El documento describe los pasos del proceso histológico para teñir y observar tejidos al microscopio, incluyendo la obtención del tejido de un hámster, fijación, inclusión en parafina, corte, tinción y montaje. El proceso requiere fijar el tejido, deshidratarlo en alcohol, aclararlo en xilol e incluirlo en parafina para luego realizar cortes delgados, teñirlos y montarlos en portaobjetos para su observación.

1. Introducción
En estas páginas dedicadas a las técnicas histológicas vamos a describir los
procesos experimentales necesarios para obtener secciones teñidas y listas para
observar al microscopio partiendo de tejidos vivos extraídos de un animal o de un
vegetal. Por tanto, dedicaremos espacios a la obtención, fijación, inclusión, corte y
tinción de los tejidos. (Kiernan, J.A. 2002)
Existen procedimientos para la observación de tejidos y células vivas que reciben
el nombre de vitales. Por ejemplo, la observación del flujo sanguíneo en capilares
del sistema circulatorio. Otra forma de observar células o tejidos vivos es mediante
las técnicas histológicas supravitales, en los que las células y los tejidos se
"cultivan" fuera del organismo, como es el caso de los cultivos de células y de
tejidos. (Garlan Science 4ª edición).
Las técnicas histológicas postvitales son aquellas en las que las células mueren
durante el proceso, pero las características morfológicas y moleculares que
poseían en estdo vivo se conservan, más o menos dependiendo del tipo de
técnica. Estas páginas estarán dedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son
las más comúnmente usadas en los laboratorios de histología. (Paraninfo 2ª
Edición).
El procedimiento mediato o post-mortem tienen por finalidad preparar células,
tejidos y órganos procedentes de seres en los que los procesos vitales se han
detenido y es necesario conservar la estructura que tenían en vida. (Pawlina,
W. 2005)
La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido muestren una imagen al
microscopio, con las características morfológicas que poseían cuando estaban con
vida, dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplicó para
obtener la muestra a ser procesada mediante los pasos mencionados
anteriormente. (Seeley, R.R., Stephens, T.D., Tate, P. 2008)
Todas las técnicas tienen en común el que requieren de un corte
m u y d e l g a d o d e l t e j i d o (llamado corte histológico), y el montarlo en
una lámina muy fina de vidrio, la cual se la someta diversas coloraciones antes de
observarla al microscopio, ya que luego se la cubre por una laminilla.( Hayat
M.A. 2000).

2. Objetivos
1. Aprender los diferentes tipos de colorantes que se usan en coloración vital y
como se deben aplicar.
2. Realizar cortes con el micrótomo con agilidad y destreza.
3. Obtener placas fijas mediante el examen mediato, realizando todo el proceso
adecuadamente.
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3. Materiales
SUSTANCIAS
•
Xilol
•
Agua destilada
•
Cloroformo
•
Alcohol etílico (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 99%, 100%)
•
Parafina pura
•
Agua destilada
•
Agua alcalinizada
•
Eosina
•
Hematoxilina
•
Pegamento Permount
•
Pegamento Houpt
EQUIPO
• Micrótomo
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4. • Estufa
• Microscopio
• Horno
• Termómetro
• Campana de gases
ELEMENTOS VARIOS
•
Gradilla
•
Pinzas
•
Bisturí
•
Barras de Leukart
•
Placa de cobre
•
Tubos de ensayo
•
13 Cubo de madera
•
23 Coplins
•
Mechero
•
Pincel
•
Papel toalla
•
7 Porta objetos
•
7 Cubre objetos
Metodología
OBTENCION DE LAS PIEZAS
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5. Imagen N°1
Descripción: Organismo a sacrificar
Hamster (Cricetus cricetus - hámster común).
SACRIFICIO DEL ANIMAL (ORGANISMO: HAMSTER ‘Charlie’)
Intoxicación se colocó el animal dentro de una campana de gases con un pedazo
de algodón impregnado de una concentración de cloroformo suficiente como para
matar al animal, la muerte del animal tardo unos 4 minutos, no fue dolorosa y
charlie no sufrió.
Imagen N°2
Descripción: Hámster intoxicado con cloroformo
en la campana de gases
EXTRACCION DE ORGANOS
Luego del sacrificio se procedió a colocar el animal en posición para hacer la
disección, se empezó cortando desde el tórax del animal y así empezar a sacar
los órganos que se descomponen más fácilmente como: el páncreas, el tubo
digestivo, la vesícula biliar. Luego se procedió a extraer los órganos que
usaremos, en este caso (el riñón).
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6. INFORME FINAL
Imagen N°3
Descripción: realizándole un corte
longitudinal al organismo para la extracción
de los órganos.
Imagen N°4
Descripción: extracción del Riñón de un
Hámster
Imagen N°5
Descripción: pieza extraida Organo:Riñon
REDUCCION A PIEZAS
Ya que los órganos no son del tamaño adecuado para la fijación entonces se
procedió a cortarlos de 0.5 cm a 1.0 cm. En nuestro caso no fue necesario reducir el
tamaño del órgano ya que era pequeño solo cortamos la parte superior (corte
transversal) para identificar la posición del órgano.
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7. INFORME FINAL
FIJACION
U
na vez cortado el tejido este será llevado a la fijación para la conservación de las
estructuras de la célula a observar se procede a sumergirlo en un buen fijador para
parar los procesos vitales, tiempo que el órgano estuvo en el fijador fue de 12 horas.
Ver imagen # 4.
El fijador se preparó con los siguientes reactivos:
- Agua Destilada 100 ml
- Formalina 10 ml
- Ácido Acético 5 ml
- Bicromato de Potasio 2.5 g
Imagen N°6
Descripción: sumergiendo el
órgano “riñón” en el fijador.
Luego le retiramos el fijador poniéndolo en agua corriente por 6 horas.
Después de retirarle el fijador procedemos a deshidratar el órgano introduciéndolo a
unos tubos de ensayo en donde cada uno contiene alcohol a diferente porcentaje y
empezamos con el de 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 99, 100 %. Tenerlo en cada alcohol
por 6 horas.
Luego de deshidratarlo procedemos a al aclaramiento para esto introdujimos el
órgano en un tubo de ensayo que contenía xilol.
Para la fijación se requiere una serie de pasos que a continuación mostraremos
Imagen N°7
Descripción: Escala de alcoholes
en el que vamos a sumergir el
órgano.
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8. INFORME FINAL
Reactivo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12
Fijador
H2O (corriente)
OH 50%
OH 60%
OH 70%
OH 80%
OH 90%
OH 95%
OH 96%
OH 99 %
OH 99%
Xilol
Total
Tiempo
(Horas)
12
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
78
Tendremos un total de 3 días y 6 horas (78 horas) en el proceso de Fijación.
INCLUSION
INCLUSION GRADUAL EN PARAFINA
Después de fijar el órgano (Riñón de Hámster) procedemos a la inclusión gradual en
parafina, introducimos el órgano el un beaker pequeño con parafina pura y lo
colocamos en el horno por 24 horas a una temperatura de 56°C a 60°C.
Imagen N°8
Descripción: el órgano ya en parafina listo para
ponerlo al horno.
INCLUSION DEFINITIVA EN PARAFINA
En la inclusión definitiva colocamos el órgano (Riñón de Hámster) en parafina
fundida. Utilizando para este proceso una plataforma de cobre y colocamos sobre la
plataforma las barras de Leukard seguidamente le echamos la parafina fundida y
rápidamente colocamos el órgano sumergiéndolo en la parafina y con las agujas de
disección le damos forma longitudinal para poder realizar el corte de esta manera.
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9. INFORME FINAL
Imagen N° 9
Descripción: la parafina fundida lista para
proceder a hacer los cubos de parafina con
el órgano dentro de ella y utilizando las
barras de Leukar y la plataforma de cobre.
TALLADO
Despu
és que la parafina se solidifique quitamos las Barras de Leukard y pegamos el cubo
de parafina a un cubo de madera con ayuda de calor pegando el cubo de madera y el
cubo de parafina y pasándolo por la llama de un mechero asta que este quede
completamente pegado.
Eliminamos el exceso de parafina del cubo desbastándolo para obtener una forma de
pirámide truncada y facilitar el corte en el micrótomo.
Imagen N°10
Descripción: ilustración de cómo se debe
hacer el tallado en el cubo de parafina.
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10. INFORME FINAL
Imagen N°11
Descripción: cubo de madera adherido al cubo de
parafina ya desbastado.
CORTE
Para obtener cortes finos utilizamos el Micrótomo Automático de Cuchilla Fija y
Bloque Móvil, empezamos limpiando la cuchilla con xilol luego colocamos el bloque
con el órgano en el micrótomo y con mucho cuidado colocamos la cuchilla en el
micrótomo. Comenzamos a rotar la manecilla de micrótomo para obtener los cortes y
los colocamos con la ayuda de un pincel los cortes en un porta objetos.
Imagen N°12
Descripción: cubo de parafina con el órgano colocado en
el Micrótomo listo para proceder a realizar los cortes.
MONTAJE
Colocamos los tejidos en una bandeja con agua corriente a una temperatura de 45°C
a 50°C por 15 minutos, Seguidamente colocamos los tejidos en 7 porta objetos con el
adhesivo temporal de Haupt (el adhesivo de Haupt se prepara mesclando partes
iguales de albumina de huevo y Glicerina pura, se le agregan algunos cristales de
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11. INFORME FINAL
timol o fenol para evitar la descomposición) y quitamos el exceso de agua con papel
toalla. Pasamos el porta objetos brevemente por la llama de un mechero derritiendo
la parafina para fijar completamente los cortes luego quitamos el exceso de parafina
derretida con papel toalla.
Imagen N° 13
Descripción: 7 tejidos en sus
respectivos porta objetos pegados
con el adhesivo temporal de Haupt
COLORACION DEL TEJIDO
DESPARAFINIZACION
Colocamos los portaobjetos con los tejidos del riñon de Hamster en un coplin con xilol
por 5 minutos y repetimos este proceso una ves mas con el fin de eliminar los
residuos de parafina porque esta impide la coloración.
Imagen N° 14
HIDRATACION
Colocamos 6 coplin con alcohol de manera descendente con los porcentajes de 99%,
90%, 80%, 70%, 60%, 50% y sumergimos los 7 tejidos por 1 minutos en cada uno de
los coplins que contienen alcohol con excepción del primer coplin con alcohol de 99%
sumergimos los tejidos por 2 minutos. Este proceso es para que el colorante se
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12. INFORME FINAL
absorba mejor, continuando con el proceso sumergimos los tejidos en un coplin con
agua destilada por 4 minutos para que la hidratación sea completa.
Imagen N° 15
COLORACION PROPIAMENTE DICHA
Después de hidratar los tejidos los colocamos en un coplin con Hematoxilina
(colorante para tejido animal) durante 8 minutos.
Imagen N° 16
VIRAJE
Colocamos los tejidos en un coplin con alcohol acido durante 8 segundos para
realizar a limpieza del colorante luego sumergimos los tejidos durante 2 minutos en
agua alcalinizada. Este proceso lo realizamos para hacer un cambio de pH.
Imagen N° 17
COLORACION CONSTANTE
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13. INFORME FINAL
Sumergimos los 7 tejidos en un coplin con Eosina (colorante para tejido animal)
durante 2 minutos este proceso es para completar la coloración.
Imagen N° 18
LAVADO
Colocamos 2 coplin uno con agua corriente y otro con agua destilada y sumergimos
los tejido por 8 minutos en cada tejido este proceso lo realizamos para limpieza.
Imagen N° 19
DESHIDRATACION
En la deshidratación colocamos 6 coplin con alcoholes en forma ascendente con los
siguientes porcentajes 50%, 60%5, 70%, 80%, 90%, 95%, sumergiendo los tejidos
por 1 minuto en cada coplin con alcohol excepto el alcohol de 99% que lo tendremos
por 2 minutos para completar la deshidratación.
Imagen N° 20
ACLARAMIENTO
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14. INFORME FINAL
Preparamos 2 coplin con xilol cada uno y sumergimos los tejidos durante 5 minutos
en cada coplin con xilol este proceso es para clarificar los tejidos y completar el
proceso de deshidratación para luego seguir con el montaje final que es la etapa final
de todo el proceso por el que paso el órgano (Riñón Hámster.).
Imagen N° 21
MONTAJE FINAL
Al finalizar la coloración el exceso de xilol se elimina con papel toalla.
Sobre los tejidos ya coloreados se agregan 2 o 3 gotas de pegamento Permount
(adhesivo permanente). Seguidamente colocamos el cubre objetos acercándolo
lentamente al pegamento Pemount, presionando suavente sobre el cubre objetos
para dispersar el pegamento, evitando que no se formen burbujas sobre el tejido.
Después de realizar este paso con todas las placas se introduce al horno por 24
horas a una temperatura de 50°C a 60°C.
Imagen N° 22
ROTULACION
Se coloca en cada porta objetos una viñeta permanente que lleve el siguiente dato:
órgano, organismo, número de micras, periodo y ano, sección y número de grupo.
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15. INFORME FINAL
Imagen N° 23
Resultados
Obtuvimos 2 placas fijas de el tejido animal “Riñón de Hámster” ( Cricetus cricetus hámster común) debidamente rotuladas, en el cual podemos observar un corte
longitudinal.
Imagen N° 24
Imagen N° 25
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16. INFORME FINAL
Imagen N° 26
Conclusiones
1. Las Técnicas Histológicas nos facilitan y brindan ayuda al realizar exámenes en
los laboratorios para estudiar tejido y anomalidades de diferentes organismos.
2. El tejido en el examen inmediato es temporal por que lo podemos observar
durante un periodo de tiempo corto en cambio los tejidos obtenidos en el examen
mediato los podemos observar por un largo periodo de tiempo esta ventaja nos
permite observar las partes de diferentes órganos.
3. Obtuvimos destrezas para obtener el corte en el micrótomo y para hacer los
cambios en las diferentes sustancias que se utilizaron en el proceso de coloración.
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17. INFORME FINAL
Bibliografía
•
Kiernan, J.A. 2002
•
Garlan Science 4ª edición
•
Paraninfo 2ª Edición
•
Pawlina, W. 2005
•
Seeley, R.R., Stephens, T.D., Tate, P. 2008
•
.Hayat M.A. 2000
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18. INFORME FINAL
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