1. Fundamentos de Biología molecular Fco Javier Casas Ciria. UGC Análisis Clinicos. Hospital de La Linea. S.A.S. 22 de febrero 2010

2. Estructura DNA

6. Añadir 20 ml de proteinasa K y mezclar con vortex. Incubar a 55 ºC. Mezclar con vortex ocasionalmente durante la incubación para mezclar. Incubación 1-3 horas.

7. Vortex 15 segundo

8. Añadir buffer AL 200 ul, vortex e incubar a 70º 10 minutos.

9. Añadir 200 ul de etanol absoluto, vortex.

10. Pipetear todo en una columna de Dneasy spin. Que se coloca en un tubo de recolección de 2 ml.

11. Centrifugar a 6000 g durante 1 minuto y descartar lo que pasó al tubo de recolección

13. Centrifugar 1 minuto a 6000 g y descartar lo del tubo de recolección

14. Colocal la columna en otro tubo de recolección y añadir 500 ml de buffer AW2.

15. Centrifugar a velocidad máxima durante 3 minutos.

16. Colocar la columna en un tubo de microcentrifuga y pipetear 200 ul de buffer AE.

17. Mantener 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar 1 a 6000 g.

18. Repetir los dos últimos pasos y guardar todo el eluido para estudio del DNA.

20. Se unen a secuencias complementarias de ácidos nucleicos con gran especificidad.

21. Diseñadas para identificar gérmenes o segmentos genéticos detectando secuencias específicas.

22. Formatos de reacción empleados: fase líquida, fase sólida, in situ

25. La sonda no unida se retira tras lavados y se detecta la sonda unida mediante fluorescencia luminiscencia, radiactividad o desarrollo de color.

27. Más usado para confirmación de cultivo de micobacterias y hongos dimórficos.

32. Han aportado oportunidades para el cuidado del paciente

33. El nuevo "gold standard" en varios diagnósticos.

36. Múltiples sondas

37. Multiples capas de sonda

38. Reducción del "ruido" de fondo

40. Como no depende de sistemas enzimáticos no se afectan por la presencia de inhibidores enzimáticos en las muestras clínicas y el proceso de extracción de DNA puede ser más simple.

42. Hybrid Capture Assay Amplificación de la señal

44. La detección se realiza por incubar el complejo con dioxetano, enzima que activa el sustrato y mide la emisión de luz con un luminometro. La señal resultante es directamente proporcional a la cantidad de diana en la muestra

45. Para reducir ruido de fondo por la hibridación inespecífica se emplea isocitidina e isoguanosina en las sondas marcadas y preamplificador de la señal. Forman parejas de base uno con otro pero no con ninguna de las cuatro bases naturales. Así se incrementa la amplificación de la señal específica de la diana sin incrementarse la señal de fondo.

46. Empleado para cuantificación de DNA HBV, RNA HCV, RNA HIV-1

47. Técnicas de bDNA

49. Los hibridos DNA-RNA son capturados por anticuerpos antihíbridos que son usados para para cubrir la superficie de un tubo

50. Luego se añaden anticuerpos antihibridos conjugados con fosfatasa alcalina.

51. El anticuerpo conjugado es detectado con un sustrato quimioluminiscente y la luz emitida es medida en un luminometros.

52. Son multiples conjugados de fosfatasa alcalina los que se unen a cada molécula de híbrido lo que amplifica la señal y la luz emitida es proporcional a la cantidad de DNA diana.

53. Empleado en detección de gonococo, C. Trachomatis, HPV, CMV

54. Técnicas de captura-hibridación

56. Producción de millones a billones de copias en horas

57. Proclive a la contaminación cruzada con material de otras muestras pudiendo dar falsos positivos

60. Realizado por la acción de una enzima, la DNA polimerasa , que bajo ciertas condiciones adecuadas puede copiar DNA

61. La PCR se realiza en el laboratorio por un coctel de sustancias: DNA diana, un exceso de dos oligonucleotidos cebadores (primers), una DNA polimerasa estable al calor, una mezcla equimolecular de desoxiribonucleotido trifosfatos (dATP, DCTP, DGTP, DTTP), MgCl2, KCl y tampón Tris-HCl

62. Cada primer se une a una cadena de DNA flanqueando un segmento de la doble cadena menor de 100 pares de nucletidos

63. Para iniciar la PCR, la mezcla se calienta para separar las dos cadenas de DNA diana y luego enfriado para permitir al primer alinearse con el DNA diana.

65. Los productos de la extensión de los primers son disociados del DNA diana por calor y cada producto de la extensión así como el DNA diana sirve como modelo para ciclos posteriores de alienación de los primers y extensión.

66. Al final de cada ciclo el producto de la PCR es doblado.

67. Todo el proceso es realizado en un termociclador que controla de manera precisa la temperatura de cada paso, el tiempo de cada pasoy el número de ciclos.

70. Primero se produce DNA complementario del RNA diana por transcripción inversa y luego el DNAc es amplificado mediante PCR

71. Para ello se usa una DNA polimerasa del Thermus thermophilus que funciona tanto como retrotranscriptasa y como DNA polimerasa y es termoestable.

72. Esto es importante porque antes se empleaba una retrotranscriptasa del virus de la mieloblastosis aviar que no era termoestable y la formación del DNAc se tenía que hacer a temperatura muy baja, por debajo de la temperatura óptima de alineación, dando a alineamiento inespecíficos y provocando resultados ineficientes.

74. Los primers a emplear tienen que tener igual temperatura de alienamiento y carecer de complementariedad.

75. Desarrollados paneles para el estudio de patógenos del SNC y de patógenos viarels respiratorio.

77. Usando cocientes muy precisos de estos dos fluorocromos se ha creado hasta 100 grupos de microesferas diferentes cada con unas características espectrales distintas.

78. Cada grupo de microesfera puede poseer un reactante diferente sobre su superficie. Para estudio de ácidos nucleicos se unen las sondas de oligonucleotidos a la superficie de las microesferas. Como cada esfera puede distinguirse con su diferente longitud de onda pudiendo medirse hasta 100 parámetros distintos

79. Estas microesferas se miden medinate un citometros de flujo específico y como cientos de esferas pueden ser analizadas por segundo pueden medirse hasta 100 diferentes reacciones en un único tubo de reacción en pocos segundos.

81. El software registra la emisión de fluorescencia en cada ciclo y genera una curva de amplificación para cada reacción

82. La cantidad de diana en una muestra desconocida es determinada por medir el ciclo en que la muestra sobrepasa un umbral y usar una curva estandard con una diana a concentración conocida.

83. Las sondas son marcadas con colorantes fluorescentes

84. PCR en tiempo real

86. Análisis en gel También puede luego transferirse a una membrana de nitrocelulosa o nylon y hibridarse a una sonda específica para aumentar la sensibilidad y especificidad de la detección

88. El producto unido se detecta por un cambio de color que aparece tras añadir un conjugado enzimático y el sustrato adecuado.

89. Durante la amplificación se usan primers marcados con biotina.

90. Tras la amplificación, se fijan a la placa con una sonda de captura,

91. El producto unido es detectado con un conjugado streptavidina-enzima

92. Y se le añade un sustrato cromogénico

93. Line probe assay Producto de PCR marcado con biotina se hibrida de manera específica con sondas inmobilizadas sobre una tira Tras hibridación estreptavidina cojugada con fosfatasa alcalina reacciona con el sustrato añadido en ultimo lugar.

96. Limita el manejo de la muestra con las manos

97. Aumenta la reproductibilidad

99. Obligado a trabajar por lotes de un número fijo de muestras

100. Gran tamaño de algunos de estos aparatos.

103. El tiempo del análisis viene dado por el tiempo que dura la amplificación y este depende de la velocidad en que el termociclador cambie de temperatura, habiendo alguno que cambia hasta 20 ºC por segundo.

107. Taqman (Roche)

109. M2000 (Abbot)

110. GeneXpert (Cepheid)

114. Abrir solo un tubo de muestra cada vez

115. Realizar un pulso a los tubos en la centrífuga previamente a abrirlo

116. Usar tubos con tapón de rosca para evitar aerosoles

117. Descontaminar superficies de trabajo

118. Usar puntas de pipetas con filtros

119. Regularmente "limpiar" pipetas con papel humedecida en etanol (¡NO DEJAR QUE ENTRE ETANOL DENTRO DE LA PIPETA)

120. Pipetas que siempre se usen para la misma función.

121. Desechos en bolsas de plásticos de un solo uso.

122. Usar guantes durante todo el proceso

124. En la PCR se reemplaza dUTP por DTTP, así que DUTP es incorporado en la cadena de DNA que se sintetiza

125. Si el producto conteniendo UTP está presente como contaminante, la adición de UNG a la reacción en la retirada de residuos de desoxiuracilo destruyendo el DNA contaminante.

127. Gracias por su atención