UNIVERSIDAD CATÓLICA
         SANTO TORIBIO DE MOGROVEJO

               Facultad de Medicina
                 Escuela de ...
Materiales y equipos de laboratorio

                           MATERIALES DE VIDRIO
      DIBUJO                NOMBRE   ...
Cubre objeto           Cubre las preparaciones microscópicas
                                                      sobre e...
Centrífuga

Una centrífuga es una máquina que pone en rotación una muestra para separar por fuerza centrífuga
sus componen...
Un autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio,
utilizando vapor de agua...
1.    Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplia la imagen formada en los
         objetivos.
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Medios para aislamientos primarios:

1. Medios Selectivos

Frecuentemente, en el laboratorio se requiere aislar un tipo de...
•   Disponibilidad de nutrientes
  •   Consistencia adecuada del medio
  •   Presencia o ausencia de Oxígeno y otros gases...
En la placa que contenía agar sangre + Streptococcus pyogenes se pudo observar la destrucción total de
glóbulos rojos en l...
Manitol Salado

                                Manitol Salado + Staphylococcus aureus

En la placa se visualizó una zona ...
Resultados

            Microorganismos                  Crecimiento   Características de las colonias
   Staphylococcus a...
Tinción Gram

La tinción de Gram o coloración Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología
para la vis...
resistente y con mayor proporción de peptidoglucanos, no son susceptibles a la acción del solvente
orgánico, sino que este...
Prueba de Catalasa

Luego de agregar la gota de peróxido de hidrógeno a la lámina que contenía la bacteria
Staphylococcus ...
Prueba de Coagulasa

En el tubo de ensayo se evidenció la formación de un coágulo.

La prueba que se realiza generalmente ...
V. CUESTIONARIO

    1.   ¿Qué instrumental y equipo de laboratorio se usa para el diagnóstico microbiológico?

         E...
esterilización (ciertos tipos de endoscopios, los instrumentos quirúrgicos de plástico u otros
componentes que no se puede...
solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros, cerrándolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo...
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Guia II: Materiales y equipos de uso frecuente en Microbiología. Aislamiento e identificación de bacterias Gram Positivas

  1. 1. UNIVERSIDAD CATÓLICA SANTO TORIBIO DE MOGROVEJO Facultad de Medicina Escuela de Medicina MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA Práctica N°02 Materiales y equipos de uso frecuente en Microbiología Aislamiento e identificación de bacterias Gram + Jesús Alonso Custodio Marroquín Código: 062ac03464 Ciclo 2009 - IV
  2. 2. Materiales y equipos de laboratorio MATERIALES DE VIDRIO DIBUJO NOMBRE UTILIDAD Son utensilios que permiten calentar Vaso de Precipitado sustancias hasta obtener precipitados. Placa Petri Sirve para crear cultivos microbianos Asa de Drigalsky Asa para siembra por diseminación en superficie. Pipeta Traspaso de líquidos en volúmenes exactos. Embudo Permite filtrar sustancias Matraz Permite preparar soluciones líquidas Balón de base plana Se utiliza para contener sustancias. Es una variación del matraz balón. Tubo de ensayo Permite contener pequeñas muestras líquidas y realizar reacciones en pequeña escala. Pera de decantación Se utiliza para separar líquidos inmiscibles. Bagueta agitar soluciones o liquidos, con el fin de homogenizar Frasco gotero Permite contener sustancias. Posee un gotero y por esa razón permite dosificar las sustancias en pequeñas cantidades. Luna de reloj Es un utensilio que permite contener sustancias corrosivas.
  3. 3. Cubre objeto Cubre las preparaciones microscópicas sobre el portaobjeto. Porta objeto Lámina donde se coloca el objeto para poder ser observado en el microscopio. Probeta Permite medir volúmenes Fiola Se emplean en operaciones de análisis químico cuantitativo, para preparar soluciones de concentraciones definidas. MATERIALES DE METAL DIBUJO NOMBRE UTILIDAD Pinza para tubos de ensayo Permiten sujetar tubos de ensayo y si éstos se necesitan calentar, siempre se hace sujetándolos con estas pinzas, esto evita accidentes como quemaduras. Espátula Es un utensilio que permite tomar sustancias químicas con ayuda de este utensilio evitamos que los reactivos se contaminen. Trípode Se utilizan para sostener materiales que van a ser sometidos a un calentamiento. Rejilla Se utiliza para sostener utensilios que se van a someter a un calentamiento y con ayuda de este utensilio el calentamiento se hace uniforme. Soporte universal Es un utensilio de hierro que permite sostener varios recipientes. Mechero Es un utensilio metálico que permite calentar sustancias. Equipos de Laboratorio
  4. 4. Centrífuga Una centrífuga es una máquina que pone en rotación una muestra para separar por fuerza centrífuga sus componentes o fases (generalmente una sólida y una líquida), en función de su densidad. Existen diversos tipos de centrífugas, comúnmente para objetivos específicos. Una aplicación típica consiste en acelerar el proceso de sedimentación, dividiendo el plasma y el suero en un proceso de análisis de laboratorio. También se utiliza para determinar el grupo sanguíneo mediante una toma de muestra capilar. En este caso la máquina utilizada se denomina microcentrífuga. Otra aplicación de las centrífugas es la elaboración de aceite de oliva. En ella las aceitunas una vez molidas y batidas se introducen en una centrífuga horizontal en la que se separa el aceite que es la fracción menos pesada del resto de componentes de la aceituna; agua, hueso, pulpa etc.1 Incubadora En microbiología una incubadora es un equipo cerrado que permite controlar la temperatura, humedad y otras condiciones necesarias para el desarrollo de un cultivo microbiológico. Las incubadoras mas simples son cámaras aisladas con temperatura ajustable que típicamente va de 60 a 65º C, aunque pueden alcanzar temperaturas mayores, generalmente hasta 100º C. Los modelos mas sofisticados incluyen la posibilidad de refrigerar el contenido, controlar la humedad, y el nivel de dióxido de carbono. La mayoría de los equipos incluye un temporizador programable, para realizar ciclos de temperaturas variables al igual que de los otros factores ambientales. El tamaño de las incubadoras puede variar desde un tamaño para usar sobre una mesa, hasta cámaras del volumen de una habitación. Otra capacidad de las incubadoras de este tipo es controlar la velocidad de vibración, medida en revoluciones por minuto. La temperatura de cultivo para las bacterias más comunes, como por ejemplo Escherichia coli es de 36 a 37ºC. Para otros organismos como el de la levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) se requieren temperaturas del orden de 30ºC.2 Autoclave
  5. 5. Un autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura para ello, evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento del autoclave es que coagula las proteinas de los microorganismos debido a la presión y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos microorganismos, así como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave. Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos. Los autoclaves más modernos permiten realizar procesos a mayores temperaturas y presiones, con ciclos estándares a 134 ºC a 200 kPa durante 5 min para esterilizar material metálico; llegando incluso a realizar ciclos de vacío para acelerar el secado del material esterilizado.3 Horno Esterilizador Esteriliza por medio de calor seco, se utiliza para esterilizar material de vidrio, porcelana y también para objetos metálicos. El material deberá introducirse en el horno una vez limpio y seco, una vez introducido hay que procurar que estos no toquen las paredes de la estufa, porque alcanza temperaturas muy altas Una vez introducido el material, se cierra el horno y se enciende, dejandolo calentar hasta 180 º, dejándolo a estas temperaturas por espacios de tiempo variables, dependiendo del tipo de material que se ha introducido. Una vez transcurrido el tiempo deseado se apagará y se dejará enfriar totalmente antes de sacar el material. Baños María El baño María o baño de María es un método empleado en el laboratorio para conferir temperatura uniforme a una sustancia líquida o sólida o para calentarla lentamente, sumergiendo el recipiente que la contiene en otro mayor con agua que se lleva a o está en ebullición El concepto fundamental es el de baño que implica el calentamiento indirecto, por convección térmica del medio (agua del baño) y por conducción térmica de la sustancia; ese medio (baño) puede ser de aceite mineral, de agua pura o soluciones salinas de agua de concentraciones y solutos diferentes, etcétera, según la temperatura a que se requiera llevar la sustancia.4 Partes del microscopio y sus funciones.
  6. 6. 1. Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplia la imagen formada en los objetivos. 2. Brazo: Sostiene la estructura del microscopio. 3. Control de iluminación: Permite dosificar la intensidad de iluminación. 4. Botón de encendedlo y apagado. 5. Tornillo micrométrico: tornillo de enfoque, mueve la platina hacia arriba y hacia debajo de manera lenta. 6. Tornillo macrométrico: tornillo de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo de forma rápida. 7. Botón de desplazamiento: permite el movimiento de la platina. 8. Botón de desplazamiento: permite el movimiento de la platina. 9. Ventana de iluminación: permite la entrada de la luz. 10. Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. 11. Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el condensador. 12. Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. 13. Objetivo: lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. lo que significa que es muy importante este elemento del microscopio, es un elemento vital que permite ver a través de los oculares. 14. Revólver: Es un sistema que coge los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro. Preparación de Medios de Cultivo: Selectivos y No selectivos
  7. 7. Medios para aislamientos primarios: 1. Medios Selectivos Frecuentemente, en el laboratorio se requiere aislar un tipo de bacteria a partir de una mezcla de diversos tipos. Para esto, se han diseñado medios de cultivo que favorecen el crecimiento de la bacteria de interés y que inhiben el resto. Esto puede lograrse mediante el uso de sustancias inhibitorias como los antibióticos o cierta concentración de algunas sales; o simplemente agregando que sea utilizada únicamente por el tipo de bacteria que se desea aislar. Un medio de cultivo de este tipo de denomina Medio Selectivo. Algunos ejemplos de este tipo de medio son: • EL agar sal, que posee una concentración de NaCl del 10%, lo que inhibe a la mayoría de bacterias, no así a algunas como el Staphylococcus aureus, el cual puede crecer sin dificultad. • El agar celulosa, el cual contiene celulosa como única fuente de carbono. Sólo bacterias capaces de utilizar este compuesto se pueden desarrollar.5 2. No selectivos: Para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) 6 3. Enriquecidos: Suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).6 4. Especializados: Formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).6 Medio de identificación Medios diferenciales Se conoce con este nombre a aquello medios de cultivo que permiten distinguir diferencias metabólicas de diversas especies o géneros de bacterias o de ciertos grupos de las mismas. Para este fin se incorporan al medio de cultivo alguna sustancia que pueda ser metabolizada por las bacterias que son de interés. Por ejemplo, muchas bacterias fermentan azúcares produciendo ácido, mientras que otras no. Si se incorpora un azúcar, como la lactosa, en el medio y además se agrega un indicador ácido-base, se podrá saber si la bacteria fermenta debido al cambio de color que ocurre al acidificarse el medio de cultivo.5 Los medios de cultivo para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables deben cumplir con los siguientes requisitos:
  8. 8. • Disponibilidad de nutrientes • Consistencia adecuada del medio • Presencia o ausencia de Oxígeno y otros gases • Condiciones adecuadas de humedad (mantener en frigorífico) • Luz ambiental • pH adecuado • Temperatura • Esterilidad 7 Agar Sangre
  9. 9. En la placa que contenía agar sangre + Streptococcus pyogenes se pudo observar la destrucción total de glóbulos rojos en las zonas donde fue sembrada la bacteria (Beta hemólisis) Streptococcus pyogenes es una bacteria Gram-positiva que crece en largas cadenas. S. pyogenes muestra el Antígeno grupo A en sus paredes celulares y hace Hemólisis del tipo beta-hemólisis cuando se cultiva en agar sangre. S. pyogenes típicamente produce grandes zonas (halo) de beta-hemólisis, con completa rotura de eritrocitos y la recuperación de hemoglobina, y por eso se los llama Grupo A (beta- hemolítico) Streptococcus (abreviado GAS). Puede ser encapsulado por lo que es resistente a la fagocitosis. Streptococcus pyogenes + Agar Sangre Fundamentación: Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis.8 Composición: La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. 8 Fórmula (en gramos por litro) Infusión de músculo de corazón 375.0 Peptona 10.0 Cloruro de sodio 5.0 Agar 15.0 pH final: 7.3 ± 0.2 . Resultados Microorganismos Crecimiento Hemólisis E. coli ATCC 25922 Abundante -- S. aureus ATCC 25923 Abundante Beta S. pyogenes ATCC 19615 Abundante Beta S. pneumoniae ATCC 6305 Abundante Alfa S. pneumoniae ATCC 49619 Abundante Alfa
  10. 10. Manitol Salado Manitol Salado + Staphylococcus aureus En la placa se visualizó una zona de color amarillo, lo que confirmaba la presencia de la bacteria.Staphylococcus aureus. La zona roja se interpreta como una prueba negativa, debido al no crecimiento de la colonia. Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria. También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar. Fundamento Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.9 Fórmula (en gramos por litro) Extracto de carne 1.0 Pluripeptona 10.0 d-Manitol 10.0 Cloruro de sodio 75.0 Agar 15.0 Rojo de fenol 0.025 pH final: 7.4 ± 0.2
  11. 11. Resultados Microorganismos Crecimiento Características de las colonias Staphylococcus aureus ATCC 25923 Excelente Amarilla Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Bueno Roja Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Inhibido Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Inhibido Inhibido Características del medio Medio preparado: rojo 9 Características de las colonias observadas. Las características de las colonias observadas son: • Forma: Circular • Borde: Entero • Elevación: Plana • Superficie: Lisa o rugosa
  12. 12. Tinción Gram La tinción de Gram o coloración Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. Explicación: El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina) Fundamento Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína). Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglucano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglucano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más
  13. 13. resistente y con mayor proporción de peptidoglucanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.10 Dado que los dos tipos de bacterias: Staphylococcus y Streptococcus son Gram Positivas, se tiñeron de una coloración azul-violácea, lo cual se pudo observar con ayuda del microscopio. Streptococcus: en forma de cadenas Staphylococcus: en forma de racimos.
  14. 14. Prueba de Catalasa Luego de agregar la gota de peróxido de hidrógeno a la lámina que contenía la bacteria Staphylococcus aureus, se observó la aparición de burbujas, dando como resultado una catalasa positiva. Algunas bacterias y los macrófagos pueden reducir el oxígeno diatómico a peróxido de hidrógeno o superóxio, que son tóxicos para las bacterias. Si embargo algunas bacterias poseen enzimas para defenderse de esas sustancias. Una de ellas es la catalasa. La prueba para detectar catalasa requiere añadir peróxido de hidrógeno al cultivo o la placa de agar y, si la bacteria tiene catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en oxígeno. En tal caso se producen burbujas, que indican que la prueba es positiva Se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima catalasa, capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada (H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma de burbujas en el medio. El H2O2 se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azúcares; si se acumulara sería tóxica para la bacteria. Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Se emplea para diferenciar el género Staphylococcus (catalasa positivo) del género Streptococcus (catalasa negativo.11 .
  15. 15. Prueba de Coagulasa En el tubo de ensayo se evidenció la formación de un coágulo. La prueba que se realiza generalmente sobre las colonias de estafilococos es la de la coagulasa. Se trata de una enzima capaz de inducir la coagulación del plasma, de manera similar a la conversión del fibrinógeno en fibrina que lleva a cabo la trombina. Esta prueba es importante para diferencias Staphylococcus aureus de los estafilococos coagulasa-negativos, como Staphylococcus epidermidis, que son a menudo comensales cutáneos. El Staphylococcus aureus posee dos tipos de coagulasa: a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina). b. Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor (CRF), formándose un complejo coagulasa- CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test entubo).12
  16. 16. V. CUESTIONARIO 1. ¿Qué instrumental y equipo de laboratorio se usa para el diagnóstico microbiológico? El instrumental y equipo de laboratorio que suele emplearse en el diagnostico microbiológico son las placas petri y tubos de ensayo, los cuales son utilizados para cultivar bacterias tanto en medio liquido (caldo en tubos de ensayo) y en medio sólido (agar en placas petri), asas bacteriologías para hacer el cultivo bacteriano, laminas porta objetos, para observar las bacterias y hacer la tinción gram, beakers, matraces, morteros, buretas, lunas reloj entre otros. Los equipos utilizados son las centrifugadoras, el horno, la estufa, acá se cultivan las bacterias ya que proporciona la temperatura ideal para que cada bacteria pueda desarrollarse, la máquina para baño maría y el autoclave el cual sirve para esterilizar los materiales, otro instrumento también es el microscopio, el cual nos permite observar bacterias y microorganismos y de esa manera diferenciarlos según su morfología. 2. ¿Qué es un desinfectante, cómo es su mecanismo y cuál es su importancia en el laboratorio de microbiología? El desinfectante es toda sustancia química que permite la eliminación de todas las formas vegetativas de microorganismos desde una superficie inanimada. Los desinfectantes intervienen en algunas etapas de la vida microbiana. Los mecanismos de acción desinfectante son complejos. La acción puede ejercerse principalmente sobre una función comprometiéndose luego otra, algunas veces reversible y otras irreversibles. Dentro de los principales mecanismos de acción de los desinfectantes se encuentran: • Daño de la pared celular, llevando a los microorganismos a la lisis. • Alteración de la permeabilidad de la membrana citoplasmática, impidiendo el transporte selectivo de nutrientes al interior de la célula bacteriana. • Alteración de la naturaleza coloidal del citoplasma, desnaturalizándola o coagulándola. • Inhibición de la acción enzimática. • Formación de antimetabolitos. • Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos. ACCIÓN GRUPO QUÍMICO Pared celular y membrana celular - Aldehídos - Tensioactivos aniónicos - Fenoles y derivados - Biguanidas Material nuclear - Óxido de etileno - Colorantes - Agentes alquilantes Enzimas o proteínas – Agentes oxidantes - Halógenos - Alcoholes - Ácidos y álcalis - Metales pesados Los microorganismos también pueden ser destruidos mediante procedimientos de desinfección, aunque los más resistentes pueden sobrevivir. Por desgracia, los términos desinfección y esterilización a menudo se utilizan indistintamente, lo que genera una cierta confusión. Ello se debe a que los procesos de desinfección se han dividido en varios grados (alto, medio y bajo). La desinfección de alto grado por regla general posee una eficacia semejante a la de la esterilización, mientras que las esporas pueden sobrevivir tras una desinfección de grado intermedio; asimismo, numerosos microorganismos pueden seguir siendo viables después de una desinfección de bajo grado. La desinfección de alto grado se utiliza para objetos empleados en procedimientos invasivos que o pueden soportar los métodos de
  17. 17. esterilización (ciertos tipos de endoscopios, los instrumentos quirúrgicos de plástico u otros componentes que no se pueden someter a la acción del autoclave). Son ejemplos de desinfectantes de alto grado el tratamiento con calor húmedo, y la utilización de líquidos como el glutaraldehido, el peróxido de hidrogeno, el acido paraacético, y compuestos clorados. Los desinfectantes de grado medio; alcoholes, compuestos yodados, compuestos fenólicos; se utilizan para la limpieza de superficies o instrumentos en los que es poco probable la contaminación con esporas bacterianas o microorganismos con un alto grado de resistencia. Entre estos objetos se encuentran los endoscopios fibroopticosflexibles, los laringoscopios, los espéculos vaginales y los circuitos respiratorios usados en anestesia. Por último los desinfectantes de grado bajo (compuestos de amonio cuaternarios) se utilizan para tratar instrumentos y dispositivos que no revisten una gran importancia, como los manguitos de los aparatos empleados para tomar la tensión arterial, los electrodos de los electrocardiógrafos y los estetoscopios. Aunque estos objetos entran en contacto con los pacientes, no atraviesan las mucosas ni los tejidos estériles. 13 3. ¿Qué es un agente esterilizante, cómo es su mecanismo y cuál es su importancia en el laboratorio de microbiología? Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos diferentes: - bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano; - bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias Dentro de los bactericidas encontramos a los agentes esterilizantes son aquellos que producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana (o sea, su “muerte” o pérdida irreversible de su viabilidad) La esterilización consiste en la destrucción completa de todos los microorganismos, incluidas las formas resistentes como esporas bacterianas, virus sin envoltura (no lipídicos) y hongos. Ello puede conseguirse mediante esterilización física, esterilización gaseosa y esterilización química. Los esterilizantes físicos, como el calor húmedo y el calor seco, son los métodos de esterilización utilizados más a menudo en hospitales y laboratorios y están indicados para la mayoría de materiales, con excepción de los termo sensibles o los que poseen componentes químicos tóxicos y volátiles. El esterilizante gaseosa utilizado más a menudo es el oxido de etileno, aunque es muy eficiente, se trata de una sustancia muy inflamable, explosiva y cancerígena para los animales de laboratorio y existen unas estrictas regulaciones que restringen su utilización. También es limitada la esterilización con formaldehido gaseoso puesto que este compuesto químico es cancerígeno. Su uso se confía principalmente a los filtros de partículas de alta eficiencia. Los vapores de peróxido de hidrogeno también constituyen un esterilizante eficaz como consecuencia de la naturaleza oxidante del gas. 4¿Cuál es el fundamento de la tinción GRAM? Los fundamentos de la tinción gran se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias gran positivas posee un gruesa capa de peptidoglucano además de dos clases de acidos teicoicos, anclado en la cara interna de la pared celular y unido a una membrana plasmática, se encuentra el acido lipoteicoico, y más en la superficie, el acido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureina). Por el contrario la capa de péptido glicanode las gram negativas es delgada y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de péptido glicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteínas, fosfolipidos y lipopolisacaridos. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de la pared. La clave es el péptido glicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las gram negativas. La gran diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las gram negativas es soluble en solventes orgánicos , como por ejemplo la mezcla alcohol/cetona. La capa de péptido glicano que posee es demasiado delgada como para retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formo previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de péptido glicano, no son susceptibles a la acción del
  18. 18. solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros, cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea. VI. CONCLUSIONES • Streptococcus pyogenes produce Beta-oxidación en el Agar Sangre. • Staphylococcus aureus es coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. • Tanto Streptococcus pyogenes como Staphylococcus aureus son bacterias Gram Positivas, por lo que se tiñen de un color azul-violáceo. • Los Staphylococcus aureus tienes forma de racimos. • Los Streptococcus pyogenes tienen forma de cadenas. • Staphylococcus aureus es catalasa positivo, mientras que el Streptococcus pyogenes es catalasa negativo. • Staphylococcus aureus es coagulasa positivo. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Wikipedia.org. Centrífuga [Sede Web]. España: Wikipedia.org; 2009- [actualizado el 25 de agosto de 2009; acceso el 28 de agosto de 2009]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Centr%C3%ADfuga 2. Wikipedia.org. Incubadora [Sede Web]. España: Wikipedia.org; 2009- [actualizado el 24 de agosto de 2009; acceso el 28 de agosto de 2009]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Incubadora 3. Wikipedia.org. Autoclave [Sede Web]. España: Wikipedia.org; 2009- [actualizado el 14 de junio de 2009; acceso el 28 de agosto de 2009]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Autoclave_de_laboratorio 4. Wikipedia.org. Baño María [Sede Web]. España: Wikipedia.org; 2009- [actualizado el 19 de julio de 2009; acceso el 28 de agosto de 2009]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Ba %C3%B1o_Mar%C3%ADa 5. García V. Introducción a la Microbiología. 2ed. España: EUNED; 2002. 6. Microinmuno.ar. Medios de cultivo en microbiología [Sede Web]. Argentina: Microinmuno.ar; 2009 – [acceso el 28 de agosto de 2009]. Disponible en: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm 7. Wikipedia.org. Cultivo Microbiano [Sede Web]. España: Wikipedia.org; 2009- [actualizado el 12 de julio de 2009; acceso el 28 de agosto de 2009]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_(microbiologia) 8. Britanialab.com. Sangre Agar Base [Sede Web]. Argentina: Britanialab.com; 2008-[acceso el 28 de agosto de 2009] Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/sangreagarbase.htm 9. Britanialab.com. Manitol Salado [Sede Web]. Argentina: Britanialab.com; 2008-[acceso el 28 de agosto de 2009] Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/manitolsalagar.htm 10. Wikipedia.org. Tinción Gram [Sede Web]. España: Wikipedia.org; 2009- [actualizado el 12 de julio de 2009; acceso el 28 de agosto de 2009]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram 11. Gonzáles J. Técnicas y Método de Laboratorio Clínico. 2ed. España: Masson; 2006. 12. Struthers K y Westran R. Clinical Bacteriology. 1ed. España: Masson; 2003. 13. Secretaría Distrital de Salud de Bogotá. Uso de desinfectantes. 1ed. Colombia: Esfera Editoriales Ltda; 2004.

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