1Práctica 1           Producción de anticuerpos policlonales                     Inmunización experimental de ratones     ...
2La mayoría de los antígenos de interés son las sustancias solubles, los cuales tienen unainmunogenicidad variable dependi...
3Protocolo de InmunizaciónEsquema de inmunización para la producción de anticuerpos policlonalesPara la obtención de antis...
4    particulares del ratón (marca de corte), tipo de inmunógeno, dosis del inmunógeno, vías de    inoculación y desangrad...
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7Día 37 (18-11-2010) Cuarta inmunización (Tercer refuerzo)Objetivo: 1. Inocule cada ratón del grupo A, por vía subcutánea,...
83. Administre el segundo refuerzo con 15 días de intervalo. Tome muestra de sangre del ratón previo   a la inmunización y...
9Protocolo de inmunización Semestre B-2010Producción de anticuerpos de ratón policlonales anti-Pgr24 mediante la inoculaci...
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  1. 1. 1Práctica 1 Producción de anticuerpos policlonales Inmunización experimental de ratones Semestre B-2010IntroducciónLos anticuerpos o inmunoglobulinas son un grupo de glicoproteínas heterogéneas presentes en elplasma y en los tejidos que poseen una especificidad de enlace para un antígeno particular. Elmétodo usual para producir anticuerpos policlonales experimentalmente consiste en la inoculaciónde animales con preparaciones purificadas o parcialmente purificadas de antígeno (inmunógeno).La administración de un inmunógeno in vivo estimula diferentes células del sistema inmune, dandoorigen a una población mixta de anticuerpos derivados de un número variado de clones delinfocitos B (policlonal). El suero de un animal inmunizado contiene estos anticuerpos y es referidocomo antisuero policlonal.Los anticuerpos policlonales son particularmente valiosos como reactivos biológicos para el estudiode proteínas, células y tejidos cuando se utilizan en técnicas muy diversas, tales como: ELISA,inmunofluorescencia e inmunotransferencia.Los métodos de inmunización experimental son muy variados y dependen del uso que se le quieradar al anticuerpo producido. En general, al establecer un protocolo de inmunización experimentalse debe tomar en consideración un conjunto de factores que afectan el tipo y la magnitud de larespuesta humoral del animal inmunizado. Estos factores son los siguientes: la especie del animalutilizado, la constitución genética del animal, el tipo, la dosis y la ruta de administración delinmunógeno, el número de inmunizaciones (refuerzos) y el uso de adyuvantes.La selección del animal para la producción de anticuerpos policlonales depende de la cantidad deantisuero deseada, la experiencia previa con el inmunógeno y la distancia evolutiva entre laespecie de donde se aisló el inmunógeno y la especie del animal inmunizado. En el laboratorio seinmuniza frecuentemente conejos puesto que son fáciles de mantener, responden bien frente a unamplio rango de antígenos y es posible obtener hasta 25 ml de suero de cada desangrado sinefectos dañinos para el animal. Sin embargo, la inmunización experimental puede realizarsetambién en otras especies, tales como: ratones, ratas, cobayos, gallinas, cabras y ovejas. Laconstitución genética del animal influye sobre el tipo y grado de respuesta inmune del animalinmunizado. Los genes que codifican el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), losreceptores de antígeno de los linfocitos T y B y otros genes involucrados en los mecanismosinmunoregulatorios juegan un papel fundamental en la respuesta inmune. Por tal razón se sueleinmunizar de dos a tres conejos y de 4 a 6 ratones con el mismo antígeno.La producción de anticuerpos policlonales depende en gran medida de la calidad, cantidad ypureza del inmunógeno así como la especificidad y sensibilidad del ensayo donde se desee utilizarel anticuerpo.Las proteínas son las moléculas más inmunogénicas, mientras que los carbohidratos, los lípidos yácidos nucleicos son poco inmunogénicos. En general, mientras más purificado y menosheterogéneo sea un antígeno, mayor será la probabilidad de obtener el anticuerpo deseado conalta especificidad. El principal problema con las preparaciones de antígenos heterogéneas es lafalta de especificidad deseada en el antisuero resultante, ya que algunas moléculas contaminantesde la preparación son frecuentemente más antigénicas que el inmunógeno de interés y el antisueroresultante podría tener mayor especificidad hacia las moléculas contaminantes que hacia laproteína de interés.
  2. 2. 2La mayoría de los antígenos de interés son las sustancias solubles, los cuales tienen unainmunogenicidad variable dependiendo del tamaño de la molécula y de la composición química.Las moléculas más inmunogénicas tienen una masa molecular cerca de 100.000 Da mientras quelas sustancias con pesos inferiores a 5000 Da son poco inmunogénicas. Estas sustancias de bajopeso pueden hacerse inmunogénicas si se les conjuga químicamente a una proteína (hapteno-portador).La mayoría de los antígenos requieren la adición de sustancias adyuvantes a fin de mejorar suinmunogenicidad. Un adyuvante es una sustancia que al inocularse junto con el antígeno mejora demanera no específica la respuesta inmune frente a ese antígeno. Ellos prolongan la persistenciadel antígeno, aumentan las señales coestimulatorias y estimulan la proliferación de linfocitos demanera inespecífica. Entre los adyuvantes más utilizados se encuentran las sales de aluminio,carbón, aceites minerales, y componentes de la pared bacteriana. El adyuvante de Freudincompleto es muy utilizado y está constituido por una mezcla de aceite mineral y detergentemientras que la incorporación de Mycobacterium tuberculosis a la mezcla de aceite produce eladyuvante completo de Freud.La magnitud de la respuesta inmune depende también de la dosis del inmunógeno administrada.Dosis muy bajas o muy altas de inmunógeno no estimulan respuesta inmune o inducen un estadode ausencia de respuesta inmune (anérgia). En líneas generales, los conejos se inmunizan condosis entre 10 y 1000 μg, mientras que los ratones son inmunizados con dosis entre 1 y 100 μg.Después de la primera inoculación (inmunización primaria) del antígeno, hay un período de latenciadonde no se detectan anticuerpos en el suero del animal, seguido por la producción de niveles deanticuerpos de tipo IgM detectables en el suero después de 7 días. Los anticuerpos de tipo IgG seproducen de 3 a 4 días más tarde. Posteriormente se desvanece la respuesta inmunerelativamente rápido. Sin embargo, si después de un período de tiempo re-inoculamos el mismoantígeno (inmunización de refuerzo) al animal inmunizado, esto conduce a la producción de unarespuesta inmune secundaria, la cual tiene un período de latencia más corto y produce mayoresniveles de anticuerpos. La respuesta secundaria posee altos niveles de anticuerpos del tipo IgG eIgA. La respuesta de IgM será similar a la obtenida en la inmunización primaria, mientras que losanticuerpos IgG específicos serán detectables entre el 3 y 4 día después del refuerzo, alcanzandoun pico después de los 10 a 14 días y serán producidos durante mayor tiempo que en la respuestainmune primaria. La generación de una respuesta inmune secundaria eficiente requiere que losrefuerzos sean administrados después que la respuesta inmune primaria haya decaído (mínimo 2semanas), de lo contrario se producirá un estado de anérgia. Los refuerzos resultan en un aumentode la afinidad y la avidez de los anticuerpos producidos por el antígeno. Durante la producción deantisueros, es común administrar de 2 a 3 inyecciones de refuerzos.El objetivo de la práctica es la obtención de sueros policlonales mediante inmunizaciónexperimental las cuales incluyen el manejo de técnicas de inmovilización del animal, inoculaciónpor varias rutas parenterales y desangrado que garanticen el menor dolor e incomodidad en elanimal y a la vez asegure la administración exitosa de la sustancia inmunogénica.Objetivos del trabajo práctico • Obtención de anticuerpos policlonales específicos anti Trypanosoma cruzi, mediante inmunización experimental de ratones NMRI o Balb/c. • Familiarizar al estudiante con las técnicas de inmovilización de animal; preparación del inmunógeno con o sin adyuvante; inoculación de inmunógenos a través de diferentes rutas; preparación de sueros y extracción de muestras de sangre de animales de laboratorio.
  3. 3. 3Protocolo de InmunizaciónEsquema de inmunización para la producción de anticuerpos policlonalesPara la obtención de antisueros de ratón, específicos contra Trypanosoma cruzi, hemos diseñadoun protocolo o esquema de inmunización que consiste en la inoculación de una preparaciónpurificada de una proteína recombinante (Pgr24) del parásito T. cruzi, por tres vías parenteralesdiferentes, en cuatro oportunidades, durante el curso de un semestre. Cada grupo experimentalconformado por 5 ratones, para un total de 15 individuos.El primer grupo de ensayo (A), constituido por 5 ratones serán inoculados por primera vez con unadosis de 100 μg de la proteína recombinante Pgr24 de T. cruzi previamente purificada, enpresencia de adyuvante completo de Freud, vía intraperitoneal. Después de 15 días de la primerainmunización se realiza la primera inmunización de refuerzo por vía intradérmica utilizando la mitadde la dosis del antígeno (50 μg) inoculada en la primera inmunización junto con adyuvanteincompleto de Freud. Se continúa el segundo refuerzo por vía subcutánea, después de un intervalode 15 días, inoculando la misma dosis de antígeno utilizada en el primer refuerzo, luego de unintervalo de 15 días, un tercer refuerzo del antígeno recombinante en solución salina. El segundogrupo experimental (B) serán inoculados sólo con adyuvante de Freud, siguiendo el mismoprotocolo, intervalos y vía de inoculación similar a lo descrito para el grupo A. El tercer grupoexperimental (5 ratones restantes), al que llamaremos control (C), será sometido al mismoesquema de inmunización y refuerzo cada 15 días, pero se inoculará sólo con solución salina.Antes de la primera inmunización, después de la primera inmunización y de los refuerzos se extraeuna pequeña muestra de sangre a fin de valorar el desarrollo de la respuesta inmune en los sueros.Una vez que aparece una respuesta de anticuerpos óptima (determinada por algún métodoserológico, por ejemplo inmunofluorescencia o E.L.I.S.A.) el animal se desangra por puncióncardíaca a cielo abierto o bien se puede continuar las inmunizaciones de refuerzos y realizarsangramientos secuenciales a fin de obtener los antisueros.Procedimiento a seguir en el protocolo de inmunizaciónDía 1 (07-10-2010) Primera inmunizaciónObjetivos: • Inocule cada ratón del grupo A, en la cavidad peritoneal, un volumen total de 0,2 ml de emulsión que contiene 100 μg de la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración inicial 1 mg/ml) en presencia de adyuvante completo de Freud (ACF). • Inocule cada ratón del grupo B, un volumen de 0,2 ml de emulsión que contiene adyuvante completo de Freud (ACF) en solución salina. • Inocule cada ratón del grupo C, un volumen de 0,2 ml de solución salina.Identificación de los ratones a ser inmunizados 1. Identifique los ratones que serán inmunizados colocando una marca, con una gasa embebida en una solución de ácido pícrico (en la frente, una de las patas, lomo o abdomen del animal utilizando). Otra manera de realizar el marcaje es realizando pequeños cortes, previa asepsia, en la oreja y cola del animal.2. Pese los ratones.3. Lleve en su cuaderno el registro de los datos de identificación del animal: sexo, peso, marca con ácido pícrico, edad del animal, fecha de nacimiento, fechas de inmunizaciones, señas
  4. 4. 4 particulares del ratón (marca de corte), tipo de inmunógeno, dosis del inmunógeno, vías de inoculación y desangrado total. Grupo marcas Edad/Peso (g) Tratamiento OD: oreja derecha cortada OI: oreja izquierda cortada A DOC: dos orejas cortadas Inmunógeno + Adyuvante CC: cola cortada OD/CC: oreja derecha y cola cortadas OD: oreja derecha cortada OI: oreja izquierda cortada B DOC: dos orejas cortadas Adyuvante CC: cola cortada OD/CC: oreja derecha y cola cortadas OD: oreja derecha cortada OI: oreja izquierda cortada C DOC: dos orejas cortadas Solución salina CC: cola cortada OD/CC: oreja derecha y cola cortadasMuestra de sangre Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la primera inmunización. Separe el suero, colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene a -20° C.Prepare la emulsión del antígeno junto con el adyuvante Cada ratón del grupo A recibirá, en cavidad abdominal, 200 μl de la mezcla de inmunógeno y adyuvante completo de Freud (proporción 1:1 v/v), que contiene un total de 100 μg de Pgr24 recombinante purificado de T. cruzi. 1. Prepare 1 ml de emulsión de inmunógeno y adyuvante completo de Freud para inocular los 5 ratones de la caja A, de tal manera que 0.2 ml de emulsión contenga 100 μg del antígeno. El antígeno recombinante de T. cruzi se encuentra en una concentración de 1 μg/μl. Concentración inicial de la preparación de inmunógeno 1 μg/μl Dosis del antígeno a inocular a cada ratón 100 μg / 200 μl Volumen final de la emulsión a preparar para inocular 5 ratones (Ag 1000 μl +ACF) Concentración final del inmunógeno en la emulsión ? 2. Prepare 1 ml de emulsión con adyuvante completo de Freud y solución salina para inocular los ratones del grupo B El procedimiento para preparar la emulsión es el siguiente: coloque 0.5ml de la solución de antígeno en una jeringa y en otra jeringa 0.5 ml adyuvante Completo y/o incompleto de Freud (ACF). Remueva las agujas. Elimine las burbujas de aire en ambas jeringas y conecte ambas jeringas mediante una aguja con doble conector. Justo antes de la inmunización, emulsifique la preparación de antígeno con el ACF (1 ml) haciendo pasar repetidas veces de un lado a otro de las jeringas la mezcla, ver Figura 1. Cuando la mezcla se torne homogénea y blanca, desconecte la aguja conector, colóquele una aguja de 21-G y pruebe si la emulsión es estable. Para ello vierta una gota de la emulsión en 50 ml de
  5. 5. 5 agua fría en un vaso de precipitación. Una buena emulsión de agua y aceite debe mantenerse como una gota aislada sobre la superficie del agua sin dispersarse. Si la gota se dispersa, continúe emulsificando la mezcla. Durante este proceso se puede generar calor. Enfríe las jeringas en una cama de hielo y mantenga la temperatura cercana a 4° C. Figura 1: Jeringas conectorasInoculación del antígeno por vía intraperitoneal 1. Inocule los ratones del grupo A, en el área abdominal, dentro de cavidad peritoneal con 200 μl de emulsión del antígeno y el ACF. El ratón recibirá un total de 100 μg del antígeno. 2. Inocule cada ratón del grupo B, por vía intraperitoneal, con 200 μl de emulsión preparada con adyuvante completo de Freud y solución salina estéril 3. Inocule cada ratón del grupo C, por vía intraperitoneal, con 200 μl de solución salina estéril.Día 15 (21-10-2010) Segunda inmunización (Primer refuerzo)Objetivos: • Inocule cada ratón del grupo A, por vía intradérmica, un volumen total de 100 μl de emulsión que contiene 50 μg de la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración inicial 1 mg/ml) en presencia de adyuvante incompleto de Freud (AIF), en una proporción 1:1 v/v. • Inocule cada ratón del grupo B, por vía intradérmica, un volumen de 200 μl de emulsión que contiene adyuvante incompleto de Freud (ACF) en solución salina. • Inocule cada ratón del grupo C, por vía intradérmica, un volumen de 200 μl de solución salina.Muestra de sangre Extraiga una muestra de sangre del seno orbital de los ratones antes de la segunda inmunización. Separe el suero, colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene el suero a -20°C.Prepare el antígeno junto con el adyuvante • Prepare 0.5 ml de emulsión de inmunógeno y adyuvante incompleto de Freud para inocular los 5 ratones del grupo A, de tal manera que 100 μl de emulsión contenga 50 μg del antígeno. Este volumen es suficiente para inocular 5 ratones por vía intradérmica El antígeno recombinante de T. cruzi se encuentra en una concentración de 1 μg/μl. Dependiendo de la concentración de antígeno, determine la dilución de éste, a fin de tener la dosis de antígeno deseada en el volumen que se inoculará cada animal.
  6. 6. 6 Concentración inicial de la preparación de inmunógeno 1 μg/μl Dosis del antígeno a inocular a cada ratón 50 μg / 100 μl Volumen final de la emulsión a preparar para inocular 5 ratones (Ag +AIF) 500 μl Concentración final del inmunógeno en la emulsión ? • Prepare 0,5 ml de emulsión de adyuvante incompleto de Freud y solución salina para inocular los 5 ratones del grupo BInoculación del antígeno por vía intradérmica 1. Inocule cada ratón del grupo A, en a región dorsal, por vía intradérmica, en aproximadamente 10 sitios (0.01 ml por sitio), con 100 μl de emulsión que contiene 50 μg del antígeno y AIF. 2. Inocule cada ratón del grupo B, por vía intradérmica, con 100 μl de emulsión preparada con adyuvante incompleto de Freud y solución salina estéril 3. Inocule cada ratón del grupo C, por vía intradérmica, con 100 μl de solución salina estérilDía 22 (04-11-2010): Tercera inmunización (Segundo refuerzo)Objetivos: 1. Inocule cada ratón del grupo A, por vía subcutánea, un volumen total de 100 μl de disolución que contiene 50 μg de la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración inicial 1 mg/ml) 2. Inocule cada ratón del grupo B y C, por vía subcutánea, un volumen de 100 μl de solución salina.Extraiga una muestra de sangre de los ratones y prepare el sueroExtraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la tercera inmunización. Separe el suero,colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene el suero a -20°C.Prepare el antígeno • Prepare un volumen de 500 μl de antígeno purificado en solución salina estéril para inocular 5 ratones por vía subcutánea. A cada ratón se le administrará un volumen de 100 μl que contiene 50 μg la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración inicial 1 mg/ml). Concentración inicial de la preparación de inmunógeno 1 μg/μl Dosis del antígeno a inocular a cada ratón 50 μg / 100 μl Volumen final de disolución del antígeno a preparar para 5 ratones 500 μl Concentración final del inmunógeno en la disolución ?Inoculación del antígeno por vía subcutánea 1. Inocule los ratones del grupo A, por vía subcutánea, en cinco sitios diferentes, .con un volumen de 100 μl de solución salina que contiene 50 μg del antígeno. 2. Inocule los ratones del grupo B, y C por vía subcutánea, en cinco sitios diferentes, .con un volumen de 100 μl de solución salina estéril.
  7. 7. 7Día 37 (18-11-2010) Cuarta inmunización (Tercer refuerzo)Objetivo: 1. Inocule cada ratón del grupo A, por vía subcutánea, un volumen total de 100 μl de disolución salina que contiene 50 μg de la proteína recombinante (Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración inicial 1 mg/ml) 2. Inocule cada ratón de los grupos B y C, por vía subcutánea, un volumen de 100 μl de solución salina.Extraiga una muestra de sangre de los ratones y prepare el suero Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la tercera inmunización. Separe el suero, colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene el suero a -20°C.Prepare el antígeno Prepare el antígeno de la misma manera que se preparó en la tercera inmunizaciónInoculación del antígeno por vía subcutánea - Ver anexo Inocule los tres grupos de ratones, por vía subcutánea y con la misma dosis que lo hizo en la tercera inmunizaciónDía 52 (02-12-2010) Obtención de antisuero policlonalDesangrado de los ratonesSangrado total de los ratones por punción cardiaca a cielo abierto para obtener sueros inmunes ydeterminar los niveles de anticuerpos específicos producidos después de la cuarta inmunización.ANEXOSPreparación de antisueros1. Después de extraer muestras de sangre deje la sangre a temperatura ambiente 1/2 a 1 hora hasta la formación del coágulo. Separe cuidadosamente el coágulo de la pared del tubo con un aplicador de madera. Si se requiere mejor retracción del coágulo, mantenga la sangre refrigerada a 4ªC durante 2 a 4 horas.2. Decante el suero en un tubo y centrifugue a 1000g durante 15 minutos a 4ªC (2500 r.p.m.).3. Cuidadosamente separe el suero por decantación o con pipeta Pasteur. El suero obtenido debe estar libre de células.4. Alicuote el suero en viales de 0.2 ml y almacene a -20ªC.Seguimiento de la inmunización y aplicación de refuerzos1. Dos semanas después de la primera inmunización tome una muestra de sangre. Separe el suero y almacénelo a –20° C. Determine el título de anticuerpos específicos contra el antígeno inoculado presentes en el antisuero. Esta muestra tiene la finalidad de permitir determinar el desarrollo de la respuesta de anticuerpos en el antisuero de los ratones durante el curso de la inmunización.2. Administre el primer refuerzo a los 15 días después de la primera inmunización. Tome muestra de sangre del ratón, previo a la inmunización y separe el suero.
  8. 8. 83. Administre el segundo refuerzo con 15 días de intervalo. Tome muestra de sangre del ratón previo a la inmunización y separe el suero.4. Dos semanas después de la cuarta inmunización, desangre el ratón mediante punción cardiaca, separe el suero y prepare alícuotas de 0.2 ml en viales de congelación y almacene a –20° C.Caracterización y evaluación de los antisueros obtenidosUna vez obtenido el antisuero de los ratones inmunizados es necesario detectar la presencia deanticuerpos, cantidad, pureza, tíctuo y especificidad utilizando una técnica de inmunoensayoconfiable.El título de un antisuero se puede estimar utilizando alguna de las técnicas de inmunoensayo taescomo ELISAy su especificidad a través de pruebas de reacciones cruzadas o por cromatografía deafinidad utilizando el antígeno purificado.Para algunas técnicas de inmunoensayos es suficiente utilizar los antisueros crudos, mientras que enotras técnicas, es conveniente purificar alguno de los isotipos de anticuerpos con una especificidadparticular.En los siguientes trabajos prácticos ustedes caracterizarán los antisueros obtenidos durante elproceso de inmunización de este curso, utilizando la técnica de E.L.I.S.A. y la determinarán de lacantidad de proteínas mediante el método de Lowry.Materiales equipos y reactivos para las inmunizaciones de los ratones– Ratones de 6 semanas de edad – Aguja de jeringa con conectador doble– Antígeno purificado (proteína de 1 a 2 mg/ml – Algodón en PBS) – Gasa– Adyuvante completo e incompleto de Freud – Marcador– Solución salina al 0,9% estéril – Viales– Alcohol al 70% – Guantes– Jeringas de vidrio de 1 c.c. – Lentes– Agujas 20, 21 y 25. – Acido pícricoMateriales, equipo y reactivos necesarios para el desangrado de los ratones – Ratones inmunizados – Aplicadores de madera – Algodón – Tubos de ensayo – Tubos de ensayo – Tubos de centrifuga – Alcohol al 70% – Pipetas Pasteur – Tubo de centrífuga estéril, 44 x 142 mm – Centrifuga refrigerada – Jeringa estéril de 3 ml con aguja de 21”. – Viales – Aguja estéril – Tubo de hematocrito – Algodón y gasa.BibliografíaCurrent Protocols in Immunology 1992. Editado por John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies,Ethan Shevach y Warren Strober. Publicado por Greene Publishing Associates and Wiley Interscience.Volumen 1. Capitulo 1.6.Antibody production. Essential Techniques (1997). PJ Delves. Editorial John Wiley and Sons.Técnicas de inoculación y sangrías de animales: http://www.scribd.com/doc/3288391/TECNICAS-DE-INOCULACION-Y-SANGRIA-DE-ANIMALESTécnicas de obtención e inoculación de muestras. Consejo Superior de investigaciones científicas.Comité ético de experimentación animal del Centro Nacional de Biotecnología. España.http://www.cnb.csic.es/~animalario/CEEA.html
  9. 9. 9Protocolo de inmunización Semestre B-2010Producción de anticuerpos de ratón policlonales anti-Pgr24 mediante la inoculación de la proteínarecombinante Pgr24de T. cruzi (Ag). Concentración del Ag: 1 mg/ml, por tres vías parenteralesdiferentes (intraperitoneal, intradérmica y subcutánea).GRUPOS EXPERIMENTALESGrupo A: 5 ratones inoculados con emulsión de la proteína recombinante Pgr24 de T. cruzi yadyuvante de Freud (esquema de inmunización).Grupo B: 5 ratones inoculados con emulsión de Adyuvante de Freud y solución salina.Grupo C: 5 ratones inoculados con solución salina. PRIMERA INMUNIZACIÓN SEGUNDA INMUNIZACIÓN 07-10-2010 21-10-2010grupos muestra Grupo A muestra de Grupo A de sangre sangre Dosis del antígeno Vía (Sueros1° Dosis del antígeno Vía (Suero normal) 100 μg Inm.) 50 μg Prepare 1000 μl emulsión Prepare 0.5 ml emulsión para para inocular los ratones A: inocular los ratones A: A A-SN ____ μl l Ag (mg/ml) A-S1 ____ μl l Ag mg/ml) 500 μl Adyuvante completo 250 μl Adyuvante Incompleto B B-SN de Freud (ACF). i.p. B-S1 de Freud (AIF). i.d Inocule cavidad abdominal de C C-SN C-S1 Inocule la dermis de cada ratón con cada ratón con 200 μl de 100 μl de emulsión que contiene 50 emulsión que contiene 100μg del antígeno μg del antígenogrupos TERCERA y CUARTA INMUNIZACIÓN DESANGRADO TOTAL 04-11-2010 / 18-11-2010 02-12-2010 muestra de Obtención de antisueros de ratones sangre Grupo A Vía (Sueros Dosis del antígeno Vía inmunizados por punción cardíaca 2° y 50 μg después de 4° Inmunización 3ºInm.) A-S2 Prepare 0.5 ml de disolución B-S2 para inocular los ratones A: A-S4 A ____ μl l Ag (mg/ml) C-S2 250 μl solución salina estéril B-S4 B s.c. p.c. A-S3 Inocule por vía subcutánea, con C-S4 C 100 μl de disolución que contiene B-S3 50 μg del antígeno. C-S3Inoculación intraperitoneal (i.p.); intradérmica (i.d.); subcutánea (s.c.); punción cardíaca (p.c.)Extraiga una muestra de sangre de los ratones (0.05 -0.2ml.) del seno orbital.Realice el sangrado total (1ml) del ratón por punción cardiaca.GA/mc Septiembre 2010

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