NORMA TÉCNICA NTC
COLOMBIANA 4939
2001-05-30
CALIDAD DE AGUA.
ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia
coli. TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y
TÉCNICA DE SUSTRATO ENZIMÁTICO
E: WATER QUALITY. COLIFORM AND ESCHERICHIA COLI
COUNTING. FERMENTATION TUBE TECHNIQUE AND
ENZYMATIC SUBSTRATE TECHNIQUE
CORRESPONDENCIA:
DESCRIPTORES: Coliformes, E. coli.
I.C.S.: 67.040, 07.100.20
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435
Prohibida su reproducción

PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica
está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 4939 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-05-30.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
través de su participación en el Comité Técnico 000031 Microbiología.
ACEGRASAS FRIGORÍFICOS SUIZO S.A.
ALPINA S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.
AQUALAB GASEOSAS LUX
ASINAL LTDA ICA
AVESCO INGENIO PICHICHI
BIOQUILAB LTDA. INGENIO RIOPAILA
CALIDAD MICROBIOLÓGICA IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
CALIDAD TOTAL LESNIAK E.U.
CARULLA Y CÍA. MEALS S.A.
CERVECERÍA LEONA NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y NULAB LTDA.
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS
FÁBRICA DE ESPECIAS Y PRODUCTOS QUIOS LTDA
EL REY S.A. TECNOCLEAN DE COLOMBIA
FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. TRES M DE COLOMBIA
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las
siguientes empresas:
ALGARRA DISA S.A.
ASEBIOL EMPRESA DE ACUEDUCTO Y
BEATRIZ DEL PILAR MACÍAS ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ
CASA LUKER S.A. HACIENDA SANTA HELENA
COLOMBINA S.A. INVIMA
COLSUBSIDIO LA CAMPIÑA S.A.
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES LABORATORIO MICROBIOLOGÍA PARA
CONGELAGRO LA CALIDAD DE LOS ALIMENTOS
CONSESIONARIO TIBITOC LABORATORIO PROCALIDAD

LABORATORIOS GRAM PRODUCTORA DE JUGOS S.A.
LLOREDA GRASAS S.A. QUALA S.A.
MERCK RICA RONDO
MINISTERIO DE SALUD UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL PÚBLICA
PASSIFLORA COLOMBIANA S.A. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
PROCESADORA DE LECHE S.A. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939
CALIDAD DE AGUA.
ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia coli.
TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y TÉCNICA
DE SUSTRATO ENZIMÁTICO
1. OBJETO
La presente norma especifica dos métodos para la enumeración de Coliformes y E. coli. El
Método A describe la Técnica de tubos de fermentación y el Método B describe la Técnica de
Substrato enzimático empleando tubos múltiples, presencia y ausencia o multiceldas en
muestras de agua tratada, cruda o residual, de acuerdo con lo propuesto por el Standard
Methods 20 edición 1998.
Método A
Técnica de los tubos de fermentación
2. DEFINICIÓN
Para los propósitos de este método se aplica la siguiente definición.
Coliformes: bacterias gramn negativas que a la temperatura especificada (35 °C ± 2 °C) causan
fermentación de lactosa con producción de gas en las condiciones de ensayo especificadas en
este método.
3. PRINCIPIO
3.1 PRUEBA PRESUNTIVA
Inoculación de quince tubos con medio selectivo líquido (Véase el numeral 4.2), con serie de
cinco tubos con 10 ml, 1,0 ml y 0,1 ml de muestra de ensayo respectivamente ó diez tubos con
medio selectivo líquido con 10ml de la muestra de ensayo o inoculación de cinco tubos con
medio selectivo líquido con 20 ml de la muestra de ensayo.
3.2 Incubación a 35 °C ± 0,5 °C de los tubos inoculados durante 24 h a 48 h y análisis de
estos tubos.
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3.3 PRUEBA CONFIRMATIVA
Aislamiento de los cultivos procedentes de la serie de tubos en los cuales se haya observado
formación de gas y acidez en medio líquido para confirmación (Véase el numeral 4.3).
3.4 Incubación a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h
3.5 Cálculo del número más probable de coliformes por 100 ml de muestra (es decir el
NMP), a partir del número de tubos que muestren formación de gas, usando una tabla para
determinación de números más probables.
3.6 Para establecer la presencia de coliformes y establecer una carta de control de calidad,
se utiliza el ensayo completo sobre al menos el 10 % de los tubos confirmados.
Simultáneamente se inoculan en Caldo bilis verde brillante lactosa para coliformes totales y
caldo EC para coliformes fecales o EC+MUG para E. coli a 44,5 ºC. Los resultados positivos de
la prueba indican un ensayo completo
Paralelamente la presencia de tubos positivos en caldo bilis verde brillante pero negativos en
caldo EC o EC+MUG indican la presencia de coliformes no fecales
4. MEDIOS DE CULTIVO
4.1 GENERALIDADES
En la NTC 4092 (ISO 7218) se presenta información sobre la práctica actual de laboratorio.
4.2 CALDO LAURYL TRIPTOSA
Composición
Triptosa 20 g
Lactosa 5,0 g
Fosfato dipotásico K2HPO4 2,75 g
Fosfato de potasio KH2PO4 2,75 g
Cloruro de sodio NaCl 5,0 g
Lauril sulfato de sodio 0,1 g
Agua destilada, desionizada 1 000 ml
Preparación
El caldo lauryl triptosa debe prepararse teniendo en cuenta que la concentración original del
medio debe mantenerse al adicionar la muestra. Por ejemplo: se prepara el medio a doble
concentración si el volumen de la muestra es igual al volumen del medio a utilizar.
Se añaden los ingredientes deshidratados al agua destilada, se mezcla cuidadosamente y se
caliente para disolverlo. El pH deberá ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización.
Antes de esterilizarlo, se agrega caldo a los tubos de fermentación en cantidad suficiente para
cubrir los tubos durham invertidos, (al menos parcialmente después de la esterilización). Se
cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.
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Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.
Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.
Como alternativa, se omite el tubo durham invertido y se añade 0,01 g/l de púrpura
bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido en lugar de la
formación de gas, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba.
4.3 CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (MEDIO SELECTIVO)
Composición
Peptona 10 g
Lactosa 10 g
Bilis de buey deshidratada (sales biliares) OXGALL 20 g
1
Verde brillante 0,0133 g
Agua destilada, desionizada 1 000 ml
Preparación
Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se calienta
para disolverlos. El pH debe ser de 7,2 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo,
se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente de
medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Se
cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.
Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.
Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.
4.4 CALDO E C
Composición
Triptosa 20 g
Lactosa 3,0 g
Fosfato dipotásico K2HPO4 2,75 g
Fosfato de potasio KH2PO4 2,75 g
Cloruro de sodio NaCl 5,0 g
Lauryl sulfato de sodio 0,1 g
Agua destilada, desionizada 1 000 ml
Preparación
Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente
para disolverlos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo,
se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente de
medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Se
cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.
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Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.
Los tubos de fermentación no de en contener burbujas de aire después de la esterilización.
4.5 AGAR LES ENDO
Composición
Peptona 10 g
Lactosa 10 g
Fosfato dipotásico K2HPO4 2,5 g
Sulfito sódico anhidro 3,3 g
Pararrosanilina (fuscina) 0,3 g
Agar 12,5
Agua destilada, desionizada 1 000 ml
Preparación
Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente
para disolverlos. El pH debe ser de 7,4 ± 0,2 después de la esterilización.
Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.
Se vierten en cajas de petri de 100 mm x 15 mm
4.6 AGAR MACCONKEY
Composición
Peptona caseinada 17,0 g
Peptona de carne Proteasa 3,0 g
SorbitolLactosa 10,0 g
Sales biliares No.3 1,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Rojo neutro 0,03 g
Violeta cristal 0,001 g
a
Agar 12 g a 15 g
Agua 1 000 ml
a
Dependiendo de la concentración de gel del agar
Preparación
Se añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente hasta ebullición para
disolverlos. Se esteriliza en el autoclave por 15 min a 121 °C. Tras la esterilización, se vierte el agar
en cajas de petri (100 mm x 15 mm). El pH debe ser de 7,1 ± 0,2 después de la esterilización.
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4.7 AGAR NUTRITIVO
Composición
Extracto de carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
a
Agar 12 g a 18 g
Agua 1 000 ml
a
Dependiendo de la concentración de gel del agar.
Preparación
Se añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos.
El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizar, se dispensa el
medio en tubos con tapón de rosca. Después de la esterilización, inmediatamente coloque en
posición inclinada, de forma que el agar solidifique formando pendiente. Ajustar los tapones
después de que se hayan enfriado y conserve en una zona fría y protegida.
4.8 REACTIVOS PARA LA TINCIÓN DE GRAM
4.8.1 Oxalato de amonio - cristal violeta (de Hucker)
Se disuelven 2 g de cristal violeta (con un contenido de colorante del 90 %) en 20 ml de alcohol
etílico al 95 %; se disuelven 0,8 g de (NH4)2C2O4.H2O en 80 ml de agua destilada; se mezclan
ambas soluciones y se deja reposar durante 24 h antes de usarlas; se filtra a través de un
papel y se conserva en un frasco de tinción.
4.8.2 Solución de Lugol, modificación de Gramn
Se tritura en un mortero, 1 g de cristales de yodo y 2 g de KI. Se añade lentamente agua
destilada y se tritura con cuidado después de cada adición hasta que se complete la solución.
Se almacena en una botella de vidrio ámbar, añadiendo el resto del agua (usando un total de
300 ml).
4.8.3 Contraste
Se disuelven 2,5 g de safranina en 100 ml de alcohol etílico al 95 %. Se añaden de 10 ml a
100 ml de agua destilada.
4.8.4 Alcohol acetona
Se mezclan partes iguales de alcohol etílico al 95 % y acetona.
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4.9 CALDO E C + MUG
Composición
Triptosa o tripticasa 20 g
Lactosa 5,0 g
Mezcla de sales biliares o sales biliares No. 3 1,5 g
Fosfato dipotásico K2HPO4 4,0 g
Fosfato de potasio KH2PO4 1,5 g
Cloruro de sodio NaCl 5,0 g
4-methylumberiferil B D glucoronidasa MUG 0,05 g
Agua destilada, desionizada 1 000 ml
Preparación
Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, mediante
calentamiento si es necesario.
Se ajusta el pH, si es necesario, de tal modo que después de la esterilización sea 6,9 +/-2 a
25 °C.
Se distribuye el medio, en cantidades de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 180 mm (véase
el numeral 5.4)
Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos no deben
presentar fluorescencia bajo la luz UV a 366nm
No es necesario utilizar tubos invertidos. Las tapas pueden ser metálicas o plásticas resistentes
al calor
5. APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO
Nota 1. Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material de
vidrio reutilizable.
Equipo usual de laboratorio microbiológico y, en particular, lo siguiente. Véase la NTC 4092
(ISO 7218).
5.1 APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN
HÚMEDO (AUTOCLAVE)
Véase la NTC 4092 (ISO 7218).
5.2 INCUBADORA
Con capacidad de funcionar a 35 °C ± 2 °C.
5.3 ASAS
Hechas de platino/iridio o níquel/cromo o asas desechables.
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5.4 TUBOS DE ENSAYO
Con capacidad apropiada para la esterilización y almacenamiento de medios de cultivo y la
incubación de medios.
5.5 TUBOS DURHAM
Con capacidad de 50 mm x 10 mm
5.6 PIPETAS DE ENTREGA TOTAL
Con capacidad nominal de 1ml y 10 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,1 ml y
0,5 ml.
5.7 MEDIDOR DE PH
Con capacidad para dar lecturas con aproximación a 0,01 unidades de pH a 25 °C, que permita
realizar mediciones con una exactitud de ± 0,1 unidad de pH
5.8 PIPETEADOR
5.9 CAJAS PETRI
6. MUESTREO
Para la toma de muestra y muestreo seguir los procedimientos descritos por el Standard
Methods Parte 9060 Capítulo 9-17 ó NTC-ISO 5667-3, NTC-ISO 5667-5 y NTC-ISO 5667-14.
7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
Se comienza el examen microbiológico de las aguas máximo 24 h después de su recolección.
Si se sabe que el resultado puede ser usado para una acción legal analizar la muestra antes de
6 h, manteniéndola refrigerada y con cadena de custodia
8. PROCEDIMIENTO
Véase el diagrama del Anexo A (Normativo).
8.1 MUESTRA DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES
Tabla 1. Preparación del medio líquido de Lauril Triptosa
Medio líquido de lauril
Inóculo Cantidad de medio en el Volumen del medio + triptosa deshidratado
ml tubo inóculo requerido
ml ml g/l
1 10 o más 11 o más 35,6
10 10 20 71,2
10 20 30 53.4
20 10 30 106,8
100 50 150 106,8
100 35 135 137,1
100 20 120 213,6
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8.2 PRUEBA PRESUNTIVA (Inoculación e incubación)
Se agrupan los tubos de fermentación en hileras de cinco o diez en una gradilla para tubos de
ensayo. El número y el volumen de los tubos de muestra seleccionados dependen de la
cantidad y de las características del agua que se vaya a estudiar.
Para agua potable: se utilizan cinco porciones de 20 ml o diez porciones de 10 ml, o una sola
botella de 100 ml.
Si se trata de agua no potable: se utiliza cinco tubos por dilución (de 10 ml, 1 ml, 0,1 ml, etc.).
Se agita vigorosamente la muestra y las diluciones unas 25 veces. Se inocula cada tubo en un
grupo de cinco con volúmenes duplicados de muestra (en diluciones decimales crecientes, si
se utilizan cantidades decimales de la muestra). Se mezclan las porciones a estudiar mediante
agitación suave. Se verifica que en los tubos durham invertidos no halla quedado aire.
Se incuban los tubos inoculados o las botellas a 35 °C ± 0,5 °C. Después de 24 h ± 2 h, se
agita cada tubo o botella suavemente y se observa si se produce crecimiento, gas o una
reacción ácida (color amarillo) y, en caso contrario, se reincuba y se vuelve a examinar al final
de 48 h ± 3 h. Se registra la presencia o ausencia de crecimiento, gas y reacción ácida. Si no
se ha utilizado el tubo de durham, un crecimiento con acidez significa una presunta reacción
positiva.
Interpretación. La aparición de gas o ácido en los tubos o botellas dentro de las 48 h ± 3 h
constituye una presunta reacción positiva. Los tubos con este tipo de reacción deben ser
estudiados en la fase confirmatoria.
La ausencia de reacción ácida o de formación de gas al finalizar las 48 h ± 3 h de incubación
indica una reacción negativa.
Se someten las muestras de agua potable que demuestren crecimiento sin una reacción ácida
o formación de gas a la fase confirmatoria. El límite arbitrario de 48 h para la observación
excluye sin ninguna duda a los miembros ocasionales del grupo coliforme que crecen de
manera muy lenta
8.3 PRUEBA CONFIRMATIVA
Se someten todos los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren crecimiento,
cualquier cantidad de gas o reacción ácida dentro de las 24 h ± 2 h de incubación a la fase
confirmatoria. Si se observa una fermentación activa o un crecimiento ácido antes de las 24 h ± 2 h,
transfiera al medio de confirmación; preferiblemente examine los tubos a las 18 h ± 1 h. Si hay
otros tubos o botellas de la fase presuntiva con crecimiento ácido después de las 48 h ± 3 h de
incubación, también se llevarán a la fase confirmatoria.
Se agitan suavemente o se hacen rotar los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren
gas o crecimiento ácido para que se produzca una resuspensión de los microorganismos.
Con una asa estéril de 3,0 mm a 3,5 mm de diámetro, se transfiere un asa completa de cultivo
al tubo de fermentación que contiene el medio verde brillante de lactosa bilis o introduzca un
aplicador de madera estéril en el cultivo, de al menos 2,5 cm, se retira rápidamente y se
introduce hasta el fondo en la botella o el tubo de fermentación con el medio mencionado.
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Se retira y desecha el aplicador. Se repite esta operación para todos los tubos posiblemente
positivos.
Se incuba el medio de verde brillante lactosa bilis a 35 °C ± 0,5 °C. La formación de cualquier
cantidad de gas en el tubo durham invertido en el medio de fermentación verde brillante de
lactosa bilis a cualquier tiempo (por ejemplo, 6,0 h ± 1 h, 24 h ± 2 h) dentro de las 48 h ± 3 h
constituye un resultado positivo en la fase confirmatoria.
Se calcula el NMP a partir del número de tubos positivos en el medio de fermentación verde
brillante de lactosa bilis.
Procedimiento alternativo. Se usa esta alternativa sólo para aguas contaminadas o
residuales que se sepa presenten sistemáticamente resultados positivos.
En caso de que todos los tubos sean positivos en dos o más diluciones consecutivas durante
24 h, lleve sólo a la fase confirmatoria los tubos de la dilución más alta (menor muestra de
inóculo) en la cual todos los tubos son positivos y algunos tubos positivos en diluciones aún
más altas.
Se somete a la fase confirmatoria todos los tubos que presenten gas o crecimiento ácido sólo
después de las 48 h.
8.4 PRUEBA COMPLETA
Para establecer la presencia de bacterias coliformes y obtener datos sobre el control de
calidad, se usa la prueba completa sobre por lo menos el 10 % de los tubos positivos
confirmados.
Simultáneamente, se inocula en medio líquido verde brillante de lactosa bilis para coliformes
totales y medio líquido EC para coliformes fecales o puede ser usado medio líquido EC-MUG
para Escherichia coli.
Se consideran como respuesta positiva de la prueba completa los resultados positivos en caldo
medio líquido EC y medio líquido EC-MUG a temperatura elevada (44,5 °C).
Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante lactosa bilis y negativos en medio
EC y EC-MUG indican la presencia de coliformes no fecales.
Se siembra asépticamente una placa de agar LES Endo o agar MacConkey por cada tubo de
medio verde brillante lactosa bilis que ha producido gas; se realiza la operación lo antes posible
tras la detección del gas.
Se siembran las cajas de forma que asegure la existencia de algunas colonias aisladas,
separadas por al menos 0,5 cm. Si existen coliformes y se quiere obtener una elevada
proporción de aislamientos satisfactorios, se deben tener las siguientes precauciones: (a) Se
utiliza un asa estéril de 3 mm de diámetro o una aguja de inoculación ligeramente curvada en la
punta; (b) se abre e inclina el tubo de fermentación evitando la toma con la aguja de cualquier
membrana o espuma; (c) se introduce el extremo del asa o la aguja en el líquido del tubo a una
profundidad de alrededor de 0,5 cm, y (d) se siembra la caja con la parte curvada de la aguja
en contacto con el agar para no arañar la superficie.
Se flamea el asa entre los cuadrantes segundo y tercero para mejorar el aislamiento de las
colonias.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939
Se incuban las cajas invertidas a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h.
Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden definirse como típicas (rosas a
rojo oscuras con un brillo verde metálico superficial) o atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras
sin brillo) a las 24 h de incubación.
Las colonias típicas de la fermentación de la lactosa desarrolladas sobre el agar MacConkey
son rojas y pueden estar rodeadas por una zona opaca de precipitado biliar.
Se toma de cada caja una o más colonias típicas bien definidas o, si no existen, dos o más
entre las que se consideren como probablemente formadas por microorganismos del grupo
coliforme y se las pasa a un tubo de fermentación con medio de lauril triptosa y a uno con agar
en inclinado (este último no es necesario si se trata de muestras de agua potable).
Si es necesario, utilice una lupa para colonias a fin de conseguir un aumento óptimo a la hora
de tomarlas de las cajas de agar LES Endo o agar MacConkey.
Cuando se transfiera las colonias, se eligen las que estén bien aisladas y se toca apenas su
superficie con una aguja esterilizada a la llama, enfriada al aire para evitar en lo posible el
peligro de transferir un cultivo mixto.
Se incuban los tubos con el medio secundario (medio líquido de lauril triptosa con tubos
durham de fermentación invertidos) a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h; si no se produce gas
en este período se prolonga la incubación hasta 48 h ± 3 h.
Se estudian microscópicamente las preparaciones teñidas con Gram y obtenidas en los cultivos
de pendiente de agar a las 24 h, correspondientes a los tubos secundarios que muestren gas.
Tinción de Gram. Si se trata de muestras de agua potable, se puede prescindir de la tinción de
Gramn en la prueba completa, ya que es raro que existan bacterias gramnpositivas y
microorganismos esporulados sobrevivientes en este método de detección selectiva.
Existen varias modificaciones de la técnica de Gramn. Se utiliza la modificación de Hucker para
teñir las extensiones de cultivos puros; se incluye un control para organismos grampositivos y
otro para gramnegativos.
Se preparan emulsiones ligeras distintas de los crecimientos bacterianos en estudio y de los
cultivos de control positivos y negativos sobre el mismo porta, utilizando para ello gotas de
agua destilada colocadas en el cristal.
Se dejan secar al aire y se fijan pasando el porta sobre una llama, se tiñen por 1 min con la
solución de oxalato de amonio cristal violeta. Se enjuaga con agua corriente y se aplica la
solución de Lugol durante 1 min.
Se lava de nuevo el porta teñido con agua corriente. Se decolora durante aproximadamente
15 s - 30 s con alcohol acetona, manteniendo el porta entre los dedos y deje que el alcohol
acetona fluya por la extensión teñida hasta obtener un líquido incoloro. No decolore en exceso.
Contraste con safranina durante 15 s, lave con agua corriente, seque con papel absorbente o al
aire y examine microscópicamente. Los microorganismos grampositivos son azules y los
gramnegativos rojos. Los resultados sólo son aceptables cuando los controles dan la reacción
adecuada.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939
Interpretación. El resultado positivo de la prueba completa requiere la formación de gas en los
tubos secundarios con medio de lauril triptosa en 48 h ± 3 h y la demostración de bacterias
alargadas gramnegativas no esporuladas procedentes de los cultivos con agar, lo que
demuestra la presencia de un miembro del grupo coliforme.
9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
9.1 PRECISIÓN DE LA PRUEBA DE TUBOS DE FERMENTACIÓN
A menos que se estudien numerosas porciones de la muestra, la precisión de la prueba de
tubos de fermentación es muy baja. Por ejemplo, si sólo 1 ml es examinado en una muestra
que contiene 1 coliforme/ml, casi un 37 % de los tubos de 1 ml pueden producir resultados
negativos, debido a la distribución aleatoria de las bacterias en la muestra.
Cuando en estas condiciones se utilizan cinco tubos, cada uno con 1 ml de la muestra, se
puede esperar un resultado completamente negativo en alrededor de 1 % de las veces.
Aunque se utilicen cinco tubos de fermentación, la precisión de los resultados no es muy
elevada. Por tanto, hay que tener cuidado a la hora de interpretar el significado sanitario de los
resultados de coliformes obtenidos cuando se utilizan pocos tubos con dilución de muestra,
sobre todo cuando el número de muestras de una toma es limitado.
9.2 CÁLCULO Y REGISTRO DEL NMP
Para calcular la densidad de coliformes, se calcula en términos del Número Más Probable
(NMP). Las Tablas 2, 3 y 4 indican los valores del NMP para distintas series de siembras y
resultados. En estas tablas se contemplan límites de confianza del 95 % para cada valor del NMP.
Si los volúmenes de la muestra utilizados son los contenidos en las tablas, se reporta el valor
correspondiente al número de resultados positivos y negativos en las series en forma de
NMP/100 ml o se reporta como presencia o ausencia de coliformes totales o fecales.
Los volúmenes de muestra indicados en las Tablas 2 y 3 están relacionados de forma más
específica con las aguas terminales.
La Tabla 4 ilustra los valores de NMP para combinaciones de resultados positivos y negativos
cuando se estudian volúmenes de cinco muestras de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml.
En caso de que las series de diluciones decimales sean distintas de las de la tabla, se
seleccionan los valores de NMP de la Tabla 4 por la combinación de tubos positivos,
calculando de acuerdo con la siguiente fórmula:
10
Valor del NMP (de la tabla) x = NMP / 100 ml
Mayor volumen estudiado
Cuando se utilice más de tres diluciones en series de diluciones decimales, sólo se tomarán los
resultados de tres de ellas para calcular el NMP.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939
Para seleccionar las tres diluciones por utilizar en la determinación del índice del NMP, se
escoje la dilución más alta con resultado positivo entre las cinco estudiadas (no hay ninguna
dilución menor que haya dado un resultado negativo) y las dos siguientes diluciones más altas.
Se usan los resultados de estos tres volúmenes para calcular el índice del NMP. En el ejemplo
siguiente, los resultados de la dilución significativa se dan en negritas. El numerador
representa los tubos positivos y el denominador, el total de tubos estudiados; la combinación
de positivos indica únicamente el número total de tubos positivos por dilución:
Combinación Índice NMP /
Ejemplo 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml
de positivos 100 ml
a 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 5 000
b 5/5 4/5 2/5 0/5 5-4-2 2 200
c 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20
En c, se selecciona las tres primeras diluciones, de manera que se incluya el resultado positivo
en la dilución media.
Cuando se presenta un caso como el que se muestra a continuación en la línea d, en el que
una dilución muestra un positivo mayor que las tres elegidas según la regla general, el
resultado se incorpora a la mayor de las diluciones elegidas, como sucede en e:
Combinación Índice NMP /
Ejemplo 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml
de positivos 100 ml
d 5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2 1 400
e 5/5 3/5 2/5 0/5 5-3-2 1 400
Si desea resumir en un solo valor de NMP los resultados de una serie de muestras, se recurrirá
a la media geométrica o la mediana.
En la Tabla 4 se muestran las combinaciones de tubos positivos más probables. Si aparecen
combinaciones poco probables con una frecuencia superior al 1 %, hay que pensar que la
técnica es inadecuada o que no se ha cumplido por completo el supuesto estadístico en que se
basa el cálculo del NMP.
El NMP para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras combinaciones de tubos
o diluciones, puede calcularse mediante la sencilla fórmula de Thomas:
No. de tubos positivos
NMP/100 ml = x 100
ml de muestra en los tubos negativos x ml de muestra en todos los tubos
Aunque los cálculos del NMP se facilitan para su uso en la prueba de coliformes, también son aplicables para
determinar el NMP de cualquier otro microorganismo, siempre que se disponga de los medios de estudio
adecuados.
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Tabla 2. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se emplean cinco porciones de 20 ml
No. de tubos que Límites de confianza del 95 % (aproximados)
Índice
dan reacción positiva de
NMP/
un total de cinco
100 ml Superior Inferior
de 20 ml c/u
0 <2,2 0,0 6,0
1 2,2 0,1 12,6
2 5,1 0,5 19,2
3 9,2 1,6 29,4
4 16,0 3,3 52,9
5 >16,0 8,0 Infinito
Tabla 3. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se emplean diez porciones de 10 ml
No. de tubos que Límites de confianza del 95 % (aproximados)
Índice
dan reacción positiva de
NMP/
un total de diez
100 ml
de 10 ml c/u Superior Inferior
0 <1,1 0,0 3,0
1 1,1 0,03 5,9
2 2,2 0,26 8,1
3 3,6 0,69 10,6
4 5,1 1,3 13,4
5 6,9 2,1 16,8
6 9,2 3,1 21,1
7 12,0 4,3 27,1
8 16,1 5,9 36,8
9 23,0 8,1 59,5
10 >23,0 13,5 Infinito
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Tabla 4. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan cinco tubos por dilución (10 ml, 1,0 ml, 0,1 ml)
Índice Límites de confianza del 95 % (aproximados)
Combinación
NMP/
de positivos
100 ml Superior Inferior
0-0-0 <2 - -
0-0-1 2 1,0 10
0-1-0 2 1,0 10
0-2-0 4 1,0 13
1-0-0 2 1,0 11
1-0-1 4 1,0 15
1-1-0 4 1,0 15
1-1-1 6 2,0 18
1-2-0 6 2,0 18
2-0-0 4 1,0 17
2-0-1 7 2,0 20
2-1-0 7 2,0 21
2-1-1 9 3,0 24
2-2-0 9 3,0 25
2-3-0 12 5,0 29
3-0-0 8 3,0 24
3-0-1 11 4,0 29
3-1-0 11 4,0 29
3-1-1 14 6,0 35
3-2-0 14 6,0 35
3-2-1 17 7,0 40
4-0-0 13 5,0 38
4-0-1 17 7,0 45
4-1-0 17 7,0 46
4-1-1 21 9,0 55
4-1-2 26 12 63
4-2-0 22 9 56
4-2-1 26 12 65
4-3-0 27 12 67
4-3-1 33 15 77
4-4-0 34 16 80
Continúa . . .
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Tabla 4. (Final)
Índice Límites de confianza del 95 % (aproximados
Combinación
NMP/
de positivos
100 ml Superior Inferior
5-0-0- 23 9 86
5-0-1 30 10 110
5-0-2 40 20 140
5-1-0 30 10 120
5-1-1 50 20 150
5-1-2 60 30 180
5-2-0 50 20 170
5-2-1 70 30 210
5-2-2 90 40 250
5-3-0 80 30 250
5-3-1 110 40 300
5-3-2 140 60 360
5-3-3 170 80 410
5-4-0 130 50 390
5-4-1 170 70 480
5-4-2 220 100 580
5-4-3 280 120 690
5-4-4 350 160 820
5-5-0 240 100 940
5-5-1 300 100 1300
5-5-2 500 200 2000
5-5-3 900 300 2900
5-5-4 1600 600 5300
5-5-5 >1600 - -
10. INFORME DE ENSAYO
En el informe de ensayo se debe especificar el método usado, la temperatura seleccionada, y
los resultados obtenidos. También se deben mencionar todos los detalles de las operaciones
no especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de
cualesquier incidente que puedan haber influido en los resultados.
En el informe de ensayo se debe incluir toda la información necesaria para la identificación
completa de la muestra.
Método B
Técnicas con sutrato enzimático
11. DEFINICION
Para los propósitos de este método se aplican las siguientes definiciones:
Bacterias Coliformes Totales
Cuando se utiliza la técnica enzimática, el grupo Coliforme Total se define como toda bacteria
que posea la Enzima β-D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de abrir el substrato
cromogénico, resultando en la liberación del cromógeno.
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Escherichia coli
Cuando se utiliza la técnica enzimática, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que
da respuesta positiva al grupo Coliforme Total y además posee la enzima β-glucoronidasa, la
cual tiene la propiedad de abrir el substrato fluorogénico, resultando en la liberación del
fluorógeno.
12. PRINCIPIO
Bacterias Coliformes Totales
Substratos cromogénicos tales como Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosido (ONPG) o clorofenol
rojo β-D-galactopiranósido (CPRG) son utilizados para detectar la enzima β-D- galactosidasa la
cual es producida por las Bacterias Coliformes Totales. La enzima β-D-galactosidasa hidroliza
el substrato y produce un cambio de color, lo cual indica una prueba positiva para Coliformes
totales en 24 h (ONPG) o 28 h (CPRG) sin procedimientos adicionales.
Escherichia coli
Un substrato fluorogénico tal como 4-metil-umbeliferil-β-D-glucoronido (MUG) es utilizado para
detectar la enzima β-glucoronidasa la cual es producida por E.coli. La enzima β-glucoronidasa
hidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando es revelado bajo luz ultravioleta de
onda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica una prueba positiva para E.coli.
El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnología del substrato definido, el cual emplea
nutrientes - indicadores que producen color y/o fluorescencia al ser metabolizados por los
microorganismos Coliformes Totales y E coli; los cuales son detectados simultáneamente.
El reactivo proporciona dos nutrientes indicadores específicos: ONPG (O- nitrofenil -β-d-
galactopiranósido) y MUG ( 4-metil-umbeliferil-β- D- glucorónido). Durante la metabolización de
éstos nutrientes por la enzima Coliforme β-D galactosidasa y β- glucoronidasa de E. coli, se
produce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmada
la presencia de Coliformes totales y de E coli respectivamente.
Interferencias
La técnica del substrato enzimático ONPG-MUG tiene limitaciones, particularmente en aguas
con alta turbiedad; para tales aguas es conveniente hacer diluciones con agua destilada estéril.
Además, si la muestra tiene un color de fondo, se debe comparar bolsas o tubos según el
formato utilizado, que contienen muestra con medio de cultivo inoculado, contra un blanco de
control de la misma muestra de agua y para este caso se recomienda usar CPRG-MUG.
Bacterias no Coliformes tales como Aeromonas y especies de Pseudomonas, pueden producir
pequeñas cantidades de la enzima β- D-galactosidasa, pero son suprimidas y generalmente no
producen una respuesta positiva dentro del tiempo de inoculación a menos que estén
presentes mas de 104 UFC/ml.
Algunas cepas de Shigella spp también pueden producir una respuesta positiva a la
fluorescencia, pero debido a que este microorganismo es un conocido patógeno humano, se
considera que no va en detrimento para la prueba de calidad sanitaria de agua.
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13. EQUIPOS Y MATERIALES
13.1 Autoclave
13.2 Cabina de flujo laminar
13.3 Incubadora a 35,5 °C ± 0,5 °C
13.4 Pipetas Bacteriológicas estériles de 0,1 ml, 1 ml y 10 ml
13.5 Frascos o bolsas estériles de 100 ml
13.6 Tubos tapa rosca ó Bolsas multiceldas
13.7 Sellador para bolsas multiceldas
13.8 Pipeteador
13.9 Lámpara UV de 366 nm y 6 watios de intensidad
14. MEDIOS DE CULTIVO
Medio substrato
Comercialmente se encuentran formulaciones predispensadas para el procedimiento de tubos
múltiples o de botellas por 100 ml para el ensayo presencia ausencia.
15. PROCEDIMIENTO
15.1 PROCEDIMIENTO DE TUBOS MÚLTIPLES
Se selecciona el número apropiado de tubos por muestra con medio predispensado para
prueba de tubos múltiples.
Se siguen las instrucciones del fabricante para preparar seriales de diluciones para varias
formulaciones.
Asépticamente, se agregan 10 ml de muestra a cada tubo, se tapa ajustadamente y se mezcla
vigorosamente para disolver.
La mezcla permanece sin color con la prueba con base en ONPG y se torna amarilla en el
formato CPRG. Algunas partículas pueden permanecer indisolubles durante la prueba; esto no
afecta el comportamiento del ensayo.
Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por el periodo especificado por el fabricante del substrato.
El procedimiento también puede desarrollarse agregando la cantidad apropiada de substrato a
la muestra, mezclando completamente y dispensando en 5 o 10 tubos estériles. Se incuba
como se establece para el procedimiento de tubos múltiples, utilizando las series establecidas
en el Método A.
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15.2 PROCEDIMIENTO MULTICELDA
El procedimiento multicelda es desarrollado con paquetes desechables estériles de medio. Se
agrega la muestra a un recipiente de 100 ml, luego se agrega el substrato, se agita
vigorosamente y se vierte dentro de la bolsa. El sellador de bolsa dispensa la muestra dentro
de los pozos y la sella. Se incube a 35 °C ± 0,5 °C por el período especificado por 24 h. El valor
del NMP es obtenido de la tabla suministrada por el fabricante.
15.3 PROCEDIMIENTO PARA PRESENCIA/AUSENCIA (P/A)
Asépticamente, se agrega el medio enzimático previamente pesado a 100 ml de muestra ,en
un recipiente de vidrio borosilicato no fluorescente y estéril o en una botella equivalente.
Opcionalmente, se agrega 100 ml de muestra al substrato enzimático, en un recipiente estéril
suministrado por el fabricante. Asépticamente, se tapa y se mezcla completamente para
disolver el substrato. Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por 24 h.
16. INTERPRETACIÓN
Bacteria Coliforme Total
Después del período de incubación mínima apropiada se examinan los tubos o los recipientes
para el cambio de color apropiado (véase la Tabla 5). El ONPG es hidrolizado por la enzima de
la bacteria para producir un color amarillo. El CPRG es hidrolizado por la enzima de la bacteria
para producir un color rojo o magenta. Si la respuesta de color no es uniforme a través del tubo
ó la bandeja multicelda, se mezcla invirtiéndolo antes de leer. Se leen las instrucciones del
fabricante como guía para la interpretación. Algunos fabricantes sugieren comparar los tubos ó
bandeja multiceldas de muestra contra un comparador de color disponible suministrado por el
fabricante. Las muestras son negativas para Coliformes totales si no se observa color en el
ensayo con ONPG o si el tubo es amarillo cuando se utiliza CPRG. Si hay una respuesta
cromogénica cuestionable después de 18 h o de 24 h para ONPG, se incuba por un tiempo
adicional de 4 h. Si la respuesta es negativa después de 28 h para el CPRG se incuba hasta
por un tiempo adicional de 20 h. Si el cromógeno se intensifica la muestra es positiva para
Coliformes Totales. Si no la muestra es negativa.
Escherichia coli
Se examinan los tubos positivos de Coliformes totales o los recipientes para fluorescencia
usando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios, de onda larga (366 nm).
Se compara cada tubo ó bandeja multicelda contra el comparador de referencia disponible. La
presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli. Si la fluorescencia es
cuestionable se incuba por un periodo adicional de 4 h para la prueba con ONPG y hasta por
un periodo adicional de 20 h para las pruebas con CPRG; la fluorescencia intensificada es una
prueba de resultado positivo.
17. INFORME DEL ENSAYO
Si se desarrolla un procedimiento tubos múltiples, calcule el NMP para Coliformes totales y
E. coli del numero de tubos positivos como se describe en el numeral 9. Si se desarrolla el
procedimiento de bandeja multiceldas, calcule el NMP para Coliformes y E. coli tomando como
referencia la tabla suministrada por el fabricante. Si se sigue un procedimiento de presencia
ausencia, se reportan los resultados como presencia/ausencia de Coliformes totales y E. coli en
100 ml de muestra.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939
Tabla 5 Cambios de Color para varios medios
Substrato Coliforme Positivo E. Coli Positivo Resultado Negativo
Color demasiado pálido/
ONPG- MUG Amarillo Azul fluorescente
No fluoresce
CPRG- MUG Rojo o Magenta Azul fluorescente Amarillo/ No fluoresce
18. CONTROL DE CALIDAD
Se prueba el comportamiento de cada lote de medio adquirido, inoculando con tres baterías de
control: Escherichia coli, una Coliforme total diferente a E. coli (por ejemplo Enterobacter
cloacae) y una no Coliforme. También, se agrega un control de agua estéril. Si el control de
agua estéril presenta tinte fluorescente o tinte de resultado positivo Coliforme se descarta y se
utiliza un nuevo lote de substrato. Se debe evitar utilizar un inóculo pesado. Si se utiliza
Pseudomonas como el no Coliforme se selecciona una especie no fluorescente. Se incuba
estos controles a 35 °C ± 0,5 °C como se indicó antes. Se lee y se registra los resultados.
19. APÉNDICE
19.1 NORMAS QUE SE DEBEN CONSULTAR
Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante la referencia dentro de este
texto, constituyen la integridad del mismo. En el momento de su publicación eran válidas las
ediciones indicadas. Todas las normas están sujetas a actualización; los participantes,
mediante acuerdos basados en esta norma, deben investigar la posibilidad de aplicar la última
versión de las normas mencionadas a continuación.
NTC 4092:1997, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales
para los análisis microbiológicos. (ISO 7218:1997).
NTC-ISO 5667-3:1995 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Muestreo. Directrices para la
Conservación y manejo de las muestras.
NTC-ISO 5667-5:1996 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Guía para el muestreo de agua
potable y agua utilizada para alimentos y procesamiento de bebidas.
NTC-ISO 5667-14:1999 Calidad de agua muestreo. Parte 14: Guía para el control de la calidad
en el muestreo y en el manejo ambiental del agua.
19.2 DOCUMENTO DE REFERENCIA
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION;
WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods For The Examination of Water and
Wastewater, 20 TH EDITION.1998.Washington Multiple Tube Fermentation Technique for
Members of the Coliform Group (SM 9921) and Enzyme Sustrate Coliform Test (SM 9223).
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939
Anexo A (Normativo )
Esquema de las pruebas presuntiva, confirmativa y completa para la detección de
coliformes totales
Inocular caldo lauril triptosa o caldo presencia asencia en tubos de
fermentación o botellas e incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C
(1) Producción de gas y/o crecimiento ácido. (2) Ausencia de gas o ácido.
Transferir a fase confirmatoria a caldo bilis lactosa Incubación adicional 24 horas
verde brillante. Incubar 48 +/- horas a 35 +/- 0,5°C (total 48 +/- 3 horas)
(a) Gas producido. Transferir a agar (b) No gas producido.
LES Endo o agar MacConkey. Prueba negativa. Grupo (a) Gas o ácido producido.
Incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C coliforme ausente. continue en (1a)
(b) Crecimiento ácido
(1,1) Colonias de coliformes típicas o atípicas. Confirmar como en (1)
Transferir a agar blando y tubos de (1,2) Colonias negativas.
fermentación con caldo lauril triptosa. Incubar Grupo coliforme ausente
agar blando 18 a 24 h y caldo lauril triptosa (c) no producción de ácido
de 24 +/- 2h a 48 +/- 3h a 35 +/- 0,5°C y gas. Prueba negativa
Grupo coliforme ausente
(a') Producción de gas.
(b') Ausencia de gas.
teñir con gran parte
Prueba negativa
del crecimiento en agar blando
Ausencia de grupo coliforme.
(1,11) Presencia de bacilos gramnegativos.
Ausencia de esporas. Prueba completa:
(1,12) Presencia de esporas o esporas y
presencia de grupo coliforme.
bacilos grampositivos. Prueba completa:
Presencia de bacilos gramnegativos y
Ausencia de grupo coliforme
grampositivos. Repetir el procedimiento
comenzando en 1,1
20