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(qPCR)
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Escuela Nacional De Ciencias Biológicas
Licenciatura En Biología
UDA Métodos Moleculares
5OV1
ERIKA MAQUEDA DÍAZ
GRACIELA LORELEY IRAIS LEÓN MUÑOZ
¿QUÉ ES LA qPCR?
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muestra
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en cada ciclo de la reacción
• Su objetivo es detectar y cuantificar las secuencias
específicas de ácidos nucleicos mediante el uso de
reporteros fluorescentes en la reacción
• Higuchi y colaboradores (1992)
FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA
• Se basa en la PCR punto final, pero cambia el modo de detectar y
analizar los productos de la amplificación. El marcaje con
compuestos fluorescentes permite la recopilación de datos a
medida que la PCR avanza.
ADN
Primers/Cebadores
Master mix
• dNTP‘s
• Taq Polimerasa
• Sistema reportero de fluorescencia
• Mg+
• Buffer
Agua
3) EXTENSIÓN
Síntesis de cadenas gracias a la
polimerasa Temperatura: 72°
2) HIBRIDACIÓN
Unión de cebadores a cadenas
complementarias
Temperatura: 50-60°
1) DESNATURALIZACIÓN
Separación de las cadenas de ADN Temperatura: 95°C
Sistemas de monitoreo de reporteros
fluorescentes
No específicos
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de doble cadena
Específicos
Transferencia de energía
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Métodos No Específicos
•Se usan moléculas con afinidad por el ADN de doble cadena,
que al oxidarse generan fluorescencia
• Etapa de extensión
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Pcr en tiempo real

  • 1. PCR EN TIEMPO REAL (qPCR) Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional De Ciencias Biológicas Licenciatura En Biología UDA Métodos Moleculares 5OV1 ERIKA MAQUEDA DÍAZ GRACIELA LORELEY IRAIS LEÓN MUÑOZ
  • 2. ¿QUÉ ES LA qPCR? • Es una técnica de amplificación de ADN • PCR cuantitativa / PCR en tiempo real – Es cuantitativa porque permite cuantificar la cantidad de ADN en la muestra – El término en tiempo real se refiere a la detección de los productos en cada ciclo de la reacción • Su objetivo es detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes en la reacción • Higuchi y colaboradores (1992)
  • 3. FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA • Se basa en la PCR punto final, pero cambia el modo de detectar y analizar los productos de la amplificación. El marcaje con compuestos fluorescentes permite la recopilación de datos a medida que la PCR avanza. ADN Primers/Cebadores Master mix • dNTP‘s • Taq Polimerasa • Sistema reportero de fluorescencia • Mg+ • Buffer Agua
  • 4. 3) EXTENSIÓN Síntesis de cadenas gracias a la polimerasa Temperatura: 72° 2) HIBRIDACIÓN Unión de cebadores a cadenas complementarias Temperatura: 50-60° 1) DESNATURALIZACIÓN Separación de las cadenas de ADN Temperatura: 95°C
  • 5. Sistemas de monitoreo de reporteros fluorescentes No específicos Moléculas afines a ADN de doble cadena Específicos Transferencia de energía de resonancia fluorescente
  • 6. Métodos No Específicos •Se usan moléculas con afinidad por el ADN de doble cadena, que al oxidarse generan fluorescencia • Etapa de extensión • SBYR Green • Fluorescencia  numero de copias de ADN de doble cadena • Unión al surco menor de ADN
  • 7. Métodos específicos • Siguen el principio conocido como «transferencia de energía de resonancia fluorescente» (FRET, por sus siglas en inglés) para generar la señal; este método consiste en transferir energía desde un donador o reportero fluorescente a un aceptor.
  • 8. Métodos específicos Sondas fluorescentes de oligonucleótidos etiquetados con un reportero fluorescente y un «quencher» Hibridación  cambios conformacionales  actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa  ruptura de la unión Liberación de fluorescencia
  • 9. Sondas Molecular Beacon Secuencias repetidas invertidas Estructura en forma de horquilla  Complementariedad con blanco  Separación de reportero y quecher  Fluorescencia
  • 10. • TECNOLOGÍA INCLUIDA EN TERMOCICLADORES PERMITE: Excitar al reportero Lamparas de luz, LED, Laser Captura de la señal de fluorescencia Fotodetector Análisis cuantitativo de la reacción Software Análisis
  • 11. AnálisisEste software genera una serie de gráficas en donde se muestran todos los datos necesarios para conocer si la reacción fue exitosa
  • 12. AnálisisEste software genera una serie de gráficas en donde se muestran todos los datos necesarios para conocer si la reacción fue exitosa
  • 13. Tipos de cuantificación Absoluta Número exacto de copias de amplificadas Relativa Cambios en expresión de genes
  • 14. PCR Tiempo Real qPCR PCR Punto Final Producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la reacción NO es posible detectar en tiempo real ni cuantificar la secuencia blanco Sin manipulación de un gel con agarosa Con manipulación con gel de agarosa Nomenclatura: utilizamos ADN genómico entonces hablamos de una qPCR (quantitative PCR) ADNc y luego hacemos la PCR, nos referimos a una RT-qPCR Mas Sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos Sensible Aplicaciones usadas es para cuantifi car cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la detección de los niveles del ARNm procedente de células o tejidos. La cantidad de ARNm que puede detectar la reacción puede ser a partir de concentraciones bajas Mayor concentración Ingredientes químicos son los mismo =
  • 15. Aplicaciones • Diagnostico = Enfermedades: • Usos microbiológicos= • Fitopatogenos: Producción de propágalos vegetales libres de patógenos= 1) Infecciosas 2) cáncer 3) Anormalias genética 1) Seguridad y deterioro de alimentos 2) calidad de agua Agricultura
  • 16. PCR en tiempo real: una metodología útil para la detección y cuantificación de granulovirus
  • 17. Introducción Virus entomopatógenos, uno de los grupos más estudiados es la familia Baculoviridae, la cual se encuentra dividida en 4 géneros. Alphabaculovirus donde se clasifican Nucleopoliedrovirus (NPV) Betabaculovirus donde se clasifican Granulovirus (GV) Ambos patógenos de insectos del orden : Lepidoptera,Gammabaculovirus y Deltabac ulovirus que agrupan GV y NPV patógenos de insectos del orden: Hymenoptera y Diptera Baculovirus han sido aislados de : lepidópteros y pocos de dípteros e himenópteros ,existen 7,600 especies de hospederos descritas para estos virus
  • 18. Dentro de la estructura de los GVs Se encuentran los cuerpos de inclusión (Obs ) La granulina es la proteína mayoritaria en estos gránulos y posee un rango de tamaño entre 26.000 y 28.000 daltons. Dentro de una matriz de proteína Contienen los viriones (partículas infecciosas per os) Con forma de gránulo Los protege de factores medioambientales deletéreos Codificada por el gen gran (747 pb), altamente conservado en los genomas de los GVs, utilizado en estudios filogenéticos
  • 19. Efectividad y el alto potencial de los GVs Virus a base de GVs poseen un estrecho rango de hospederos, es una estrategia segura para la protección de otros insectos no blanco y organismos benéficos Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria- CORPOICA Desarrolló : Bioplaguicida a base de un granulovirus de Tecia solanivora, formulado como un concentrado emulsionable (CE) para el control de la polilla guatemalteca de la papa (Tecia solanivora, Povolny, 1973) en campo Este bioplaguicida demostró su potencial reduciendo la población de larvas en un 96% en experimentos bajo condiciones controladas en casa malla y 83% en campo
  • 20. Microscopia óptica de campo oscuro Pruebas de reproducción de síntomas virales Electroforesis en geles de poliacrilamida Espectrometría Determinación y cuantificación de granulovirus se utilizan varias metodologías:
  • 21. Objetivo Diseñar una metodología basada en q-PCR para la búsqueda de cepas, seguimiento del virus en suelo y manufactura de un bioplaguicida. Para demostrar tres ejemplos de posibles aplicaciones de la técnica, se realizaron tres ensayos de detección, en larvas de la cría T. solanivora, en el bioplaguicida formulado a base de este virus y en muestras de suelo con aplicación del bioplaguicida.
  • 23. Resultados Los cebadores=amplificarón un fragmento del gen de granulina de 137 pb = Obteniendo amplicones utilizando ADN genómico de granulovirus provenientes de 5 especies diferentes de insectos: NO se observaron fragmentos de amplificación en muestras de NPVs de S. ornithogalli, D. sacharallis o S. frugiperda. T. Solanivora P. operculella E. ello, T. absoluta 2=S. frugiperda
  • 24. • Todos los aislamientos pertenecientes al género Betabaculovirus se caracterizan por presentar la proteína mayoritaria granulina en sus cuerpos de inclusión. • El gen que codifica esta proteína presenta muy poca variabilidad entre los granulovirus (Garavaglia et al., 2012), por lo cual la metodología fue capaz de amplificar muestras de diferentes especies dentro del género.
  • 25. La especificidad de la sonda Taqman se observó en la amplificación por PCR en tiempo real, donde se utilizaron ADNs de los 9 aislamientos de GVs empleados en la PCR convencional  Señal de fluorescencia para los aislamientos de GVs  Señal fue nula para los aislamientos de NPVs.
  • 26.  La desviación estándar (σ) intra e inter-ensayos (para cada ADN patrón) fue baja y nunca mayor de 1  Técnica fue reproducible  La variabilidad entre las repeticiones de una muestra en el sistema Taqman es muy baja y generalmente se aumenta cuando se trabaja con concentraciones muy bajas o con amplicones de gran tamaño (superiores a 150 pb)  Realizando 3 ensayos de amplificación en diferentes tiempos  3 réplicas de cada ADN patrón en cada prueba.
  • 27. Cuantificación absoluta del gen gran por PCR en tiempo real utilizaron diluciones seriadas del ADN plasmídico con un inserto del gen completo, con las cuales se graficó una recta estándar o patrón La recta se determinó la mínima dilución en la cual se observó amplificación, la cual correspondió a 1,25 x 105 copias del gen correspondientes a 0,00064 ng de ADN.
  • 28. Conclusión El gen de granulina detecta betabaculovirus aislados de diferentes especies de insectos debido a la alta conservación de este gen dentro del género viral. Detección y cuantificación de granulovirus en diferentes tipos de muestras, incluyendo tejido larval, suelo y bioplaguicidas a base de este virus. Se puede incluir en diferentes etapas del desarrollo de un bioplaguicida a base de granulovirus Aislamientos con potencialidad para el control biológico Control de Calidad del proceso de manufactura del bioplaguicida.

Notas del editor

  1. Al videograbar en tiempo real la incorporación de bromuro de etidio al ADN durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV.
  2. Decir acerca de costo beneficio