINAVE. Con base en los resultados de concordancia obtenidos en los paneles se clasificará a los LESP como sigue: 1. LESP que hayan obtenido una calificación entre 90.0 a <100% de concordancia, se clasifican como SOBRESALIENTES. 2. LESP que hayan obtenido una calificación entre 80.0 a <90% de concordancia, se clasifican como SATISFACTORIOS. 3. LESP que hayan obtenido una calificación menor al 80% de concordancia, se clasifican como NO ACEPTABLES. Para los laboratorios que obtengan clasificación SOBRESALIENTE o, SATISFACTORIA se procederá de la siguiente forma:  Ya no enviarán muestras para Control de Calidad al InDRE de cualquier técnica empleada en el LESP (determinación de IgM, IgG, NS1 o de PCR). Esto se notificará al director del LESP, vía oficio emitido por la Dirección de Diagnóstico y Referencia del InDRE.  La evaluación del desempeño se realizará únicamente a través de PEED, que se enviarán 2 veces por año. Para los laboratorios que obtengan calificación No aceptable, se procederá de la siguiente forma:  Se solicitará la elaboración de un plan de mejora que deberán enviar al InDRE en un tiempo no mayor a una semana después de la notificación de esta calificación.  El InDRE analizará el plan de mejora y de no cumplir con las expectativas necesarias para solventar la contingencia, el InDRE realizará una auditoría y/o asesoría técnica al laboratorio implicado para evaluar la competencia técnica y detectar áreas de oportunidad.  Se enviará un tercer panel, a petición y con costo para el LESP, que nuevamente servirá para las acciones correctivas implementadas por el laboratorio.  Si se obtiene nuevamente un resultado No aceptable se solicitará el cambio del analista para el diagnóstico de Dengue en el LESP y se suspenderá inmediatamente el diagnóstico. El nuevo analista recibirá capacitación inmediata en el InDRE durante una semana, durante la cual se incluirá un examen teórico y práctico al inicio y al final.  Una vez capacitado el analista, se reanudará el diagnóstico inmediatamente,  Derivado de los puntos anteriores y únicamente mientras dure el proceso de mejora (un mes) deberán enviar para control de calidad el 100% de positivos y el 10% de negativos de todas las muestras de probables FD y FHD. En el momento que el laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos lo considere pertinente y como parte de la mejora continua del PEED, la ponderación para la clasificación Sobresaliente, Satisfactorio y No aceptable, se ajustará previo aviso a la RNLSP.
  • 33. Dengue–RNLSP/InDRE Página 33 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Se implementará un directorio de los responsables de realizar las metodologías en cada LESP y de los suplentes, para realizar el seguimiento de los analistas, con el objetivo de detectar situaciones que pudieran impactar en el sistema de vigilancia epidemiológica por laboratorio. En caso de existir un cambio de analista, el LESP se responsabilizará de la capacitación para dicho analista previa notificación (vía correo electrónico) al laboratorio de Arbovirus. Si este último lo considera pertinente la capacitación se realizará en las Instalaciones del InDRE. Los LESP que tienen una red de laboratorios locales en donde se realizan las pruebas de diagnóstico para Dengue, deberán:  Regular las actividades de diagnóstico.  Supervisar la ejecución del algoritmo de diagnóstico.  Implementar el Programa de Evaluación del Desempeño (a través de paneles de eficiencia).  Planificar supervisiones y capacitaciones en servicio. Solicitar la clave de acceso al sistema de captura, plataforma única, módulo dengue, para ingresar inmediatamente los resultados generados, cumpliendo de esta forma con los tiempos establecidos para los indicadores en servicio de cada prueba realizada. Aunado al programa de evaluación PEED también se realizarán supervisiones a los laboratorios con la aplicación de una cédula estandarizada para la evaluación del proceso y así comprobar la competencia técnica, misma que deberá ser mayor del 90%. Ver cronograma de actividades. En el momento que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica considere pertinente realizar alguna modificación en cualquiera de los puntos de la evaluación externa del desempeño, se informará a la RNLSP inmediatamente. Todas las muestras enviadas en cada PEED cuentan con el respaldo documentado de las características de reactividad para cada marcador. Las muestras son embaladas en condiciones óptimas para el envío a los laboratorios participantes, incluyendo instrucciones detalladas para el manejo del mismo. Cada LESP es codificado para mantener la confidencialidad de los participantes mediante una clave única. Las muestras enviadas en cada PEED provienen del banco de sueros del Laboratorio de Arbovirus, el cual es sustentado con el envío programado y especificado durante sesiones vía webex llevadas a cabo en los meses de abril y septiembre de 2012. Los paneles planificados a partir de 2013, estarán constituidos por 12 muestras de suero perfectamente caracterizados para cada marcador. Los resultados de cada PEED obtenidos por cada LESP, deberán ser remitidos una semana después de haber sido enviados a la cuenta del correo del Laboratorio (laboratorioarbovirusindre@yahoo.com.mx). El formato de resultados impreso y firmado en original, deberá ser enviado por oficio a la
  • 34. Dengue–RNLSP/InDRE Página 34 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Dirección General Adjunta del InDRE con atención a la Jefatura del Laboratorio y Coordinación de Enfermedades Virales Zoonóticas y por Vector. El laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos notificará los resultados obtenidos a cada LESP (vía correo electrónico oficialmente a cada director del LESP) una semana después de haber sido recibidos en el InDRE vía correo electrónico. Los resultados serán emitidos vía oficio en las siguientes tres semanas. Seguimiento basado en proceso Con la finalidad de evaluar la reproducibilidad y repetibilidad de cada método empleado, a partir del 2013, cada seis meses el InDRE solicitará a cada LESP (a través de correo electrónico) el envío continuo durante una semana, de los registros de proceso realizados, además de las lecturas obtenidas para cada determinación realizada. Los meses en que se realizará el seguimiento basado en proceso, no serán precisados con antelación. De no recibir el InDRE la información solicitada en tiempo y forma, el LESP recibirá un primer extrañamiento, que lo obligará a brindar explicación oficial en los siguientes cinco días, del motivo por el cual no envío información solicitada. CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO La liberación de la metodología para realizar el diagnóstico, se basará en el cumplimiento de los siguientes criterios: 1. Obtener arriba del 99.0% de concordancia durante la fase de control de calidad, en al menos los últimos dos meses del período de alta circulación viral o de cuatro meses durante el periodo de baja endemicidad. 2. Demostrar con evidencia que se cuenta con los insumos necesarios para los siguientes 12 meses. 3. Demostrar con evidencia que se tiene el recurso humano capacitado en el área a fin y que cumpla con el perfil técnico para la realización de la metodología. 4. Demostrar con evidencia que se cumple en tiempo y forma con las fases pre analítica, analítica y post analítica. Si es así se emitirá un informe a través de un oficio al LESP o Institución correspondiente en donde se manifieste el resultado de concordancia obtenida durante el proceso de control de calidad así como la notificación correspondiente de la fecha de liberación de la metodología. Esta notificación también se dará a conocer al CONAVE. El InDRE tiene la atribución de suspender la realización del diagnóstico en los LESP o en la Institución correspondiente, en cuanto detecte alguna desviación en la realización del mismo que impacte de manera significativa en el SINAVE, esto se informará a través de un oficio al LESP correspondiente y también se notificará al CONAVE.
  • 35. Dengue–RNLSP/InDRE Página 35 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO Con el objetivo de mantener el banco de material biológico, que servirá para realizar los PEED, para obtener controles de referencia, o para estudios que permitan implementación de nuevas técnicas de diagnóstico diferencial para otras Arbovirosis; cada LESP seleccionados semestralmente (información que se brindará en sesión webex en el mes de agosto) enviaran muestras en los siguientes periodos: 25 de marzo, 25 de agosto siguiendo las siguientes especificaciones.  El 20% de muestras positivas y 20% de las muestras negativas para IgM e IgG, NS1.  LESP que realizan identificación de serotipos mediante RT-PCR y que cuentan con la liberación del diagnóstico, deberán enviar el 25% de muestras positivas (que incluya todos los serotipos identificados en su estado). a esta técnica y 30% de muestras negativas a RT-qPCR de muestras positivas a NS1.  LESP que realizan identificación de serotipos mediante RT-PCR y que NO cuentan aún con la liberación del diagnóstico, deberán enviar el 25% de muestras positivas a esta técnica y 50% de muestras negativas para NS1. Para el envío de estas muestras, se deberán usar viales de polipropileno tipo eppendorff o criotubos que deberán rotularse con el número de folio del LESP, la tapa externa deberá sellarse con papel Parafilm™, y no deberán estar contaminadas, ni lipémicas, ni hemolizadas. El volumen mínimo será de 750 microlitros (µL). Es necesario indicar en el oficio de envío que se trata de material biológico para el Banco de Sueros de Dengue y otras Arbovirosis y se deberá anexar el formato correspondiente (ver anexo) con los datos solicitados y debidamente requisitados. Por otra parte la base electrónica deberá ser enviada también al correo electrónico del Laboratorio de Arbovirus y virus hemorrágicos (laboratorioarbovirusindre@yahoo.com.mx). INDICACIONES ESPECIALES PARA LOS LABORATORIOS ESTATALES QUE AÚN NO REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE El InDRE y los estados que cuenten con el aval, según lo indicado en puntos anteriores, realizarán la detección e identificación de serotipos circulantes de virus dengue usando métodos de biología molecular como la RT-PCR Múltiplex en Tiempo Real, o en su defecto, aislamiento viral, como pruebas de oro. El InDRE contará con otras metodologías que le permitan actuar como un verdadero Instituto de REFERENCIA. La importancia de identificar los serotipos circulantes radica en tener la información para poder predecir posibles brotes por serotipos relacionados con
  • 36. Dengue–RNLSP/InDRE Página 36 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 cuadros clínicos graves, identificar localidades de riesgo, comprender la dinámica de transmisión, que permitan fortalecer la vigilancia virológica en el país. *Si el InDRE implementa nuevas metodologías de biología molecular para la detección viral, que permitan mejorar la vigilancia virológica de Dengue en México, se promoverá un curso de actualización inmediatamente, dirigido a los LESP que el InDRE considere pertinentes. El formato del curso quedara sujeto a las necesidades que promuevan una mejor difusión. La Coordinación de Enfermedades Virales y Zoonóticas y por Vector del InDRE seleccionará los LESP para dichos cursos, basado en el marco analítico dado de alta y en la experiencia de los responsables del Diagnóstico serológico y molecular. Esto último con la finalidad de implementar INMEDIATAMENTE las nuevas metodologías en cada LESP seleccionado. Los LESP deberán enviar al InDRE, semanalmente (para una oportuna vigilancia virológica) y de manera obligatoria, el 10% de las muestras positivas a NS1 para FD y el 100% de las muestras positivas a NS1 para FDH, que serán procesadas para la detección y serotipificación de virus dengue por RT-PCR Múltiplex en tiempo real. Con el objetivo de aumentar el porcentaje de tipificaciones de las muestras analizadas para este fin; las muestras positivas a NS1, que deben tener entre 0-5 días de evolución, según datos reportados a nivel internacional y obtenidos por la CEZV-InDRE el mayor éxito en la tipificación viral esta entre 0-3 días. Motivo por el cual el LESP debe promover enviar las muestras que estén en este rango de días de evolución. La solicitud del porcentaje y características de las muestras, puede variar según las necesidades que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica considere pertinentes. Estas muestras deberán venir acompañadas con el Formato Único de Envío o cualquiera de los otros formatos previamente mencionados, debidamente requisados y un listado con los resultados obtenidos para el ensayo de antígeno NS1 en el LESP (densidad óptica de la muestra, valor de corte e interpretación de resultado y marca de reactivo usado). El InDRE emitirá el informe de prueba y lo enviará para que cada LESP capture inmediatamente dentro de las siguientes 24 horas el resultado en la Plataforma Única, módulo Dengue. LABORATORIOS ESTATALES QUE YA REALICEN RT-PCR MULTIPLEX EN TIEMPO REAL PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE VIRUS DENGUE Control de calidad. Los LESP que se estén incorporando al programa de control de calidad supervisado por InDRE, deberán coordinarse perfectamente entre sus áreas de serología o virología y biología molecular para trabajar conjuntamente de la siguiente manera:
  • 37. Dengue–RNLSP/InDRE Página 37 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 1. De acuerdo con el algoritmo, procesar localmente las muestras para determinación de antígeno NS1, (no enviar al InDRE) y según el resultado obtenido, procesar el 10% de las muestras positivas de FD y el 100% de las muestras positivas de FHD mediante RT-PCR en tiempo real. Con el objetivo de aumentar el porcentaje de tipificación, las muestras analizadas por RT- PCR preferentemente deberán tener entre 0-3 días de evolución. Este último punto puede variar según localidad y deberá ser aplicada según resultados analizados por el InDRE y el LESP. 2. Las muestras que se envían al InDRE para control de calidad deberán tener un Cq menor a 32, ya que debido a la inestabilidad del ARN al cambio de temperatura puede promover perdida y tener resultados discordantes. 3. El LESP enviará al InDRE, las muestras de suero , junto con un listado con todos los resultados obtenidos para NS1 (densidad óptica de la muestra, valor de corte e interpretación de resultado) así como el formato de control de calidad en electrónico, el cual incluirá el resultado de RT-PCR especificando el serotipo, valor de Cq (ciclo al threshold) y resultados (gráficos de amplificación) de los ensayos realizados, del 100% de las muestras positivas y el 10% de las negativas durante seis meses. Este proceso se realizará hasta obtener una concordancia del 100% y esta deberá mantenerse durante los últimos cuatro meses consecutivos, para ser considerada la liberación de la metodología. El formato utilizado para enviar los gráficos de amplificación al InDRE fue explicado y distribuido en sesión webex en 2012. 4. En caso de no cumplir con el porcentaje de concordancia requerida para liberación de la metodología, será necesario realizar una supervisión y asesoría técnica vía webex o presencial a las instalaciones y personal técnico responsable de realizar la Vigilancia Virológica de Dengue en el LESP. *Todos aquellos LESP (NO IMPORTANDO SI TIENE LIBERADA LA METODOLOGÍA) que identifiquen algún serotipo que en el transcurso de un año no ha sido identificado en su estado, (circulación sostenida durante 2 años) DEBERÁ SER INMEDIATAMENTE INFORMADO A LOS SITEMAS DE SALUD ESTATAL Y FEDERAL y la muestra de suero y/o ARN (ácido ribonucleico) deberá ser enviada inmediatamente al InDRE para corroborar el resultado del LESP antes de subir el resultado a plataforma. *Cualquier otra metodología diferente a la indicada y validada por el InDRE para la tipificación viral, NO será considerada válida y los resultados obtenidos NO serán avalados. , hasta no ser enviadas al InDRE las muestras de interés. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Este cronograma aplica para 2013. El cronograma de los años subsecuentes será enviado oportunamente vía la Coordinación de la RNLSP.
  • 38. Dengue–RNLSP/InDRE Página 38 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 ACTIVIDAD ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC Envío del primer panel Inteligente Algorítmico único a la RNLSP 25 Recepción de resultados en el InDRE primer panel Inteligente Algorítmico único a la RNLSP 2 Envío de resultados primer panel Inteligente Algorítmico único a la RNLSP (e-mail oficial / físico). 9/23 Envío del segundo panel primer panel Inteligente Algorítmico único a la RNLSP 05 Recepción de resultados en el InDRE primer panel Inteligente Algorítmico único a la RNLSP 12 Envío de resultados a la RNLSP primer panel Inteligente Algorítmico único a la RNLSP (e-mail oficial / físico). 19/26 Recepción de muestras para identificación de serotipos X X X X X X X X X X X X Supervisión a la RNLSP X X X X X X X X X X X X Envío de muestras para Banco de Sueros X X Envío de informe semanal de existencia de reactivos X X X X X X X X X X X X Curso de actualización Vía Webex X X X Curso de actualización en Arbovirus *Nota: Si alguna fecha coincide con día no laborable, la actividad se cambia al siguiente día hábil inmediato.
  • 39. Dengue–RNLSP/InDRE Página 39 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Para brindar un mejor servicio, el envío y recepción de información, resultados, dudas, comentarios, asesorías técnicas, etc. será únicamente a través de correo electrónico: laboratorioarbovirusindre@yahoo.com.mx Finalmente todos los LESP deberán enviar de manera semanal el informe de la existencia de reactivos para realizar diagnóstico y vigilancia virológica, al laboratorio de Arbovirus del InDRE (por correo electrónico). BIBLIOGRAFÍA 1. Halstead SB. Dengue. 2007, Lancet; 370(9599):1644-52. 2. Dussart P., Labeau B., Lagathu G., et al Evaluation of an Enzyme Immunoassay for detection of Dengue Virus NS1 Antigen in Human Serum. Clinical and Vaccine Immunology, 2006, p. 1185-1189. 3. Kumarasamy V., Chua S. K., et. al. Evaluating the sensitivity of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for early diagnosis of acute dengue virus infection. Singapoure Med. J. 2007; 48(7):669. 4. Pei-Yun S., Li-Kuang C., Shu-Fen C., et. al. Comparison of capture Immunoglobulin M (IgM) and IgG Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Nonstructural Protein NS1 Serotype-Specific IgG ELISA for Differentiation of Primary and Secondary Dengue Virus Infections. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2003, p. 622-630. 5. Pei-Yun S., Shu-Fen C., et. al. Current Status of Dengue Diagnostics as the Center for Disease Control, Taiwan. Dengue Bulletin-Vol. 28, 2004. 6. Burke DS, Nisalak A, Ussery MA. Antibodies capture immunoassay detection of Japanese encephalitis virus immunoglobulin M and G antibodies in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 1982; 16(6):1034-42. 7. Bundo K, Igarashi A. Antibody-capture ELISA for detection of immunoglobulin M antibodies in sera from Japanese encephalitis and dengue hemorrhagic fever patients. J Virol Methods. 1985; 11(1):15-22. 8. Li-Jung Chien, Tsai-Ling Liao, Pei-Yun Shu, Jyh-Hsiung Huang, Duane J. Gubler and Gwong-Jen J. Chang2. Development of Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assays To Detect and Serotype Dengue Viruses. J Clin Microbiology. 2006; 44 (4): 1295–1304. 9. Areerat Sa-ngasang, Sasitorn Wibulwattanakij, Sumalee Chanama, et al. Evaluation of RT-PCR as a tool of diagnosis of secondary dengue virus infections. 2003. J. Infec. Dis. 56, 205-209. 10. Day-Yu Chao, Brent S. Davis, and Gwong-Jen J. Chang. Development of Multiplex Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assays for Detecting Eight Medically Important Flaviviruses in Mosquitoes. 2007. J Clin Microbiol. 584–589. 11. Prevention Board, Seoul: International Vaccine Institute. Accelerating Progress in Dengue Control, Dengue Diagnostics in the Americas. A PDVI publication on behalf of the Americas Dengue. 2009. 1-38. 12. Instructions for collecting, preparing and mailing specimens for dengue testing at the CDC Dengue Laboratory. 2007. 13. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. 2009. A joint publication of the World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases (TDR).
  • 40. Dengue–RNLSP/InDRE Página 40 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 14. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012. 15. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement / Vol. 60; 2011. 16. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012. 17. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories – 5th ed. CDC-NIH; 2009. 18. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011. 19. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual – 3rd ed. Geneva: WHO Press; 2004. 20.Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicado en el Diario Oficial de la Federación el 19 de enero de 2004, última reforma publicada DOF 10 de enero de 2011
  • 41. Dengue–RNLSP/InDRE Página 41 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 ANEXO I. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS SEROLOGÍA 1. Determinación del antígeno viral NS1 del virus dengue por ELISA ELISA PLATELIA NS1 El estuche comercial (Platelia NS1), es un método inmunoenzimático en una etapa, tipo sándwich, en formato de microplaca de 96 pozos, útil en la detección cualitativa o semi-cuantitativa del antígeno NS1 del virus del Dengue en suero o en plasma humano. La prueba utiliza anticuerpos monoclonales de ratón (AcMo) para su captura y revelación. Las muestras de pacientes y los controles son incubados directa y simultáneamente con el conjugado diluido durante 90 minutos a 37° C. El antígeno NS1 presente en la muestra, formará complejos inmunes: AcMo - NS1 - AcMo - Peroxidasa. Después de los lavados practicados al final de cada incubación, la presencia del complejo inmune es revelada mediante la solución de revelado enzimática, la cual induce el desarrollo de una reacción coloreada (azul). A los 30 min de incubación a temperatura ambiente, la reacción enzimática es interrumpida mediante la adición de una solución ácida (solución de paro). La densidad óptica obtenida a 450/620 nm es proporcional a la cantidad de antígeno NS1 presente en la muestra. La presencia del antígeno en una muestra individual se establece mediante la comparación de la densidad óptica leída en esta muestra con la obtenida en el suero del valor umbral. Equipo  Gabinete de bioseguridad tipo II  Baño de agua o Incubadora a 37° C  Micropipeta, 50 a 200 µL  Micropipeta multicanal de 20 a 200 µL  Espectrofotómetro  Sistema de lavado manual o automático (si se cuenta con él, en caso contrario se pueden hacer los lavados manuales utilizando una pizeta). Materiales  Puntas adecuadas para los volúmenes de cada una de las micropipetas  Gasas  Cristalería general para laboratorio  Agua bidestilada o desionizada estéril  Probeta graduada de 1000 mL  Guantes desechables  Contenedor de residuos contaminantes  Toallas de papel Reactivos
  • 42. Dengue–RNLSP/InDRE Página 42 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Los siguientes reactivos vienen incluidos en el estuche comercial Platelia NS1 Dengue, el volumen utilizado de cada uno de ellos dependerá de la cantidad de sueros que se procesen. Están etiquetados con un símbolo (letra y número) para su fácil identificación.  Microplaca (R1) (listo para su uso): 12 tiras de 8 pozos cada una sensibilizada por AcMo anti-NS1, en bolsas herméticas al vacío.  Solución de lavado concentrado 10x (R2): Solución amortiguadora Tris-NaCl (pH 7.4) y 1% de Tween 20.  Control negativo (R3): Suero humano negativo para el antígeno NS1 Dengue.  Control valor de corte (R4): Suero con antígeno NS1 Dengue que contiene solución reguladora TRIS-NaCl (pH 8.0), suero albúmina bovina y glicerol.  Control positivo (R5): Suero con antígeno NS1 Dengue que contiene solución reguladora TRIS-NaCl (pH 8,0), suero albúmina bovina y glicerol.  Conjugado 50x (R6): AcMo anti-NS1 conjugado con peroxidasa.  Diluyente (R7): Solución reguladora que contiene Tween 20 y suero fetal de ternera.  TMB (R8): Solución de ácido cítrico y de acetato sódico que contiene 0.015% de H2O2 y 4% de dimetilsulfóxido (DMSO).  Cromógeno concentrado 11x (R9): Solución que contiene 0.25% de 3,3’, 5,5’ Tetrametilbenzidina.  Solución de paro (R10) (listo para su uso): Ácido sulfúrico 1N  Películas adhesivas Condiciones para tomar en cuenta a. La calidad de los resultados depende de la aplicación de las buenas prácticas de laboratorio. b. Diluir cuidadosamente los reactivos evitando su contaminación. c. No dejar secar la placa al final de los lavados y entre la distribución de los reactivos. d. No mezclar ni combinar de una misma serie de reactivos procedentes de cajas con números de lotes distintos, solo se puede utilizar la solución de lavado, el tampón de sustrato, cromógeno y de solución de parada. e. El lavado de cada pozo es una etapa fundamental de manipulación por lo cual, se debe respetar el número de ciclos de lavado, un lavado inadecuado puede modificar los resultados finales. Procedimiento analítico 1. Antes de realizar la detección del NS1, deberá establecerse un plan de distribución e identificación de muestras y controles, así como de los sueros problema. 2. Para poder validar del ensayo se utiliza un control negativo, dos valores umbrales o calibradores y un control positivo (no deberá excluirse ninguno). 3. Sacar el soporte y las tiras del empaque protector.
  • 43. Dengue–RNLSP/InDRE Página 43 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 4. Se realiza la siguiente secuencia de colocación de los reactivos en cada uno de los pozos:  Agregar 50 μL de diluyente (R7) en cada pozo (color naranja).  Agregar 50 μL de muestras (controles y muestras problema).  Agregar 100 μL de conjugado diluido 1:50 a cada pozo (color verde) + 20 µL de R6 + 1.0 mL de R7 representan un volumen suficiente para 8 pozos. *Es importante que la solución de conjugado se prepare antes de comenzar a diluir los sueros  Tapar la superficie con la película adhesiva.  Incubar la microplaca durante 90±5 minutos a 37±1° C.  Diluir la solución de lavado concentrada 10x en agua bidestilada (900 mL de agua bidestilada + 100 mL de solución de lavado 10x).  Al finalizar la incubación, retirar la película adhesiva y verter el contenido de todos los pozos en un contenedor de residuos contaminantes que contenga hipoclorito de sodio. Lavar los pozos 6 veces (lavado manual). Si el lavado es de manera automatizada, procurar verificar el equipo antes y después de su uso siguiendo las indicaciones del proveedor, terminado el último aspirado se deberá eliminar el exceso de solución de lavado sobre papel absorbente.  Agregar 160 µL de la solución de revelado, diluyendo 1:11 el cromógeno (R9) en solución de peróxido de hidrógeno (R8), 150 µL de R9 + 1.5 mL de R8 (volumen suficiente para 8 pozos). Dejar que la reacción se desarrolle incubando a temperatura ambiente, durante 30 ±5 minutos y protegida de la luz. Los pozos con el testigo positivo, los calibradores y en aquellos donde la muestra presente antígeno NS1 Dengue, desarrollaran un color azul. Es importante que la solución de revelado no presente coloración antes de adicionarla.  Agregar 100 µL de solución de paro (R10) en cada pozo. En los pozos con el control positivo, los calibradores y muestras problema que presente antígeno NS1 Dengue, el color azul cambiará a amarillo. Cálculo de resultados Cálculo de valor de corte: El valor umbral (CO), corresponde a la media de las densidades ópticas de los duplicados del Control Valor de corte (R4). Cálculo de cada una de las muestras: Los resultados se obtienen con la relación siguiente: S (Densidad óptica obtenida de la muestra) CO (Valor de corte) Resultado de las muestras problema = S/CO Validación del ensayo
  • 44. Dengue–RNLSP/InDRE Página 44 de 77 Versión No. 02 Julio 2013 Para validar el ensayo, se deberá cumplir los siguientes criterios: Valor de densidad óptica del valor de corte: CO = >0.2 Relación del control negativo (R3) y control positivo (R5). Relación R3 = <0.4 (Relación R3 = DOR3/CO) Relación R5 = >1.5 (Relación R5 = DO R5/CO) *Si no se cumple con las especificaciones anteriores, se deberá repetir el ensayo. Interpretación de los resultados Para seguir los criterios es necesario que los resultados estén dentro de la siguiente relación: NEGATIVO. Muestra con una relación menor a 0.5, es considerada no reactiva (negativa) para el antígeno NS1 del virus dengue. DUDOSO. Muestra con una relación entre 0.5 y 1.0, se considerada dudosa para el antígeno NS1 del virus dengue, por lo que la muestra debe de analizarse nuevamente. POSITIVO. Muestra con una relación mayor a 1.0, se considera reactiva (positiva) para el antígeno NS1 del virus dengue. NOTA: Las densidades ópticas obtenidas en las muestras altamente reactivas pueden alcanzar la densidad óptica máxima y presentarse como SOBRE. Reporte de resultados  Indicar el valor obtenido de la muestra.  Indicar el valor para la interpretación de los resultados.  Indicar la interpretación de resultados (positivo o negativo)  Indicar la marca del reactivo usado. Early ELISA NS1 El estuche comercial Early ELISA NS1, es un método inmunoenzimático tipo sándwich en formato de microplaca de 96 pozos, que se desarrolla en una etapa, útil en la detección del antígeno NS1 del virus del Dengue en suero. El antígeno NS1, si está presente en el suero, se une al anticuerpo anti-NS1 que está fijado a los pozos de poliestireno. El exceso de suero se elimina por lavado y después se agrega un segundo anticuerpo anti NS1 marcado con peroxidasa. Después de la incubación y un lavado para eliminar el exceso de reactivos, se adiciona el sistema sustrato-cromógeno (TMB-peróxido de hidrógeno). La