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El apareamiento de bases entre el mRNA y el rRNA de 16S ayuda a seleccionar el sitito de iniciación de la traducción.

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  1. 1. El tRNA. que reconoce el codón de iniciación, tRNAFM-(Fig. 30-37), difiere del tRNA portador de los restos de Met internos, tRNAfl“, a pesar de que ambos reconocen el mismo codón. En E. coli, los tRNA? “ descargados se aminoacilan primero con Met, mediante la misma aminoacil-tRNA sintetasa que carga al tkNAbf-‘t. El Met-tRNA? “ resultante es específicamente forrnilado para dar fMet-tRNAM“, en una reacción enzimática que emplea N w-formiltetra- hidrofolato (Sección 24-4D) como dador de. formilo. El enzima que cataliza la formilación noreconoce _el Met—tRNAfi"-‘. Las estructuras de rayos-X del tRNA? “ de E. coli y del tRNA? “ de levadura (Fig. 30-14) son bastante parecidas, pero difieren en la conformación de sus brazos aceptores y en la de sus lazos antico- dón. Quizás estas diferencias estructurales permiten que el tRNA? “ se diferencie del tRNA? ‘ en las reac- ciones de iniciación y elongación (Sección 30-3D). Las proteínas de E. coli se modifican postraduccional- mente por la desfornzilación de su resto fMet y, en muchas proteínas, por la eliminación posterior de la Met N-terminal resultante. El procesamiento necesario tie- ne lugar, por lo general, sobre el polipéptido naciente, lo cual explica el hecho de que ninguna proteína de E. coli contiene fMet.
  2. 2. El aparcamiento de bases entre el mRNA y el rRNA de 16S ayuda a seleccionar el sitio de iniciación de la traducción AUG codifica para restos Met internos, así como para el resto Met iniciador de un polipéptido. Ade- más, los mRNAs contienen por lo general muchos AUGs (y GUGs) situados sobre pautas de lectura diferentes. Es evidente que un sitio de iniciación de la traducción debe estar especificado por algo más que un simple codón de iniciación. En E. coli, el rRNA de 16S contiene una secuencia rica en pirimidinas en su extremo 3’. Esta secuencia, como señalaran John Shine y Lynn Dalgarno en 1974, es parcialmente complementaria a un segmento de 3 a 10 nucleótidos rico en purinas, o secuencia de Shine-Dalgarno, que se encuentra centrado N 10 nucleótidos hacia el lado 5’ del codón iniciador de casi todos los mRNAs procarióticos conocidos 3G Gf1 ‘I’ _ . ' (a) Iniciación 3 5- ‘Z UA c ¡Z 5 _ 5, (JA C v_ ï D soccamón r-Zlafiïíf‘ m? JZSLTLHEEI I ¿.3 a; no; P A REA! “ A} Q factores de edente P A . . . i
  3. 3. La iniciación es un proceso de tres fases, que requiere la participación de factores de iniciación proteicos solubles Los ribosomas intactos no se unen directamente al mRNA para poder iniciar la síntesis de polipéptidos. En lugar de ello, la iniciación es un proceso muy com- plejo, en el cual las dos subunidades del ribosoma y el fMet-tRNAK“ se asocian sobre un mRNA alineado de la manera adecuada, para formar un complejo que es com- petente para comenzar la elongación de la cadena. Este proceso de ensamblado también requiere de la participa- ción de factores de iniciación proteicos, que no están asociados al ribosoma de manera permanente. La inicia- ción en E. coli implica a tres factores de iniciación denominados IF-1, IF-2 e IF-3 (Tabla 30-8). Su exis- tencia fue descubierta cuando se halló que lavando la subunidad pequeña del ribosoma con una solución de cloruro de amonio 1M, que elimina los factores de iniciación pero no las proteínas ribosomales “perma- nentes”, se impedía la iniciación. 1. Tras completar un ciclo de síntesis de polipéptidos, las subunidades de 308 y de 508 permanecen aso- ciadas en forma de ribosomas de 708 inactivos. El IF-3 se une ala subunidad de 305, de forma que promueve la disociación de este complejo. IF-1 incrementa 1a tasa de disociación, quizás colabo- rando en la unión de IF—3.
  4. 4. 2. En ese momento GTP, mRNA y un complejo de IF-2 con fMet-tRNA? “ se unen a la subunidad de 308. El orden de unión es desconocido. Por tanto, el reconocimiento del fMet-tRNAff“ no debe estar mediado por interacciones codón-anticodón; es la única interacción tRNA-ribosoma que no depende de este tipo de reconocimiento. No obstante, la interacción codón-anticodón colabora en la unión de fMet-tRNAW con el ribosoma. IF-3 también actúa en esta fase del proceso de iniciación: ayuda en la unión de la subunidad de 308 a la secuencia de Shine-‘Dalgarno presente en el mRNA. 3. Finalmente, en un proceso precedido por la libera- ción de IF-3, la subunidad de 508 se une al com- plejo de iniciación de 308, hidrolizando el GTP unido a este último para producir GDP + Pi. Esta reacción, irreversible, reorganiza conformacional- mente a la subunidad de 308 y libera IF-l e IF-2, permitiendo su participación en otras reacciones de iniciación;
  5. 5. D. Elongación de cadenas Los ribosomas elongan las cadenas polipeptídicas en una reacción que sigue un ciclo de tres fases, añadiendo restos de aminoácidos al extremo carboxilo de un poli- péptido en crecimiento (Fig. 30-41). Este proceso, que tiene una Velocidad de hasta 40 restos/ s, implica la participación de Varias proteínas no ribosomales, co- nocidas como factores de elongación (Tabla 30-8). Unión de los aminoacil-tRNAs Durante la fase de “unión” del ciclo de elongación de E. coli, un complejo binario de GTP con el factor de elongación EF-Tu se combina con un aminoacil- tRNA. El complejo terciario resultante se une al ribo- soma y, en una reacción que hidroliza el GTP ‘a GDP + P, el aminoacil-tRNA se incorpora a un complejo codón-anticodón localizado en el sitio A del riboso- ma, mientras que se liberan el complejo EF-Tu - GDP y el P, -. El resto de esta etapa consiste en la regenera- ción del complejo EF-Tu - GTP, a través del desplaza- miento del GDP de EF-Tu - GDP por el factor de elongación EF-Ts, el cual, por su parte, resulta des- plazado por el GTP. Los aminoacil—tRN As son capaces de unirse al sitio A del ribosoma sin la mediación de EF-Tu, pero la Velocidad del proceso es demasiado lenta para que se pueda“ soportar el crecimiento celular. La importancia de EF-Tu [queda reflejada en el hecho de que es la proteína más abundante de E. coli; está presente en "- 100 OOO copias por célula (> 5 % de la proteína celular), que es aproximadamente el número de molé- culas de tRNA que hay en la bacteria. Por tanto, la totalidad de los aminoacil-tRNAs celulares está esencial- mente secuestrada por EF-Tu. EF-Tu es incapaz de unirse al lVIet-tRNAN“, formi- lado o no, y esta es la razón por la cual el tRNA iniciador no lee jamás codones internos AUG o GUG. ¿Cuál es la base estructural de esta discriminación? El tRNA? “ de E. coli difiere de otros tRNAs de E. coli en la ausencia de un par de bases en el extremo del segmento bicatenario de su brazo de aminoácido (Fig. 30-37). La conversión de su resto C 5’—terrninal a una U, por tratamiento con bisulfito, que restablece el par de bases perdido al generar un par U - A, permite la unión de EF-Tu. Evidentemente, EF-Tu reconoce el segmento apareado del brazo de aminoácido de los tRNAs no iniciadores. Sin embargo, los tRNAs inicia- dores de otros organismos poseen brazos de aminoá- cido con segmentos completamente apareados.
  6. 6. Sitio P Sitio A 5' 3' Complejo de Iniciación de 708 nminoacil ARN-t OEF-Ts ‘e / ‘ÉB’ EF-Tu-Ts C3” EF-Tu-GTP l Elongación sede p Sede e de la cadena . polipeptídica Es‘ EF T" gm‘ / EF Tu a w i / A Lg — a‘ / ., GTP GDP + P. k FC. J L FF“ V? ! . ..°. .. 59.2 maNA 5 3' 5 (8) (D)
  7. 7. Translocación En la etapa final del ciclo de elongacíón, se expulsa (o quizás se transfiere al sitio E y se expulsa en la reacción de unión siguiente) el tRNA del sitio P, ahora descargado (primero un tRNAf“, pero después de la iniciación un tRNA no iniciador). Entonces, en un proceso que recibe la denominación de translocación, el peptidil-tRNA en" el sitio A, unido al mRNA, se desplaza al sitio P. Esto prepara al ribosoma para el próximo ciclo de elonga- ción. El mantenimiento de la asociación codón- anticodón del peptidil-tRNA deja de ser- necesario para 1a especificación de aminoácidos. En lugar de ello, probablemente actúa guardando el sitio que per- mite que el ribosoma dé, el salto preciso de tres nu- cleótidos a lo largo del mRNA, salto requerido para conservar la pauta de lectura. De hecho, la observa- ción de que los tRNAs supresores de pauta de lectura inducen una translocación de cuatro nucleótidos (Sec- ción 30-2E) indica que el movimiento del mRN A está directamente acoplado al movimiento del tRNA. El proceso de translocación requiere la participa- ción de un factor de elongación, EF-G, que se une al ribosoma junto con GTP y que sólo es liberado tras la hidrólisis del GTP a GDP + P, “ La liberación de EF-G es un requisito previo para el inicio del próximo ciclo de elongación, debido a que las uniones al ribosoma de EF-G y de EF-Tu son mutuamente excluyentes. La translocación es un proceso mecánico muy complejo y, desafortunadamente, muy poco conocido.
  8. 8. La puromicina es un análogo de aminoacil-tRNA El ciclo de elongación ribosomal fue caracterizado originariamente gracias a la utilización del antibiótico puromicina (Fig. 30-42). Esta sustancia, parecida al extremo 3' del Tyr-tRNA, provoca la terminación prema- tura de la síntesis de cadenas polipeptídicas. La puromi- cina, en competencia con los aminoacil-tRNA especi- ficados pero sin la necesidad de factores de elonga- ción, se une al sitio A del ribosoma, el cual, a su vez, cataliza la reacción de transpeptidización normal para formar peptidil-puromicina. El ribosoma, en estas condiciones, es incapaz de catalizar la reacción de transpeptidización en el próximo ciclo de elongación, debido a que el “resto de aminoácido” de la puromici- na está unido a su “tRNA” a través de un enlace amida, en lugar de ser un enlace de tipo éster. Esto provoca, en consecuencia, la interrupción de la sínte- sis polipeptídica, y la liberación de la peptidil- puromicina. En ausencia de EF-G y GTP, un ribosoma activo no puede unirse a puromicina debido a que el sitio A se encuentra ocupado por un peptidil-tRNA. Sin embar- go, un ribosoma recién formado escapa a esta norma; cataliza la formación de flVlet-puromicina. Estas obser- vaciones demostraron la existencia funcional de los sitios P y A, y establecieron que fMet-tRNAW se une directa- mente al sitio P, mientras que otros aminoacil-tRNAs deben ocupar primero el sitio A.
  9. 9. í , , EL J Fr‘! r-v-a 9.92 ¿E2 s‘ 3' (d) (C1 5:5 Ïranslocación ' 0 P A A ‘ l GDP + P, Se libera kid í el ARN-t K . . . 1L C66 rn 69.9 —- 5’ 3' (e)
  10. 10. Un modelo alostérico de tres sitios para el ciclo de elongación del ribosoma En la actualidad se acepta que el ribosoma contiene tres sitios de unión a tRNA: (1) el sitio A, que se une al aminoacil-tRNA entrante al que será transferida la cadena polipeptídica en crecimiento, (2) el sitio P, que une peptidil-tRN A, y (3) el sitio E (de “Exit”, salida en inglés), que se une al tRNA desacilado. La unión del tRNA a los sitios A y E presenta una cooperatividad alostérica negativa. Al finalizar un ciclo de elonga- ción, el sitio E se une con alta afinidad al tRNA recién desacilado, mientras que el" ahora vacío sitio A pre- senta baja afinidad por el aminoacil-tRN A (este esta- do es el estado postranslocacional). Tras unirse al aminoacil-tRNA entrante, el ribosoma sufre un cam- bio conformacional que convierte al sitio A en un sitio de alta afinidad, y al sitio E en uno de baja afinidad, con lo que se produce la liberación del tRN A desacila- do (estado pretranslocacional). Se hipotetiza que, en el estado postranslocacional, el sitio A se une al aminoacil-tRNA entrante funda- mentalmente a través de interacciones codón-antico- dón, mientras que en el estado pretranslocacional, la unión al aminoacil-tRNA se refuerza por interaccio- nes ribosoma-tRNA, que afectan a todos los tRNAs con una afinidad más o menos igual. De esta forma, en el estado postranslocacional, el sitio A discrimina entre los aminoacil-tRNAs apropiados y los no apro- piados de manera más precisa que en el estado pre- translocacional. Este modelo, por tanto, proporciona- ría una explicación para la precisión ribosomal sin la necesidad de recurrir a mecanismos de prueba de lectura (véase más adelante)-
  11. 11. Estados intermedios en el movimiento del tRNA en el ribosoma Los estudios de análisis de huellas químicas (Sec- ción 33-313) revelan que ciertas bases del rRNA de 16S resultan protegidas por estar unidas a tRNAs en los sitios A y P, y que ciertas bases del rRNA de 235 están protegidas gracias a su unión a tRNAs en los sitios A, P y E. Casi todas estas bases protegidas han sido absolutamente conservadas por la evolución, y muchas de ellas han sido implicadas en la función ribosomal en estudios genéticos o bioquímicos. Las variaciones observadas en los patrones de hue- lla química durante el ciclo de elongación indican que la translocación del tRNA tiene lugar en dos etapas discretas. La primera, impulsada por la formación del enlace peptídico, desplaza el extremo aceptor del nuevo peptidil-tRNA desde el sitio A al sitio P de la subunidad grande del ribosoma, dejando el extremo anticodón asociado con el sitio A de la subunidad pequeña (este estado recibe también la denominación de híbrido A/ P). El extremo aceptor del tRNA recién desacilado se desplaza simultáneamente desde el sitio P al sitio E de la subunidad grande, mientras que su anticodón permanece unido al sitio P de la subunidad pequeña (estado híbrido P / E). En la segunda etapa de la translocación, que es consecuencia de la unión al ribosoma del factor de elongación EF-G, los extremos anticodón de estos tRNAs, junto con ‘el mRNA al que están unidos, se desplazan en relación a la subunidad pequeña de forma que el peptidil-tRNA ocupe ahora el sitio P de ambas subunidades ribosomales (estado P/ P), y el tRNA desacilado ocupe el sitio E de la subunidad grande (como se indicaba antes, un tRNA en el sitio E no protege al RNA de 16S de la modifica- ción química, y por tanto su ocupación no puede ser determinada por este tipo de análisis). Estas observa- ciones podrían explicar por que todos los ribosomas están compuestos por dos subunidades disociables.
  12. 12. E. Terminación de cadenas La síntesis de polipéptidos dirigida por mRNAs sintéticos como poli(U) acaba con un peptidil-tRNA asociado con el ribosoma. Sin embargo, la traducción de los mRNAs naturales, que contienen los codones de terminación UAA, LIGA o UAG, resulta en la producción de polipéptidos libres (Fig. 30-43). En E. coli, los codo- nes de terminación, que son los únicos que normal- mente carecen de los correspondientes tRNAs, son reconocidos por factores de liberación (RFs, de "re- lease factors”) proteicos (Tabla 30-8): RF-1 reconoce UAA y UAG, mientras que RF-2 reconoce UAA y UGA. Ninguno de estos factores de liberación puede unirse al ribosoma simultáneamente a EF-G. Existe un tercer factor de liberación, RF-3, que se une a GTP y que estimula la unión al ribosoma de RF-1 y. de RF-2. Estos factores de liberación actúan a nivel del sitio A del ribosoma, como lo indica el que compitan con los tRNAs supresores por los codones de termina- C1011. La unión de un factor de liberación al codón de termi- nación que le corresponde induce que la peptidil transfe- rasa ribosomal transfiera el grupo peptidilo a agua, en lugar de hacerlo a un aminoacil-tRNA (Fig. 30-44). El
  13. 13. III-TJ! Lapnuw JU. ‘ ¡ J) Adenina o Adenina _ | l 0% / o o=1|= —o CH2 o 0=1|= -—O-CH2 o o’ H H m O" H H + Rn- CH H H H H o oH HO OH TH I H C = o o = C / tRNA ¡ | o 1a, , _¿1—— CH Rn- CH I l I-I NH I. “ 1 Ru __1—— (Ijfi Polipéptido NH Peptldil-tRNA
  14. 14. tRNA que queda descargado se disocia a continuación del ribosoma, y los factores de liberación son expulsa- dos con hidrólisis asociada de GTP a GDP + P, El ribosoma inactivo resultante libera el mRNA al que estaba unido, preparándose para una nueva ronda de síntesis de polipéptidos. _ La terminación en los eucariotas se parece a la de los procariotas, salvo que requiere únicamente de un factor de liberación, eRF, que se une al ribosoma junto con GTP. Este GTP es hidrolizado a GDP + Pi, en una reacción que se piensa que es la que dispara la disociación del ribosoma de eRF. La hidrólisis de GTP acelera los procesos del ribosoma a ¿Cuál es el papel de las diversas reacciones de hidrólisis de GTP que son esenciales para el funciona- miento normal del ribosoma? La traducción tiene lu- gar en ausencia de GTP, aunque de manera extrema- damente lenta. Esto implica que la energía libre de la reacción de transpeptidización es suficiente para diri- gir todo el proceso de traducción. Además, ninguna de las reacciones de hidrólisis de GTP da lugar a la formación de intermediarios covalentes ‘de alta ener- gia”, como lo hace, por ejemplo, la hidrólisis de ATP en numeros_as reacciones biosintéticas. Por tanto, se piensa que la unión del GTP provoca un cambio alostérico en la conformación de los componentes ribosomales, de forma que se facilita un proceso, por ejemplo la translocación. Este cambio conformacional permite también que se catalice la hidrólisis de GTP, lo cual, a su vez, permite que el ribosoma recupere su conformación inicial, con'la liberación concominante de productos como el GDP y el P, La elevada veloci- dad e irreversibilidad de la reacción de hidrólisis de GTP
  15. 15. asegura que los diversos y complejos procesos ribosoma- les a los que vu acoplado, la iniciación, la elongación y la terminación, sean también rápidos e irreversibles. La hidrólisis de‘ GTP facilita también la precisión en la traducción (véase más adelante). La prueba de lectura cinética requiere una reacción de ruta ramificada Los modelos cinéticos de selección de tRNA requie- ren un solo sitio de unión. John Hopfield teorizó que un proceso de este tipo puede tener lugar a través de una reacción ramificada, como la de la Fig. 30-45: 1. La reacción de unión inicial discrimina, como se ha discutido ya, entre los tRNAs correspondientes (los Ribosoma (n) + air-tRNA - EF-Tu - GTP Recono- cimiem Ribosoma (n) - ata-tRNA - EF-Tu- GTP inicial k 2 Pi >14 [Ribosoma (n) ' aaa-tRNA - EF-Tu - GDP] EF-Tu v GDP k 3 k 4 aa-atRNA Prueba de Ribosoma (n + 1) Ribosoma (n) o 1313231-1 -- GDP lectura k 5 EF-‘Tu ° GDP Ribosoma (n)
  16. 16. Aminuacil ARN-t O EF-Ts ‘l / GCSP EF-‘fu-T: ‘ ‘X EF-Ts 7 I‘! l ‘l- O EF-Tu-GTP Ï Elongación Sede P Sede n de la cadena 5p. ; polipemudica ' u P A EF-Tu a I‘ ” A a a “¿gl 1k " " / GTP son. p. p “" = _ K .1 Q s l! nn ¿L l E°2 6°. ! nm 9.99. 529. s 3' 5' a- ta) (b) Peptidiltransferasa l EF-G GTP ‘ri r“, ‘"1’ W’ 9x eL Si Lg‘ ‘xx u l)‘ A x] n- j-Lr- 29.9. 59.2 s22 ¿se s' 3' s' 3' (d) ¡F5 | ocación O A (C) P A Q‘ l GDP + P. Se libera 5 i. El flRN-Í

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