SlideShare una empresa de Scribd logo
1 de 42
Descargar para leer sin conexión
3B-2

                                     GUÍA DE PRÁCTICAS

      UnIDAD ACADémICA: ESCUELA ACADEmICO PROFESIOnAL DE
                         OBSTETRICIA

          nOmBRE DE LA ASIGnATURA BIOQUÍmICA Y nUTRICIÓn

                nOmBRES Y APELLIDOS : JOSELInE RICCI CUELLAR

                  AUTOR : Q.F. JAVIER F. mARTInEZ CARRERAS

INTRODUCCIÓN

      La Bioquímica, que crece a un ritmo extraordinariamente vigoroso, ejerce una influencia cada
vez mayor en las Ciencias de la vida. Actualmente se considera que la Bioquímica es el arma más
poderosa con que se cuenta para interpretar el fenómeno biológico, con una profunda incidencia en
numerosas áreas incluyendo la medicina y la nutrición humana.

      La presente guía de práctica comprende la aplicación experimental de los conceptos
fundamentales, tanto básicos como de desarrollo de la capacidad crítica del estudiante más que en el
almacenamiento memorístico de datos que tampoco puede, sin embargo, descuidarse.

       Cada Práctica de laboratorio incluye: Marco Teórico, Competencias, Materiales y Equipos,
Procedimiento, Cuestionario y Fuentes de información que se deben desarrollar cuidadosamente
durante la práctica. La guía de laboratorio debe ser revisada antes de iniciar la práctica.

INSTRUCCIONES GENERALES
El estudiante deberá estar en las prácticas en el horario programado, a la hora exacta y con mandil
    blanco.

Todos los alumnos participarán activamente en el desarrollo de las prácticas.

Es necesario que el alumno antes de cualquier experimento posea los conocimientos básicos:
   - Los objetivos de cada práctica.
   - El material y equipo de laboratorio necesario para la realización de dicha practica.
   - Los reactivos verificando su nombre, concentración, evitando contaminar los mismos.
   - El método seleccionado que permitirá obtener resultados objetables

      -   Desarrollar su capacidad de observación y actitud crítica

El modelo para el informe de cada práctica debe seguir el siguiente esquema:

1.−       Título de la práctica
2.−       Nombre del(los) integrante(s), fecha de entrega
3.−       Materiales y Procedimientos
4.-       Cálculos y Resultados
5.−       Conclusiones (de acuerdo a los objetivos y resultados de la práctica)
6.−       Desarrollo del cuestionario




F-CV3-3B-2
                                                                                        Rev. Junio 2007
                                                     1
7.−      Bibliografía

                                               Práctica N° 1

                    “Reconocimiento de materiales y equipos de laboratorio bioquímica”
       1.1    Marco teórico
         Para realizar con éxito las practicas programadas para el curso, se requiere de diferentes
         materiales de laboratorio como son pipetas, fiola, probeta y otros. Así mismo el uso de
         equipos e instrumentos como potenciómetro, balanza, espectrofotómetro y otros. Estos
         materiales y equipo tienen condiciones básicas para su uso como el estar calibrados, limpios
         y que sea el material correcto según nuestras necesidades.
       1.2    Competencias
         •    Demuestra y explica el uso correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un
              laboratorio.
         •    Aprende el manejo correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un laboratorio.

       1.3    Materiales y equipos
         Materiales y equipos a usar en la práctica:
     Tubos              Beacker 100mL           Refrigerante           Alcohol 70°          Centrífuga
  13x100mm
     Tubos              Beacker 500mL             Bagueta            Anaranjado de         Baño maría
   10x75mm                                                               metilo
     Tubos               Matraz 50mL          Pipeta pasteur        Azul de metileno      Potenciómetr
  17x150mm                                                                                     o
    Tubo de              Matraz 500mL         Pipeta 1mL 1/10        Agua destilada         Balanza
  centrífuga
    Probeta               Micropipeta        Pipeta 1mL 1/100       Mecheros de ron        Incubadora
     100mL                  10-100uL
    Probeta               Micropipeta         Pipeta 2mL 1/10      Pinza para buretas     Espectrofotó
    1000mL                100-1000uL                                                          metro
 Bureta 25mL             Tips amarillos       Pipeta 5mL 1/10            Mortero           Mechero de
                                                                                               gas
      Gradillas           Tips azules        Pipeta 10mL 1/10           Propipeta          Pinzas para
                                                                                              tubos
 Luna de Reloj          Matraz Kitazato      Pipeta 25mL 1/10          Adaptador             Tripode
                            500mL                                       venoject
      Goteros            Fiola 100mL           Pipeta 5mL no            Ligadura             Embudo
                                                  terminal
      Rejilla de         Fiola 1000mL        Pipeta 5mL volum        Aguja venoject          Soporte
      asbesto                                                           21Gx1”              universal
             1.4   Procedimiento
         PIPETAS:
         Son materiales graduados que se emplean para medir o trasvasar volúmenes de líquidos.
         Primero deberá identificar si es una pipeta terminal (graduación llega a la punta) o no terminal
         (graduación finaliza antes de la punta). Luego identificar el volumen que puede medir con la
         pipeta (capacidad de la pipeta).
         Modo de uso: Introduzca la pipeta en el líquido sin tocar el fondo del recipiente, aspirar
         con la ayuda de una propipeta succionando suavemente hasta el volumen que requiere, tapar
         la pipeta CON EL DEDO INDICE, si se sobrepaso el volumen relaje lentamente su dedo y deje
         salir el líquido hasta que logre enrazar el líquido (nivel deseado).
         El profesor le enseñará el correcto uso de las pipetas.

         MICROPIPETAS:




F-CV3-3B-2
                                                                                           Rev. Junio 2007
                                                       2
Son pipetas muy especiales que se emplean para medir volúmenes muy pequeños en el rango
      de los microlitros (uL), pueden medir un volumen fijo o medir diferentes volúmenes
      (regulables) se emplean con un aditamento en la punta llamado TIP o puntera, que es
      específico según la capacidad de la micropipeta.
      Modo de uso: Coloque el tip correspondiente, ajústelo, regule el volumen a medir girando el
      mando del émbolo, coloque el pulgar atravesado sobre el mando de la micropipeta, presione
      suavemente e introduzca el tip al líquido a medir, suelte suavemente el émbolo y observe que
      el líquido llene el tip, para depositar el contenido presione el émbolo completamente y el
      líquido será expulsado del tip. Para eliminar el tip usado presione el mando expulsor.
      RECUERDE QUE CUANDO SE EMPLEA CUALQUIER MUESTRA BIOLOGICA EL TIP DEBE SER
      ELIMINADO DENTRO DE UN DESINFECTANTE COMO LA LEJIA O SIMILAR.
      El profesor le enseñará el correcto uso de las micropipetas y demás materiales y equipos de
      laboratorio.
    1.5   Cuestionario
      1. Los materiales de vidrio son elaborados en vidrio de Borosilicato, describa las
         características de este material.




      2. Describa los equipos que debe emplear para preparar soluciones.




      3. El lavado es una parte importante del trabajo en el laboratorio, describa la forma correcta
         para el lavado de materiales de vidrio.




      4. Describa cada uno de los materiales mostrados durante la práctica y explique su uso.




    1.6 Fuentes de información
    1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
    nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
    2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
    Reverté. Barcelona
    3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
    (España)
    4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
    Interamericana. Madrid
    5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
    lima
    6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
    2006. Barcelona (España)
    7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
    Monografía.2003. Perú.
    8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
    9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.



F-CV3-3B-2
                                                                                        Rev. Junio 2007
                                                 3
10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
    11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
    Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
    12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
    13. MURRAY y Col       Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
    Ed. Manual Moderno. México
    14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España

                                           Práctica N° 2

                             “Determinación del pH, Amortiguadores”

    2.1   Marco teórico
      El concepto de pH fue dado a conocer por primera vez en 1909 por SORENSEN, y lo definió
      como el logaritmo negativo de la concentración de iones de hidrógeno es decir:
               pH = - log (H) ó = [H + ] = 10 – pH     ó = - log ( 1 )
                                                                   H
      Donde la concentración del hidrogenión es dada en unidades moles.
      La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y más
      utilizados en bioquímica puesto que esta medida determina características notables de la
      estructura y la actividad de las macromoléculas biológicas, por consiguiente, la conducta de
      las células y de los organismos.
      CALCULO DEL PH DE UNA SOLUCION:
      Procedimiento .-
      Consiste en calcular la concentración de iones hidrógeno [H+]
      Calcular el logaritmo de base 10 de [H+]
      El pH es el logaritmo negativo que ha sido encontrado en (1)
      Ejemplo:
      El agua pura (25ºC), de concentración 1 x 10 –7 M tiene como pH:                        PH =
      - log ( 1 x 10 – 7 )     PH = - ( - 7 ) PH = 7
      El agua es un conductor eléctrico cuando se encuentra pura, debido a su propiedad
      disociativa, pero en pequeño grado.
                         H2O + H2O                         H3O+ +       HO–             (1)

      A 25ºC existe 1 molécula de H3O + y una molécula de HO– por cada 5.55x108 moléculas de agua
      El número de agua por litro sería:
                     1000 g/L         =        55.5 moles/L       (2)
                                               8 g/mol
      55.5 x 108 moles de agua hacen 107g /L, existiendo solo un gramo de H3O+; es decir, 10–7 g/L, y
      un gramo de OH– ó 10 – 7 g/L.
      De la fórmula (1) se deduce que la constante de ionización del agua (Kw) es:
      Kw      =      [H3O+] [HO-] =            [H3O+] [ OH - ]
                           2                 2
                     [H2O]            (55.5)
      De lo que:
              [H3O+] [OH-] =          K(55.5)2         =       Kw
      Por lo que:
              Kw     =       10 – 7 x 10– 7 = 10 – 14

      Por lo tanto:
              Log Kw        = log [H3O+]   +         log [OH-]
              -Log KW       = -log [ H3O+] +         - log [OH-]
              - p Kw        = p[H3O+]      +         p[HO-]
              -p Kw         = pH + pOH

      Soluciones Buffer, tampón o amortiguadores :
      Son aquellas soluciones que se caracterizan por ser mezclas de ACIDOS y BASES DEBILES y
      sus sales, las cuales impiden las variaciones bruscas de pH; permitiendo que el cambio de
      este no sea el más mínimo.




F-CV3-3B-2
                                                                                       Rev. Junio 2007
                                                 4
APLICACIONES :
      En organismos vivientes, por ejemplo:
      Para conocer las alteraciones producidas en la composición química de la sangre.
      Para conocer las alteraciones del pH de otros líquidos biológicos: saliva, lagrimas, sudor,
      líquido cefalorraquídeo, etc.
      En ciertos fenómenos fisiológicos: respiración, aplicación de enzimas (catalizadores), etc.
      En química:
      Para determinar el pH de una solución.
      Para determinar el punto final de una titulación
      Demostración : reacciones químicas con liberación o consumo de iones H +.
      Otros
    2.2   Competencias
      •      Aplica los conceptos fundamentales sobre el pH y la acción de los sistemas buffer.
      •      Utiliza las técnicas para medir el pH.
    2.3   Materiales y equipos
      Materiales y equipos a usar en la práctica:
  Potenciómetro  Anaranjado de                      Bureta 25mL        Estandar de pH      Pipeta 1mL
                 metilo                                                10
  Beacker 100mL Papel de tornasol                   Soporte            Ac. Acético         Pipeta 2mL
                 azul                               universal          0,1N
  Matraz 100mL   Papel de tornasol                  Pinza para         Acetato sodio       Pipeta 5mL
                 rosado                             bureta             0,1N
  Estandar de pH Indicador de pH 1-14               Tubos              Agua destilada      Pipeta 10mL
  4                                                 13x100mL
  Estandar de pH Gradillas                          Vaso               Fenolftaleina       HCl 0,1N
  7                                                 descartable

      METODOS DE DETERMINACION DEL pH:
      Existen varios procedimientos:
      Mediante indicadores
      Mediante cintas o papel de pH universal
      Mediante el potenciómetro o pHmetro
      DETERMINACION DEL pH MEDIANTE EL USO DE INDICADORES:
      Indicadores.-Son soluciones o cuerpos químicos que se agregan a los líquidos para dosar, con
      el fin de ver el momento preciso del término de la reacción; manifestándose por la aparición,
      desaparición o modificación del color. Estas sustancias químicas pertenecen al grupo de los
      ácidos y bases débiles. Según Glaser, se clasifican en tres grupos:
      1ero: Para valorar bases débiles con ácidos fuertes. Ejem: anaranjado de metilo, rojo de
      congo, etc.
      2do: Para valorar bases y ácidos fuertes. Ejem : Tornasol, paranitrofenol, etc.
      3ero: Para valorar ácidos débiles con bases fuertes. Ejem: fenolftaleina, etc.
      Aplicación :
      1) En determinar el pH de una solución deseada.
      2) En determinar el punto final de una titulación (volumétrica)
      3)      En determinar reacciones químicas con liberación o consumo de H
      Comprende:
                  Elección de un indicador para una titulación, para lo que se debe tener en cuenta
      conceptos básicos sobre disociación de sales, la que está sujeta a una constante (pK) y a una
      variación de colores dependiente a su mayor o menor disociación de pK; el pK se emplea y se
      define como el log (1/Ka) ó el –log Ka para definir la fuerza de un ácido o de una base.
      Un ácido cuya constante de ionización sea 10 –4 tiene un pKa de 4. De igual forma pKb es – log
      Kb, para cualquier constante de equilibrio Kb. (Ka constante de ionización de un ácido; Kb,
      constante de ionización de una base).
      Continuando :
      a) Disociación de una sal formada a partir de un ácido fuerte y una base débil:




F-CV3-3B-2
                                                                                         Rev. Junio 2007
                                                    5
NH4Cl                   NH4+     +          Cl-

                             H2O                     OH -   +               H+
               NH 4Cl +     H2O                     NH 4 OH             +             HCl


      La mayor tendencia de ionización del HCl frente a la del NH4OH lo hace una solución ACIDA.
      b) Disociación de una sal formada a partir de un ácido débil y una base fuerte.
      Ejemplo : Citaremos la titulación del CH3 – COOH con NaOH

                    CH 3 – COONa                       CH 3–COO -                 +           Na +
                          H2O                            OH -  +                      H   +

                      CH3–COOH            +         NaOH

      CH3COOH presenta menor tendencia a ionizarse que el NaOH siendo ésta una solución
      ALCALINA.
      c) Disociación de una sal formada a partir de un ácido y una base fuertes. Citaremos la
         titulación del HCl con NaOH.

             NaCl                                                           Na+                      +    Cl –

             H2O                                                            OH -                     +     H+
                                                                                                                 NaOH
+    HCl

      La solución es NEUTRA ya que NaOH como el HCl tienen igual tendencia a ionizarse
      Determinación del pH mediante el uso del papel indicador :
      El papel Indicador:
      Es un papel especial que contiene absorbidos indicadores en serie o a lo largo, que al ponerse
      en contacto con la solución a evaluar da un color que corresponde al pH aproximado de la
      solución problema. En el comercio existen diferentes tipos de papeles indicadores, por
      ejemplo: el papel indicador universal (pH de 1 a 10); PH – YDRIEN papel (pH del 10 a 14)
      Podemos observar la siguiente tabla de indicadores:

      TABLA DE INDICADORES :

                INDICADOR                Pk                LIMITES                             COLOR
       Azul de timol                    1.50                0.5 – 2.8                 rojo – amarillo
       Azul de bromofenol               3.98                3.0 – 5.0                 amarillo – azul
       Verde de bromofenol              4.68                3.7 – 5.7                 amarillo - azul
       Anaranjado de metilo             4.00                3.5 – 4.5                 anaranjado–amarillo
       Rojo de clorofenol               5.98                5.0 – 7.0                 amarillo - rojo
       Púrpura de bromocresol           6.30                5.3 – 7.3                 amarillo - púrpura
       Azul de bromotimol               7.00                6.0 – 8.0                 amarillo - azul
       Rojo de fenol                    7.90                6.9 – 8.9                 amarillo - rojo
       Fenolftaleína                    9.20               8.2 – 10.2                 incoloro - rojo
       Rojo de metilo                   5.10               4.4 - 6.0                  rojo - amarillo




F-CV3-3B-2
                                                                                                         Rev. Junio 2007
                                                6
DETERMINACIÓN DE pH MEDIANTE EL POTENCIÓMETRO O pHMETRO:
      Fundamento.-
      Se fundamenta en la generación de una diferencia de potencial que se establece cuando se
      emplean dos soluciones ioniozadas de diferente concentración en las cuales se hace pasar
      una corriente eléctrica, es decir la diferencia de potencial es proporcional a la diferencia de
      concentración(es) entre las soluciones.

      Partes que lo constituyen.-
      1.-Electrodo de vidrio: Es un pequeño bulbo de vidrio soldado a un vástago de vidrio de
      borosilicato (pirex) dentro de él existe una solución de KCl 0.1N en la que está sumergido un
      electrodo de referencia interna que puede ser de plata cloruro de plata o de Calomell,
      quedando aislada dicha celda mediante un cierre hermético constituido por un dieléctrico de
      cera o plástico y un casco de metal o plástico.
      2.-Un electrodo de referencia externa de Calomell
      3.-Un tablero de control con diales que regulan el funcionamiento del equipo.

      PARTE OPERATIVA:
      La calibración consiste en darle información al equipo mediante el uso de estándares de pH, o
      sea soluciones cuyo pH es conocido y certificado.
      Pasos previos: Verificar la instalación correcta del equipo, su conexión con la corriente
      general. Calibrar la temperatura ambiente con la del equipo, lavando repetidas veces con agua
      destilada y secando los electrodos con papel filtro.
      Retirar cuidadosamente el jebe de seguridad del electrodo de vidrio.

      La aplicación se realiza luego, enjuagando los electrodos con agua destilada, secándolos con
      papel absorbente y sumergiéndolos en la solución problema, obteniéndose su pH que se leerá
      en el lector en una escala de 0 a 14.
      Actualmente se usan pHmetros portátiles, que funcionan con baterías o con una corriente
      alterna de 100 a 200 voltios, digitales, otros.
    2.4   Procedimiento
      1. Determinación del pH:
      El alumno deberá medir el pH de las diferentes muestras solicitadas por el profesor (leche,
      gaseosas, yogurt, saliva, orina, otras) empleando los métodos descritos en la práctica.
      2. Titulación Acido-Base:
      2.1.-Titular una base (NaOH 0.1N) con un ácido:
      Colocar en un Beacker 10 mL de NaOH (hidróxido de sodio) 0.1N y tres gotas de fenolftaleína
      Enrazar una bureta de 25mL con H2SO4 (ácido sulfúrico) 0.1N
      Comience a titular dejando caer gota a gota el H2SO4 0,1N sobre NaOH 0,1N, agitando
      constantemente hasta que cambie el color.
      Anotar la cantidad (mL) de H2SO4 0,1N que se gastó en la titulación (gasto)




      2.2.-Titular un ácido (H2SO4 0,1 N) con una base:
      Colocar en un Beacker 10mL de H2SO4 0,1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
      Enrazar una bureta de 25mL con NaOH 0,1N.
      Comience a titular dejando caer gota a gota el NaOH 0,1N sobre el H2SO4 0,1N, agitando
      constantemente hasta que cambie el color.
      Anotar la cantidad (mL) de NaOH 0,1N que se gastó en la titulación (gasto)




F-CV3-3B-2
                                                                                       Rev. Junio 2007
                                                 7
3. Cambios de pH en un sistema Buffer:

      3.1. El agua como buffer
      Colocar en un beaker, 10 mL de agua destilada y tres gotas de anaranjado de metilo.
      Enrasar una bureta de 25mL con HCl 0,1N.
      Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0,1N, agitando constantemente hasta que
      cambie el color.
      Anotar la cantidad (mL) de HCl 0,1N que se el gastó en la titulación.




      3.2. Un ácido débil y su respectiva sal en diferentes proporciones:
      Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,5 mL de ácido acético 0.1N, 0,5mL de acetato
      de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
      Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N.
      Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta que
      cambie el color.
      Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación.




      3.3. Un ácido débil y su respectiva sal en iguales proporciones:
      Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,0mL de ácido acético 0.1N, 1,0mL de acetato
      de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo.
      Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N.
      Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta que
      cambie el color.
      Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación.




    2.5   Cuestionario
      1.-Mencione el pH normal de: Sangre, orina, líquido seminal, líquido cefalorraquídeo, líquido
      amniótico, saliva y su correlación con alguna patología.




      2.-Principales sistemas buffer orgánicos.




    2.6 Fuentes de información
    1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
    nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
    2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
    Reverté. Barcelona




F-CV3-3B-2
                                                                                        Rev. Junio 2007
                                                  8
3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
     (España)
     4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
     Interamericana. Madrid
     5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
     lima
     6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
     2006. Barcelona (España)
     7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
     Monografía.2003. Perú.
     8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
     9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
     10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
     11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
     Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
     12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
     13. MURRAY y Col       Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
     Ed. Manual Moderno. México
     14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España

nOTA: EL ALUmnO DEBERÁ ASISTIR A LA PRÁCTICA COn
mUESTRAS DE LEChE, YOGURT, GASEOSA, FRUTAS, JUGO DE
FRUTAS.
                                                 Practica N° 3
                                    “Identificación de los carbohidratos“
                                  “Determinación de glicemia y glucosuria“
     3.1   Marco teórico
       Los carbohidratos son los principales constituyentes de nuestra dieta, llegando a presentarse
en un 50-60% de la misma. Así mismo, son la principal fuente de energía del humano, siendo los
almidones los más abundantes.
       Entre los monosacáridos de mayor importancia se tiene a la glucosa, la manosa, la galactosa
       (aldohexosas), la ribosa (aldopentosa) y la fructuosa (cetohexosa), entre los disacáridos
       tenemos a la maltosa (Glu-Glu), la sacarosa (Fru-Glu) y la lactosa (Gal-Glu), y entre los
       polisacáridos el almidón vegetal, al almidón animal (glucógeno) y la celulosa..
       Los azúcares, hidratos de carbono o carbohidratos son los compuestos más abundantes en la
       naturaleza y en nuestra dieta, en su mayoría del tipo aldohexosas y cetohexosas. Los
       carbohidratos se ingieren en la dieta como almidones (polisacárido), sacarosa y lactosa
       (disacáridos) y en menor proporción en como glucosa, galactosa y fructosa (monosacáridos).
       El producto principal de la digestión de los polisacáridos es la glucosa (monosacárido) la cual
       es absorbida ya sangre donde se mantiene en ayunas entre 70 a 110 mg/dL, lo que se conoce
       como los niveles de Glicemia. Para su dosaje existen diferentes métodos como el de la
       glucosa oxidasa, el método de la orto-tolouidina (en desuso por ser cancerígeno) y el de
       Somogy – Nelson.
       Las necesidades de glucosa son cubiertas inicialmente por el glucógeno o almidón animal
       que es la reserva de glucosa de la que se echa mano a través de la glucogenólisis. Esta vía es
       regulada por dos hormonas: el glucagon para el glucógeno hepático y la adrenalina para el
       hepático y muscular.
       Cuando el requerimiento de glucosa es grande y los depósitos están vacíos, se puede formar
       glucosa a partir de intermediarios anfibólicos (como el lactato, los aminoácidos, el glicerol, los
       ácidos grasos y los cuerpos cetónicos), mediante la gluconeogenesis, que se lleva a cabo en
       las células hepáticas, adiposas y musculares.
       De esta manera se mantienen los niveles sanguíneos de glucosa que son necesarios para las
       células, especialmente para las células cerebrales, que no tienen posibilidad de reserva y
       están a merced de la glucosa circulante.
       En el aspecto hormonal, la glucosa sanguínea está regulada principalmente por dos hormonas
       secretadas por el páncreas endocrino:




F-CV3-3B-2
                                                                                          Rev. Junio 2007
                                                   9
La Insulina:
      Es una hormona formada por 51 aminoácidos dispuestos en dos cadenas. La insulina se
      forma a partir de la proinsulina, que está constituida por una sola cadena polipetídica que se
      sintetiza en las células β de los islotes pancreáticos de Langerhans. La insulina es el factor
      más importante de los que intervienen en la regulación de los niveles de glucosa
      sanguínea, que deben mantenerse dentro de unos límites rigurosos. Cuando la glucosa está
      elevada en la sangre el nivel de insulina se incrementa del mismo modo.
      El Glucagon:
      Es una hormona formada por una cadena polipeptídica compuesta por 29 aminoácidos; es
      sintetizada por las células α de los islotes pancreáticos de Langerhans y se incrementa en la
      sangre al disminuir la glucosa, estimulando la glucogenólisis hepática.
      Alteraciones del Metabolismo de los Carbohidratos:
      Para los efectos del establecimiento del diagnóstico en el trastorno o alteraciones del
      metabolismo de carbohidratos se han considerado dos situaciones clínicas bien definidas:
      Hiperglucemia:
      Es el estado biológico donde los niveles de glucosa sanguínea están por encima de los
      valores considerados normales: La hiperglucemia fisiológica en situaciones de excitación
      síquica, esfuerzos musculares, por exposición a baños calientes y a veces en el periodo
      menstrual, y la hiperglucemia patológica más común es la Diabetes mellitus que es un
      síndrome caracterizado por un aumento de los niveles de la glucosa en estado postprandial y
      ayuno, que conlleva a características de laboratorio como:
      Aumento de la glucosa en ayunas por encima de 7.8 mmol/L (140 mg/dl).
      Aumento exagerado de la glucosa a cualquier hora del día, por encima de 200mg/dl
      Aparición de glucosa en orina (glucosuria) cuando esta pasa de 180 mg/dL en sangre (umbral
      renal de filtración para la glucosa).
      El aumento de glucosa en orina produce un aumento en la osmolaridad y en la secreción de
      agua en orina, con aumento de la excreción de orina (poliurea).
      El aumento de glucosa sérica produce igualmente un aumento de la osmolaridad sanguínea, y
      un aumento de agua intravascular por dos mecanismos: por una parte, se produce una sed
      intensa que obliga a beber una cantidad (polidipsia) y, por otra parte, existe un trasvase del
      agua interior de la célula al exterior, que lleva a una hemodilución de los elementos formes.
      Aunque existe una gran cantidad de glucosa en la sangre esta no es capaz de ingresar a la
      célula y producir energía debido a la falta de insulina, produciéndose sensación de hambre y
      el enfermo come mucho (polifagia), pero a pesar de ello disminuye su peso corporal, ya que se
      utilizan las reservas, activándose la gluconeogénesis, con una gran formación de cuerpos
      cetónicos,

     que dan lugar a un estado de acidosis metabólica y de halitosis (aliento a manzanas).
      La Diabetes se acompaña de pérdida de proteína muscular y cetosis al aumentar el
      catabolismo de proteínas, el músculo libera mayor cantidad de alanina proporcionando
      substrato para la gluconeogénesis, promoviendo la hiperglucemia debido a la mayor
      disponibilidad de substrato, la gluconeogénesis puede contribuir con más del 30% de la
      producción de la glucosa hepática; la mayor utilización de aminoácidos produce la pérdida de
      proteína.
      Con el tiempo y con hiperglicemias constantes, se producen trastornos vasculares que afectan
      a vasos pequeños, como los de la retina, el riñón y los capilares de la circulación general, con
      lo que el enfermo puede acabar con problemas de ceguera, insuficiencia renal y gangrena en
      zonas periféricas.
      El diagnóstico precoz y un buen control de la enfermedad, encaminado a mantener los niveles
      de glucosa dentro de unos niveles adecuados, son condiciones necesarias para que el
      enfermo con diabetes mellitus pueda tener una buena calidad de vida y no sea esta
      enfermedad la que le produzca la muerte.
      Hipoglucemia:
      Hablamos de hipoglucemia cuando los niveles de glucosa en sangre se sitúan en 2.2 y 2.5
      mmol/l (40-45 mg/dL). La hipoglucemia se puede presentar por un ayuno prolongado, ejercicio
      intenso o a un exceso de insulina, como ocurre en la hiperplasia de las células de los islotes
      pancreáticos (insulinomas), o pueden ser del tipo reactivas producidas por la administración
      exagerada de insulina exógena o por tratamiento con hipoglucemiantes orales en el caso de
      enfermos diabéticos.
    3.2   Competencias




F-CV3-3B-2
                                                                                       Rev. Junio 2007
                                                10
•   Determina cualitativamente la presencia de carbohidratos en muestras de alimentos.
            •   Diferencia entre almidones, monosacáridos y azúcares reductores presentes en los
                alimentos.
            •   Determina la glucosa en sangre por el método enzimático de glucosa oxidasa.
            •   Determina cualitativamente la glucosa en orina por el método de Benedict.
      3.3       Materiales y equipos
            Tubos 17x150mm          Bagueta                          Pipeta 1mL         Rvo. Benedict
            Luna de reloj           Alcohol                          Pipeta 5mL         Rvo. Glicemia enzimático
            Mechero de ron          Mortero                          Goteros            Estd Glucosa 100mg/dL
            Pinza para tubos        Agua destilada                   Rvo. Lugol         Micropipeta 10-100uL
            Tubo 13x100mm           Pipeta 1mL                       Algodón            Rvo. orcinol
            Gradilla                Pipeta 2mL                       Ligadura           Rvo. Selivanoff
            Espectrofotómetro       Pipeta 5mL                       Tips amarillos     Alcohol amilico
            Baño maría              Centrífuga                                          Micropipeta 10-100uL
            Portacubetas            Aguja venoject 21Gx 1”           Glucosa


            Método enzimático de la Glucosa Oxidasa.
            Fundamento:
            Se basa en la oxidación de la glucosa por la enzima glucosa oxidasa, reacción en la que se
            consume oxígeno (O2) y se genera agua oxigenada (H2O2).

            Con esta reacción como principio, la glucosa se puede cuantificar por varios métodos:
            Reacción de la Glucosa Oxidasa:

                    Glucosa         +      O2          GOD                Acido Glucónico        +       H2O2
                    (suero)

                    H2O2     +      Cromógeno          POD                Compuesto coloreado+           H2O
                                                                               (505nm)
            GOD: Glucosa Oxidasa
            POD: Peroxidasa

            Para la determinación de glucosa en orina por el método de BENEDICT
            Fundamento.-
            Este método se basa en que la glucosa tiene la capacidad de reducir los iones cúpricos (Cu +2)
            a iones cuproso (Cu+).Por calentamiento los iones cuprosos forman oxido cuproso (Cu2O),
            este método detecta los azúcares reductores totales en orina.
      3.4       Procedimiento
            1.- Identificación de los carbohidratos
                                           Reacción de Benedict
Reacción de Molisch para                                                                    Reacción de Lugol para
                                           para determinar la
determinar la presencia de                                                                  determinar la presencia de
                                           presencia de Carbohidratos
Monosacáridos
      C                                                                                     Almidones
                                           reductores



  Muestra                                    Muestra                                         Muestra




Agregar 2
                  Agregar por las          Agregar 2              Calentar al mechero       Agregar 2–
gotas de
                                           mL de Rvo.                                       3 gotas de
Rvo.              paredes                                         por 1-2 min. Tenga
                  lentamente 3mL           de Benedict                                      Rvo. Lugol
Molisch                                                           cuidado
                  de H2SO4



  (+) Formación de anillo                    (+) Cambio de color al azul                         (+) Cambio de color al
                                             verdoso, castaño, amarillo,                         azul intenso o negro
  color VIOLETA
                                             marrón o rojo ladrillo
F-CV3-3B-2
                                                                                                         Rev. Junio 2007
                                                             11
Reacción de Bial. Para las Pentosas.
     a. En un tubo de prueba se coloca 5 ml. De Reactivo de orcinol, se
     calienta hasta ebullición y en este momento se adiciona gota a gota 1mL de
     solución problema.
     b. La aparición de un color verde oliva , soluble en alcohol amilico, indica
     presencia de pentosa.

               Reacción de Selivanoff.
    a. En un tubo de prueba se coloca 3 ml de solución clorhídrica de
    resorcinol y 6 ml de Muestra problema.
    b. Luego se coloca en Baño de María hirviente por unos minutos.
    c. El desarrollo inmediato de una coloración anaranjado rojiza indica
    presencia de pentosas.

      2.- Determinación de glicemia
       Tomar una muestra de sangre (aprox. 3 mL), centrifugar a 3,000 rpm por 10 minutos. Separar el
       suero.

       Determinación de glucosa sanguínea:
       Colocar en tres tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema:

              REACTIVO / TUBO                 BLANCO            ESTANDARD           MUESTRA
       Estándar Glucosa(100mg/dL)                --                20 ul               --
       Muestra (suero)                           --                 --                20 ul
       Reactivo de trabajo                      2 ml               2 ml               2 ml

       Mezclar e incubar en baño María a 37º C por 10 minutos.
       Leer a 505nm, llevando a cero el aparato con el blanco de reactivo.

       CALCULO DE LOS RESULTADOS:

              Glucosa (g/L) =        D (Abs M) x f          f = 1,00 g/L
                                                                        Abs. Std

       VALORES DE REFERENCIA: Suero o plasma:      0.70 – 1.10 g/L
                                     Sangre total:         0.60 – 1.00 g/L
                                     LCR:                  0.40 – 0.74 g/L

       3.- Determinación de glucosuria




       Determinación de glucosa en orina por el método de BENEDICT:
       Colocar en un tubo de ensayo 8 gotas de orina patológica y en otro tubo 8 gotas de orina de
       su compañero (no patológica), agregar a ambos tubos 2mL. del reactivo de Benedict, llevar a
       hervir durante 3 minutos, enfriar e interpretar los resultados.
       INTERPRETACION:
        Color                                      Interpretación
        Azul                                       negativo
        Azul verdoso                               vestigios
        Verde                                      positivo +
        Verde parduzco                             positivo ++
        Amarillo                                   positivo +++




F-CV3-3B-2
                                                                                      Rev. Junio 2007
                                                     12
Rojo ladrillo                              positivo ++++

      Normalmente en la orina no hay azucares, su presencia nos indica que hay glucosuria, que
      generalmente está en relación con el incremento de la glucosa en sangre sin embargo, hay
      algunas situaciones fisiológicas en la que esta presencia puede ser positiva pero por la
      presencia de otros glúcidos como la lactosa en la mujer gestante o en la que está dando de
      lactar sin que sea patológica.

    3.5   Cuestionario
      1.- Fundamento de la reacción de Molisch, Benedict y Lugol.




      2.- Cuales son los azúcares característicos de cada una de las muestra empledas.




      3.- Por qué la diferencia de reacción entre el azúcar blanca y rubia.




      4.- Que es un “azúcar invertido” y su utilidad.




      5.- Según la última clasificación de la OMS, cuantos tipos de diabetes existen.




      6.- Como se produce la insulina recombinante.




    3.6 Fuentes de información
    1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y




F-CV3-3B-2
                                                                                        Rev. Junio 2007
                                                  13
nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
    2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
    Reverté. Barcelona
    3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
    (España)
    4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
    Interamericana. Madrid
    5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
    lima
    6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
    2006. Barcelona (España)
    7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
    Monografía.2003. Perú.
    8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
    9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
    10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
    11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
    Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
    12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
    13. MURRAY y Col       Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
    Ed. Manual Moderno. México
    14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España

       NOTA: El alumno deberá asistir a la práctica con muestras de leche, yogurt, queso, gaseosa,
       cerveza, azúcar rubia, azúcar blanca, huevo, galleta, pan, frutas.

                                                 Practica N° 4
         Seminario N° 1: “Aspectos bioquímicos de la Diabetes Mellitus y la Diabetes Gestacional”.
      Temas que se deben considerar en el seminario:
      1.- Generalidades. Conceptos. Etiopatogenia
      2.- Tipos de Diabetes. Factores predisponentes
      3.- Insulina. Síntesis. Función. Deficiencia
      4.- Complicaciones en el embarazo

      Seminario Nº2: “ Mecanismo Hormonales de Regulación Metabólica”
      Temas que se deben considerar en el seminario:
      1.- Generalidades. Conceptos. Características generales de las hormonas.
      2.- Clasificación de las hormonas
      3.- Sistema de la adenilato ciclasa y la proteína quinasa A.
      4.- Sistema de la fosfolipasa, inositol y Ca++.
      5.- Receptores intracelulares

      Seminario N° 3: “Rol bioquímico y fisiológico del surfactante pulmonar en la maduración fetal
      y el de las prostaglandinas en el proceso de parto”.
      Temas que se deben considerar en el seminario:
      1.- Generalidades. Significado fisiológico. Composición química.
      2.- Índices de madurez pulmonar
      3.- Estructura y desarrollo del alveolo pulmonar
      4.- Biosíntesis. Etapa embrionaria. Etapa pseudoglandular. Fase canalicular. Fase de saco
      terminal
      5.- Aceleración de la madurez pulmonar fetal
      Importancia de la utilización de corticoides en la vida fetal
      Rol de los corticoides en el desarrollo prenatal
      6.- Efectos adversos de la corticoterapia antenatal. Riesgos fetales y maternos
      7.- Enfermedades por insuficiencia del surfactante pulmonar:
      Atelectasias. Membrana hialina. Embolia pulmonar. Síndrome distress respiratorio
      8.- PROSTAGLANDINAS. Síntesis. Metabolismo .
      Actividad farmacológica de las prostaglandinas. Accion de la prostaglandina en el proceso de
      parto

      Seminario N° 4: Hormonas en Embarazo y lactancia.




F-CV3-3B-2
                                                                                      Rev. Junio 2007
                                                14
Temas que se deben considerar en el seminario:
      1.- Funciones
      2.- Clasificación
      3.- Metabolismo
      4.- Regulación hormonal

                                                    Practica N° 5
                                  “Identificación y características de los lípidos“
    5.1    Marco teórico
      Los lípidos son macromoléculas orgánicas que se encuentran en el organismo formando parte
      estructural de la membrana celular, el tejido adiposo y otras formas moleculares funcionales;
      así mismo, constituyen una rica fuente de reserva energética de nuestro organismo.
      Los lípidos se caracterizan por ser insolubles en agua, pero solubles en solvente orgánicos no
      polares como eter, acetona, cloroformo, benceno, etc. Quimicamente están constituidos por
      unidades denominadas ácidos grasos, unidos covalentemente a moléculas de alcohol.
      Los podemos clasificar en Lípidos simples (ésteres de ac.graso y alcohol generalmente
      glicerol), lípidos complejos (alcohol, ac. graso y otras moléculas como fosfato, aminas,
      carbohidratos y similares) y lípidos derivados como los esteroides, el colesterol, la Vit D y los
      ácidos biliares.

    5.2    Competencias
      •      Determina la solubilidad de los lípidos y un esquema de extracción.
      •      Demuestra el poder emulsificador de las sales biliares.
      •      Determina la presencia de colesterol
    5.3    Materiales y equipos
          Baño maría    Pipeta              Bagueta               KOH saturado              Alcohol
                        1mL
          Cocinilla     Pipeta              Gradilla              HCl concentrado           Acetona
                        2mL
          Beacker 1L    Pipeta              Bencina               HNO3 concentrado          Cloroformo
                        5mL
          Tubo 17x150mm Gotero              Bilis en SSF          Agua destilada            Pinza para tubos
          Tubo 13x100mm                                                                     Mechero de ron


    5.4    Procedimiento
      1.- Solubilidad de los lípidos:

       Reactivo/Tubos                           1            2            3            4               5
       Aceite de oliva (gotas)                  5            5            5            5               5
       Agua (mL)                                2           ---          ---          ---             ---
       Cloroformo (mL)                         ---           2                        ---             ---
       Eter Etílico (mL)                       ---          ---           2                           ---
       Benceno (mL)                            ---          ---          ---           2
       Alcohol (mL)                            ---          ---          ---          ---             2

      Al tubo N°5 (con alcohol) agregar 3mL de agua y calentar lentamente en el mechero.
      Anotar los resultados de solubilidad e interpretar.

      2.-Extracción de los lípidos:

             -1ra. extracción:
             Coloque en un beacker aprox. 1 g de yema de huevo (10 gotas) y agregue 5mL de eter
             etílico, mezcle con la bagueta hasta obtener una mezcla homogénea que vertirá en un tubo
             y agite fuertemente,




F-CV3-3B-2
                                                                                                Rev. Junio 2007
                                                       15
luego centrifugue a 4000 rpm. por 5min. Observe el resultado y anote.

              -2da. extracción:
              Separe cuidadosamente, en un tubo, el sobrenadante de la 1ra. extracción, y agregue al
              residuo 10mL de acetona, agite para mezclar. Observe y anote el resultado.
              Filtre la mezcla, lave residuo del filtro con acetona. Observe el precipitado y el filtrado
              final, anote los resultados en el siguiente cuadro:

                                                                   SUSTANCIA OBTENIDA                         CARACTERISTICAS

              1ra. extracción Sobrenadante
              (con Eter)
                              Precipitado

              2da. extracción Sobrenadante
              (con acetona)
                              Precipitado
            3.-Identificación del Colesterol: Reacción de Lieberman-Burchard
            -En un tubo de ensayo colocar 1mL de sobrenadante de la 2da extracción y evaporar el
solvente con sumo cuidado, en baño maría de 36-40°C.




              -Agregar 2mL de anhidrido acético, luego, por las paredes del tubo, 0,2mL de H2SO4
              concentrado.
              -Observe la reacción y la aparición de un color característico. Anote los resultados.

              Color resultante: ..................................... Corresponde a: .........................................



      5.5   Cuestionario
        1.- Fundamento de las características de solubilidad de los lípidos.




        2.- Composición y función de las sales biliares.




        3.- Fundamento de la Reacción de Lieberman-Burchard para la identificación de colesterol.




        4.- Importancia de los lípidos en la estructuración de la membrana celular.




 F-CV3-3B-2
                                                                                                                          Rev. Junio 2007
                                                                   16
5.6 Fuentes de información
    1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
    nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
    2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
    Reverté. Barcelona
    3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
    (España)
    4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
    Interamericana. Madrid
    5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
    lima
    6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
    2006. Barcelona (España)
    7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
    Monografía.2003. Perú.
    8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
    9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
    10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
    11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
    Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
    12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
    13. MURRAY y Col       Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
    Ed. Manual Moderno. México
    14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España

    nOTA: EL ALUmnO DEBERÁ ASISTIR A LA PRÁCTICA COn:
hUEVOS.
                                                Practica N° 6
                                       “Hidrólisis enzimática de los lípidos“
    6.1   Marco teórico
              Los lípidos son compuestos orgánicos insolubles en el agua, pero            solubles en
      solventes orgánicos como éter, cloroformo, benceno, disulfuro de carbono entre otros;
      participan en la absorción de vitaminas liposolubles, síntesis de hormonas etc.
      Desde el punto de vista energético constituye reserva calórica como tejido adiposo,
      proporcionando 9 kilocalorías por gramo.
      En general la hidrólisis de los lípidos libera ácidos grasos de alto peso molecular y un alcohol
      que depende del tipo de lípido, siendo el glicerol el mas frecuente.
      La digestión de los lípidos se inicia en el estómago, mediante una lipasa ácido- estable que se
      cree que en su mayoría se origina en la parte posterior de la lengua. Sin embargo, la velocidad
      de hidrólisis es lenta porque los triacilgliceroles forman una fase lipídica separada con una
      interfase agua-lípido limitada.

      La verdadera hidrólisis se realiza en la primera porción del yeyuno la primera acción de la
      lipasa pancréatica, esta enzima es específica para esteres en la posición 1 y 3 del glicerol y
      prefiere ácidos grasos de cadena larga de mas de 10 átomos de carbono. La hidrólisis de
      triacilgliceroles por la enzima pancreática también tiene lugar en la interfase agua-lípido de
      las partículas de la emulsión .La lipasa llega al intestino con el jugo pancreático requiere un
      pH optimo 8,sin embargo, el quimo ácido que viene del estómago no se neutraliza
      completamente por la alcalinidad del jugo pancréatico y la bilis.

      El pH intestinal es 6.5 y aún así la lipasa puede ejercer su acción. Por ejemplo a falta de la
      enzima cuando hay obstrucción del conducto pancreático por cualquier proceso patológico
      las grasas de la alimentación quedan sin digerir en las heces (esteatorrea).

      La lipasa libera los ácidos grasos de las posiciones 1 y 3 del glicerol, pasando sucesivamente
      por triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos, este último con el ácido graso (en posición 2),



F-CV3-3B-2
                                                                                        Rev. Junio 2007
                                                 17
sobre el no actúa la lipasa interviniendo entonces una enzima, la ISOMERASA que transforma
       el monoglicérido de posición 2 a 1 ó 3, haciéndolo de esta manera suceptible a la acción lenta,
       los productos finales de la digestión de los triglicéridos son monoglicéridos, pequeña
       cantidad de diglicéridos, triglicéridos, glicerol y ácidos grasos libres.

      Las sales biliares, en especial el glicocolato y taurocolato de sodio, contenidos en la bilis
      llegan al hígado por el coledoco, participan en la digestión y absorción de los lípidos. Su
      papel en la digestión consiste en disminuir la tensión superficial de las gotas de lípidos (de
      500 000 A de diámetro) originando una emulsión, en gotas de lípidos muy pequeñas,
      permitiendo una mayor superficie de acción a la lipasa y aumentando paulatinamente La
      actividad enzimática.
      Terminando el proceso digestivo por acción de las sales biliares, los productos finales forman
      complejos de 50 A de diámetro, llamadas MICELAS, que son absorbidas. Las sales biliares se
      absorben en el ileon y regresan al hígado por la vena porta.
      Los pasos de la digestión se pueden distinguir en el esquema siguiente:

       HIDRÓLISIS:

                            O

           O      H2C – O – C – R1                                 R1 – CO2H
                                                 LIPASA                  +        CH2 -- OH
   R2 – C – O – CH             O     +   2 H2O                     R2 -- CO2 --CH
                                                                        +
                  H2C – O – C – R3                                                CH2 -- OH
                                                                  R3 – CO2H

       Triacilglicerol                       2 ácidos grasos y 1 monoacilglicerol
     R = cadena                              hidrocarbonada


       En la hidrólisis pueden distinguirse al menos cinco fases diferentes:
       -Hidrólisis de triacilgliceroles a ácidos grasos libres y monogliceroles
       -Solubilización de los ácidos grasos libres y monogliceroles por detergentes (ácidos biliares )
       y transporte desde la luz intestinal hacia a la superficie celular.
       -Captación de ácidos grasos libres y mono gliceroles al interior de la célula y resíntesis a
       triacilgliceroles.
       -Empaquetamiento de los triacilgliceroles recién sintetizados en glóbulos lipídicos especiales
       denominados quilomicrones.
       -Exocitósis de los quilomicrones desde las células y liberación a la linfa.
    6.2        Competencias
       •       Mide la actividad de la lipasa pancreática por titulación con una base.
       •       Determina el efecto de las sales biliares sobre la digestión de los lípidos.
    6.3        Materiales y equipos
               Tubos 17x150mm               Bagueta             Buffer fosfato pH 8
                    Gradilla               Baño maría           Bilis en Buffer pH 8
                   Pipeta 1mL            Aceite de oliva             KOH 0.1N
                   Pipeta 5mL             Fenolftaleina         Sol. Pancreatina 2%
                  Pipeta 10mL            Agua destilada


       Hidrólisis del aceite por acción de la lipasa
       Fundamento:
       Se ha demostrado que los aceites no hidrolizables difícilmente se absorben en cantidades
       apreciables. Sin embargo, cuando el aceite está en forma de emulsión muy fina, puede ser
       absorbido a nivel intestinal en pequeña proporción.




F-CV3-3B-2
                                                                                              Rev. Junio 2007
                                                           18
Para que esto ocurra es necesario la presencia de las sales biliares (bilis) que van a producir la
      emulsión de las grasas y de esa manera facilitar su absorción y la acción enzimática de la
      lipasa pancreática sobre las grasas hasta el desdoblamiento en ácidos grasos y glicerol. En
      todo este proceso interviene el pH óptimo de 8.00.
      En el laboratorio su demostración se puede llevar a cabo empleando una enzima pancreática
      (sintética, solución de pancreatina) en lugar de la lipasa pancreática, la cual para poder ser
      aislada necesita un proceso laborioso, también debido a su inestabilidad.
    6.4   Procedimiento
      Disponer una serie de 3 tubos de ensayo y proceder de la siguiente manera
                 Reactivo / Tubos Nº                  1             2                3
       Aceite de oliva neutralizado mL                1             1                --
       Buffer pH 8. 0 mL                               -            2                2
       Sales biliares en buffer pH8 mL                2             --               2
       Agua destilada mL                              2             2                1
      Antes de agregar la solución de pancreatinina, debemos estar seguros de que no haya acidez
      libre en el medio que estamos preparando, para lo cual debemos emulsionar bien cada tubo y
      si el color rosado del indicador (fenolftaleína) no se mantiene, nos indica acidez en el medio de
      proceso; se añade unas gotas de KOH 0.1N, cuidando del exceso.
       Solución de pancreatina mL                     5             5                5

      Agitar y deje incubando durante 20 minutos a 37º C.
      Durante este tiempo la enzima libera los ácidos grasos del aceite que acidifican el medio, esto
      hace virar al indicador hacia la zona ácida.




      En el tubo que no contiene sales liberadas, la reacción habrá sido más lenta que la del primer
      tubo, y en el que no contiene aceite de pepita no habrá ninguna acidez.

    6.5   Cuestionario
       1.- Cual es el origen de la pancreatina empleada en la práctica.




       2.- Cuantos tipos de Lipasa existen.




       3.- Importancia clínica, tipos y composición de la bilis.




F-CV3-3B-2
                                                                                         Rev. Junio 2007
                                                   19
6.6 Fuentes de información
    1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
    nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
    2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
    Reverté. Barcelona
    3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
    (España)
    4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
    Interamericana. Madrid
    5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
    lima
    6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
    2006. Barcelona (España)
    7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
    Monografía.2003. Perú.
    8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
    9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
    10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
    11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
    Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
    12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
    13. MURRAY y Col       Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
    Ed. Manual Moderno. México
    14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España

                                                Practica N° 7
              “Identificación de proteínas, determinación de proteínas totales y fraccionadas“
    7.1   Marco teórico
                     Las proteínas son macromoléculas compuestas de cadenas de aminoácidos.
      Todos los aminoácidos tienen la misma estructura básica, conformada por un carbono central
      α unido a un grupo amino (-NH2), un grupo carboxilo (-COOH), un hidrógeno y un radical
      variable (-R) que da la diferencia entre uno y otro aminoácido, confiriéndoles propiedades
      distintivas.

      Se define como Aminoácido a aquella molécula con grupo amino y grupo carboxilo que
      proviene de la hidrólisis de las proteínas, según ello se han identificado 20 aminoácidos los
      cuales difieren en sus propiedades fisicoquímicas, a tal punto que la secuencia exacta de ellos
      determina, la función, la solubilidad o no en agua, su función catalítica como enzima, su
      función reguladora como hormona o estructural. En algunos casos variaciones en un solo
      aminoácido ocasiona que una proteína pierda su función.

      Las proteínas presentan diferentes funciones muy importantes en los procesos biológicos,
      actúan como elementos estructurales, biocatalizadores, coagulación sanguínea, anticuerpos,
      hormonas, receptores hormonales y también como nutrientes de primer orden en la dieta y
      alimentación del humano.

      PROTEINAS SERICAS: El plasma sanguíneo es una solución coloidal con gran contenido de
      proteínas, aprox 7-7,5 g/dL. Al conjunto de proteínas del plasma se les denomina proteínas
      totales plasmáticas.

      Albúmina.- Las albúminas constituyen mas de la mitad del total de proteínas del organismo,
      debido a ello se les pueden considerar como una importante reserva proteica del organismo.
      Se caracterizan por su gran estabilidad, solubilidad en agua y soluciones salinas, bajo peso
      molecular siendo el mayor contribuyente en el mantenimiento de la presión osmótica coloidal
      intravascular.
      Es sintetizada por el hígado, se encarga de fijar y transportar numerosas sustancias que son
      insolubles en medios acuosos tales como los ácidos grasos, hormonas esteroidales,
      bilirrubina, catecolaminas ,etc.




F-CV3-3B-2
                                                                                       Rev. Junio 2007
                                                 20
Globulinas.- Son proteínas plasmáticas complejas, muy heterogéneas, de alto peso molecular,
      son insolubles en agua pero solubles en soluciones salinas, constituyen las proteínas
      conjugadas (glicoproteínas y lipoproteínas).
      Fibrinógeno.- Se sintetiza en el hígado y constituye la fase preliminar de la fibrina que
      interviene en el proceso de coagulación sanguínea, su concentración media es de 0.3g/dL.
      Variaciones en los Niveles de las Proteínas Séricas

      -Hiperproteinemia.- Se presenta en la deficiencia relativa de agua. Se trata de cambios en la
      concentración y no indica que haya alteración de la cantidad absoluta de proteínas, se aprecia
      en casos de deshidratación, en ciertas enfermedades crónicas: procesos inflamatorios
      crónicos, cirrosis hepática, etc.

      -Hipoproteinemia.- Se presenta en un exceso relativo de agua. Se trata de cambios en la
      concentración y no indica alteración de la cantidad absoluta de proteínas.
      Pérdida excesiva de proteínas, principalmente albúmina, a través del riñón en el síndrome
      nefrótico, por la piel en quemaduras graves, y por el intestino en enteropatías.
      Disminución de la síntesis proteica por deficiencia proteica grave en la dieta, hepatopatía
      grave o malabsorción. A niveles <4 g/dl, es frecuente la aparición de edemas.

      -Hiperalbuminemia.- Es el aumento anormal de albúmina y se presenta generalmente, en casos
      de deshidratación.

      -Hipoalbuminemia.- Es la disminución anormal de albúmina lo cual genera trastornos en la
      distribución de los líquidos orgánicos con formación de edema, acompañados de
      hipocalcemia (debido a su unión con el calcio plasmático), presentándose en cuadros de
      infección crónica, insuficiencia hepática, hemorragias y síndrome nefrótico.

      -Hiperglobulinemias.- Aumento anormal de globulinas, se presenta en daño hístico activo,
      como en procesos inflamatorios, procesos malignos, después de traumatismos, etc.

      -Hipoglobulinemias.- Es la disminución de globulinas presentándose en diversos cuadros
      dependiendo del tipo de globulina involucrada.
      Las α-globulinas, están disminuidas particularmente en casos de enfisema pulmonar y
      aumentadas en las reacciones inflamatorias.
      Las γ-globulinas, están disminuidas en casos de pérdida renal como en el síndrome nefrótico,
      disminución de su síntesis, deficiencias inmunitarias, edad avanzada, etc, encontrándose
      aumentadas generalmente en procesos inflamatorios crónicos y en algunas enfermedades
      autoinmunitarias.

      TERMINOLOGIA CLINICA :
      Proteinograma: Gráfico que representa cada una de las concentraciones proteicas en los
      distintos líquidos del organismo.
      Proteinemia: Concentración de las proteínas en la sangre.
      Proteinosis: Acumulación de proteínas en los tejidos.

      Proteinuria : Presencia de proteína en orina.
      Proteinuria falsa: Proteína extraña a la de la orina por contaminación, ejemplos: leucorrea
      vaginal, menstruación, semen, secreciones perianales o rectales, etc. Para evitar se
      recomienda recoger orina por cateterismo.
    7.2   Competencias
      •   Determina la presencia cualitativa de las proteínas en diferentes muestras.
      •   Determina la concentración de proteínas totales y fraccionadas (albúmina y globulina) en
          suero.
    7.3 Materiales y equipos


     Tubo 13x100mm               Pipeta 1mL     Centrífuga      Rvo. Biuret
     Espectrofotómetro           Pipeta 2mL     Baño maría      Rvo. Proti 2 Winer Prot.Tot
     Alcohol                     Pipeta 5mL     Espatula        Rvo. Proti 2 Winer
                                                                albúmina
     Tips amarillos              Gotero         Bagueta         Estándar Prot Totales y
                                                                Albumina
F-CV3-3B-2 venoject 21Gx 1”
      Aguja                      Gradilla       Mortero         Piceta
     Micropipeta 10-100uL        Ligadura       Algodón                               Rev. Junio 2007
                                                21
Método para la determinación de proteínas totales:

      Fundamento:
      Las proteínas en medio alcalino y en presencia de sulfato de cobre forman un complejo de
      color violeta, debido a que el ión cobre forma un complejo tetra coordinado con el nitrógeno
      del enlace peptídico

                  C                                           C

               H--N                                         N--H

             R—H--C                                         C—H--R
                                       Cu ++
                  C                                          C

               H--N                                         N--H

      Método para la determinación de Albúmina

      Fundamento:

      La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la
      Bromo Cresosulfon Ftaleína (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio
      tamponado a un pH 3.8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de
      reactivos, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.
    7.4   Procedimiento
      DETERMINACIONDE PROTEÍNAS EN MUESTRAS DE ALIMENTOS

      Colocar cada muestra en tubos de ensayo (si son alimentos líquidos) o en lunas de reloj (si
      son alimentos sólidos) y agregar 2 mL de Rvo de Biuret.
      El color violeta indicará la presencia de proteína y el mantenimiento del color celeste la
      ausencia.

      De requerirlo, un alimentos sólido (cereales, granos, otros) puede ser triturado en el mortero
      previo a la reacción.

      DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES
      Tomar una muestra de sangre (aprox. 3 mL), centrifugar a 3,000 rpm por 10 minutos. Separar el
      suero.

      Colocar en tres tubos de acuerdo al esquema siguiente:
      Rvo. / TUBOS                BLANCO            ESTANDARD                 MUESTRA
      Agua destilada                50 uL                 -                       -
      Estándar Prot. Tot.             -                 50 uL                     -
      Muestra (suero)                 -                   -                    50 uL
      Rctv.EDTA/ Cu                3.5 mL              3.5mL                   3.5 mL

      Mezclar e Incubar durante 15 minutos a 370C. Leer en espectrofotómetro a 540 nm llevando a
      cero con el tubo blanco.
      Estabilidad de la mezcla de reacción Final: El color de la reacción es estable durante 12 horas
      por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.

      DETERMINACION DE ALBUMINAS

      Colocar en tres tubos lo siguiente:
      Rvo. / TUBOS                BLANCO              ESTANDARD               MUESTRA
      Estándar Albúminas              -                  10 uL                    -
      Muestra (suero)                 -                    -                   10 uL
      Reactivo BCF                 3.5 mL               3.5 mL                 3.5 mL



F-CV3-3B-2
                                                                                        Rev. Junio 2007
                                                 22
Mezclar y mantener los tubos entre 15 y 28º C durante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro
      a 625 nm llevando a cero con el blanco de reactivo.




      Estabilidad de la mezcla de reacción final: El color de la reacción es estable 20 minutos, por
      lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.

      CALCULO DE LOS RESULTADOS:
      Proteínas Totales (g/dL) =            Abs. Muestra x f             f=[Std.P.T.g/dL]
                                                                                 Abs Std

      Albúmina (g/dL)               =       Abs. Muestra x f      f=[Std. Alb. g/dL]
                                                                                       Abs. Std.

      Globulinas (g/dL)             =       [Proteínas Totales]   - [Albúmina]


      Relación A/G =                [Albúmina g/dL]
                            [Prot. Tot. g/dL] - [Alb. g/dL]

      VALORES DE REFERENCIA: Proteínas totales:   6,1 a 7,9 g/dL
                                    Albúmina:             3,5 a 4,8 g/dL
                                    Globulinas:           2,0 a 3.6 g/dL
                                    Relación A / G:       1–2
    7.5   Cuestionario
       1.-Mencione usted las características moleculares de: Caseína, ovoalbúmina, suero de leche,
       gelatina, insulina, glutatión.




       2.- Tratamientos contra las quemaduras empleando colágeno.




       3.- Explique usted los cuadros de hipoproteinemia por pérdida renal.




    7.6 Fuentes de información
    1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
    nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
    2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
    Reverté. Barcelona




F-CV3-3B-2
                                                                                           Rev. Junio 2007
                                                  23
3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
     (España)
     4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
     Interamericana. Madrid
     5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
     lima
     6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
     2006. Barcelona (España)
     7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
     Monografía.2003. Perú.
     8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
     9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
     10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
     11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
     Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
     12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
     13. MURRAY y Col       Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
     Ed. Manual Moderno. México
     14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España

NOTA: El alumno deberá asistir a la práctica con lo siguiente: Huevos, leche, yogurt, carne cruda,
carne cosida, soya, quínua.

                                                  Practica N° 9
                                          “Determinación de Colesterol”

           9.1 Marco teórico
       El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis y tejido cerebral. Es precursor de los
       ácidos biliares, esteroides, y vitamina D. Su determinación contribuye al diagnóstico y
       clasificación de las dislipidemias.
           9.2 Competencias
       •     Determina la concentración de Colesterol en suero
       •     Relaciona la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico

             9.3 Fundamentos del metodo

       El colesterol se determina por acción de las enzimas Colesterol ester hidrolasa y
       Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los ésteres de colesterol, y la segunda
       oxida el colesterol libre produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en presencia
       de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un
       compuesto coloreado que absorbe a 505 nm.

       Colesterol ester    CEH        Colesterol + ácidos grasos

       Colesterol + O2     CHOD       Colest-4-en-3-ona + H2O2

       2H2O2 + 4-AAP +p-HBA           PAP      Comp. Coloreado + 4H2O

                9.4 Reactivos y Equipos

       Conservado entre 2° y 8° C. y protegido de la luz, estable hasta la fecha de caducidad
       indicada en la etiqueta.
       El reactivo con el tiempo puede tomar un leve color rosado que no afecta los resultados.
       Descartar el reactivo si la absorbancia contra blanco de agua es superior a 0.4 D.O. a 505
       nm.
       Preparación: El reactivo se provee listo para su uso.
       Composición del reactivo enzimático:
       Buffer fosfato pH 7.2                                100 mM




F-CV3-3B-2
                                                                                         Rev. Junio 2007
                                                    24
Colesterol ester hidrolasa                            >150 U/l
      Colesterol oxidasa (recombinante)                     >100 U/l
      Peroxidasa                                            >1000 U/l


      4-Aminoantipirina                           0.4 mM
      Acido p-hidroxibenzoico                        10 mM
      Azida sódica                                  0.1 g/dl
      Estabilizantes y preservantes no reactivos    c.s.
      Solución standard:
      Colesterol en solución acuosa estabilizada    200 mg/dl
      Espectrofotómetro o fotocolorímetro de filtros capaz de medir absorbancia a 505
      nm. (rango 500 - 550 nm.)
      Baño Maria
      Pipetas

      MUESTRAS
      Utilizar de preferencia suero o plasma (Heparina o EDTA) libre de hemólisis. La muestra
      debe tomarse con el paciente en ayunas.
      Los tubos y material de vidrio deben estar limpios y libres de residuos de detergentes. El
      colesterol es estable 7 días a temperatura ambiente, y 6 meses en congelador.
     9.5 Procedimiento
      Llevar el reactivo a la temperatura que se realizará el ensayo. Las pipetas a utilizar
      deben estar limpias y libres de residuos para no contaminar el reactivo.

                                   Blanco              Standard    Muestra
              Muestra         (ml)   --                --           0.01
             Standard                   (ml)      --              0.01        --
             Reactivo         (ml)   1.00          1.00            1.00

      Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C. ó 10 minutos a temperatura ambiente (>20°C.).
      Leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo.
      El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos.

             9.6 Calculos

       FACTOR        =                     200
                                     Absorbancia Standard

      Colesterol (mg/dl)= Factor x Abs. Muestra

      RANGO DE REFERENCIA                  140 a 200 mg/dl




                                “Determinación de Acido Úrico en suero “
         9.7 Marco teórico
    Los nucleótidos de una célula se estan renovando continuamente. Los nucleotidos se degradan
    por hidrólisis a nucleósidos, por medio de las




F-CV3-3B-2
                                                                                   Rev. Junio 2007
                                                  25
nucleotidasas. Las nucleósidos fosforilasas catalizan la ruptura fosforolítica de los nucleósidos
    para originar bases libres y ribosa -1-fosfato. Esta base libre proviene de una base nitrogenada
    de tipo purínica
    A pH fisiológico, el ácido úrico pierde un protón dando lugar a urato. En los seres humanos,
    el urato es el producto final de la degradación de las purinas y se excreta en la orina. Niveles
    elevados de urato en el suero provocan la gota, una enfermedad en la que las sales de urato
    forman cristales que deterioran las articulaciones y los riñones. En algunos casos se utiliza el
    alopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa para tratar la gota.
    También existen otros desórdenes que transcurren acompañados de hiperuricemia, tales como
    leucemia, policitemia, mieloma múltiple, intoxicación plúmbica, incluyendo alteraciones
    medicamentosas en los tratamientos con citostáticos o con tiazidas. Mientras que otros
    medicamentos (drogas uricosúricas tales como salicilatos y la fenilbutazona) aumentan la
    excreción del ácido úrico, disminuyendo los niveles séricos del mismo

           9.8 Competencias
      •      Determina la concentración de ácido úrico en suero
      •      Relaciona la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico

             9.9 Materiales y equipos
      Micropipeta 10 a 200 ul           Tips amarillo
      Pipetas 5 mL                      Suero
      Gradilla                          Estándar de ácido urico 10 mL x grupo
      Tubos 3 x mesa                    Rvo Enzimático de acido úrico 10 mL x grupo
      Espectrofotométro                 Baño María

         9.10 Fundamento del método
   El ácido úrico es oxidado por la enzima específica uricasa, generándose alantoína y H2O2, el cual
   en una reacción mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac.3 dimetiaminobenzoico y 4 –
   AAP produciéndose un compuesto coloreado con un máximo de absorción a 555 nm., en cantidad
   proporcional a la cantidad de ácido úrico presente en la muestra.

   Acido Úrico uricasa          Alantoína + H2O2

   H2O2 + DMAB + 4- AAP           POD     H2O + Complejo coloreado

           9.11 Procedimiento
                                    BLANCO       STANDARD      MUESTRA
      Muestra       (ml)                ---          ---           0, 025
      Standard      (ml)                 ---          0, 025            ---
      Reactivo     (ml)               1,00             1, 00        1, 00
      Mezclar e incubar 10 minutos a 37º C, o 20 minutos a temperatura ambiente
      (20 a 25ºC).
       Leer a una longitud de onda óptima 555 nm.
      Llevar a cero con agua destilada el espectrofotómetro

          Anote la absorbancia de la muestra:…………….




      La fórmula matemática a usar es el factor de calibración

          FACTOR       =          10 mg/mL
                                 Absorbancia Estándar

      ACIDO ÚRICO (mg/dL.) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO




F-CV3-3B-2
                                                                                        Rev. Junio 2007
                                                   26
VALORES DE REFERENCIA:
      En Suero: Hombres.................. 3, 4 a 7, 0 mg/dl.
      Mujeres......................      2, 4 a 5, 7 mg/dl.
         9.12 Cuestionario
      1.- ¿Cuáles son los otros factores de riesgo de padecer enfermedades
      cardíacas y vasculares, Además del exceso de colesterol?




      2.- ¿Qué tipos de colesterol hay, haga un breve resumen de cada uno?




      3.- ¿Cómo afecta a los niños el colesterol, y cuál es el nivel de colesterol recomendable en la
      infancia?




      4.- Desarrolle el esquema metabólico de la formación del ácido úrico?




      5.- Señale que otras muestras biológicas podemos usar para determinar ácido úrico?




              9.13 Fuentes de información
    1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y
    nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima
    2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed.
    Reverté. Barcelona
    3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona
    (España)
    4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill
    Interamericana. Madrid
    5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004
    lima
    6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición.
    2006. Barcelona (España)
    7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales.
    Monografía.2003. Perú.




F-CV3-3B-2
                                                                                         Rev. Junio 2007
                                                      27
8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México
    9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona.
    10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú
    11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003.
    Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España.
    12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid
    13. MURRAY y Col       Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005
    Ed. Manual Moderno. México
    14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España



                                                Practica N° 10
                                “Actividad enzimática y factores que la afectan“
    10.1 Marco teórico
             Las Enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químico-biológicas
      acelerando la velocidad de dichas reacciones hasta su punto de equilibrio.
      Los substratos son las moléculas sobre las que actúan las enzimas.
      En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reacción,
      aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los
      correspondientes substratos en tanto permanece fija la concentración de la enzima.

      La Actividad Enzimática se puede expresar como:
      a.- La DESAPARICION del SUBSTRATO.                              E + S                        E +
      b.- La APARICION del PRODUCTO                            P
      c.- Por la MODIFICACION de COFACTORES

      Factores que Modifican la Actividad Enzimática           Donde:     C             C´
      Son diversos:                                            E    = Enzima
      1.- pH del medio                                         S    = Substrato
      2.- Temperatura                                          P    = Producto
      3.- Concentración de Enzima
      4.- Concentración de Substrato                           C    = Cofactor antes de la reacción
      5.- Acción de Inhibidores y Activadores
    10.2 Competencias
      •      Comprueba la acción de los factores que regulan la actividad enzimática
      •      Demuestra como la actividad enzimática puede ser expresada.
    10.3 Materiales y equipos

       Tubos 17x150mm Pipeta 1mL             Indicador de pH         Solución Salina
                                             1-14                    Fisiológica
       Potenciómetro          Pipeta 5mL     Estandar de pH 4        Albúmina de huevo en
                                                                     SSF
       Baño maría       Pipeta 10mL Estandar de pH 7                 Pepsina en SSF
       Hielo            Bagueta     Estandar de pH 10                Agua destilada
       Beacker 500mL    Gradillas   Portacubetas                     NaCO3 10%
       Espectrofotómetr                                              HCl 1N
       o

      Para nuestros experimentos estudiaremos el efecto de la PEPSINA sobre la ALBUMINA.
      La PEPSINA es una enzima que hidroliza cadenas grandes de proteínas convirtiéndolas en
      cadenas pequeñas.

      La ACTIVIDAD ENZIMATICA se demostrará por desaparición del substrato, o sea la
      disminución de la turbidez de una solución de Albúmina de huevo sobre la cual actuará la
      enzima. La turbidez se leerá en el ESPECTROFOTOMETRO.




F-CV3-3B-2
                                                                                       Rev. Junio 2007
                                                   28
10.4     Procedimiento
  Experiencia Nº1 EFECTO DEL PH
  Principios Teóricos.- Si actúa una enzima sobre un             Efectos del         pH    sobre       la   Actividad
  substrato n cantidades equimoleculares (iguales)               Enzimática.
  variando el pH del medio de reacción, se observará
  que existe una región o punto de actividad óptima,             A E                       pH óptimo
  correspondiendo al pH, al cual se denomina pH                  c    n 1
  OPTIMO, que varía con la pureza de la enzima, el               t   z
  tipo de sustancia sobre el cual actúa, las sales del
  medio, etc. Ello debido a la interacción E–S (Enzima
                                                                 i   i
  –Substrato) que se realiza, en gran parte, a través de         v   m
  los grupos ionizados existentes en sus moléculas. La           i   á
  concentración de iones (H+) u Oxhidrilos (OH-)                 d   t
  presentes en el medio, alteran los grupos ionizados            a   i
  e impiden la asociación de las moléculas.
                                                                 d   c
  Procedimiento Experimental:                                        a
  Preparar 6 tubos de acuerdo al esquema siguiente:
                                                                     0
         Tubo Nº                   1         2            3               4             5
                                                                                     BAJO          pH 6
         H2O dest. (mL)           ---       1,5           2              1,5               ---              ---
         HCl 1N (mL)              2,0       0,5          ---                               ---              ---
         Na2CO3 10%(mL)           ---       ---          ---             0,5              2,0               ---
         Albúmina (mL)             5         5            5               5                 5               ---
         Pepsina (mL)             ---       ---          ---             ---               ---              20
         pH del tubo              1.0        2           6.0             10               11.0              ---

         Incubar por 5 min los 6 tubos en Baño maría a 37ºC.
         Añadir 3 mL de la pepsina pre-incubada (tubo 6), a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5, y mezclar bien.
         Volver a incubar los tubos 1 al 5 por 5 min en baño maría a 37ºC.
         Leer la absorbancia de los tubos del 1-5 al espectrofotómetro a una longitud de onda de
         440nm, usando un blanco de agua destilada.

         La lectura debe realizarse tan pronto sale de la incubación, de no ser así, mantener los tubos
         en agua helada hasta el momento de la lectura.

         CALCULOS: Para obtener la actividad enzimática se debe restar la mayor absorbancia
         obtenida menos la absorbancia de cada tubo. Graficar los resultados, en un papel milimetrado,
         colocando el pH en las abcisas y la actividad enzimática en las ordenadas.
         RESULTADOS: Encontrar el pH óptimo de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA

 Experiencia Nº2 EFECTO DE LA TEMPERATURA                                Efectos de la Temperatura sobre la
 Principios Teóricos.- La temperatura acelera la velocidad               Actividad Enzimática.
 de las reacciones al aumentar las colisiones efectivas entre
                                                                         A E                   Temperatura
 los elementos reaccionantes.
 En una reacción enzimática también deben colisionar E-S                 óptima
 (Enzima-Sustrato) para que la reacción progrese, por                    c    n 1
 tanto, las reacciones enzimáticas serán más rápidas a                   t   z
 mayores temperaturas, sin embargo y dada la naturaleza                  i   i
 proteica de las enzimas, la temperatura no puede                        v   m
 aumentarse indefinidamente, pues comenzarán a
 romperse los puentes de hidrógeno, alterándose las                      i   á
 estructuras secundarias, situación que se conoce como                   d   t
 DESNATURALIZACION (Ver esquema).                                        a   i
                                                                         d   c
         Procedimiento Experimental:
         1º Preparar dos series de 5 tubos cada una, de acuerdo al esquema siguiente:

           Reactivo / Tubo N°    CONTROL           1            2               3                 4                5
         H2O dest. (mL)            3,0            3,5          3,5             3,5               3,5              ---




F-CV3-3B-2
                                                                                                            Rev. Junio 2007
                                                    29
HCl 1N (mL)                  ---        0,5        0,5         0,5         0,5         ---
       Albúmina (mL)                5.0        5.0        5.0         5.0         5.0         ---
       Pepsina (mL)                 ---        ---        ---         ---         ---         11

      Incubar por 5 min a 37°C en baño maría
      Agregar 2 mL de la pepsina pre incubada (Tubo 5) a cada uno de los tubos del 1 al 4 e
      inmediatamente incubar por 5min según el esquema siguiente:

                 Tubo                  1               2                  3               4
             Temperatura °C        0 (hielo)      25(Ambiente)           37        100 (ebullición)

      Al finalizar el tiempo, colocar inmediatamente los tubos en agua helada para detener la
      reacción, hasta el momento de su lectura.

      Leer al espectrofotómetro los tubos 1-4 y el control, usando un blanco con agua destilada.

      CALCULOS: La actividad enzimática se encontrará restando la lectura de cada tubo
      (1-4) de la lectura del tubo CONTROL (SIN INCUBAR). Graficar los resultados en un papel
      milimetrado, colocando la temperatura en las abscisas y la actividad enzimática en las
      ordenadas.
      RESULTADOS: Encontrar la T° óptima de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA
    10.5 Cuestionario
      1.- Explique el mecanismo de acción de la las enzimas




      2.- Escriba la reacción que cataliza la pepsina.




      3.- Con los datos de la práctica elabore las gráficas de pH vs Actividad y T° vs Actividad, y
      explique en función a la bibliografía recomendada.




      4.- A que llamamos especificidad por el sustrato?




      5.- Uso del dosaje de enzimas para el diagnóstico clínico, de ejemplos.




F-CV3-3B-2
                                                                                         Rev. Junio 2007
                                                  30
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii
Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

Tema n° 1 Instrumentación y equipo de laboratorio
Tema n° 1 Instrumentación y equipo de laboratorioTema n° 1 Instrumentación y equipo de laboratorio
Tema n° 1 Instrumentación y equipo de laboratorioYanina G. Muñoz Reyes
 
Tecnicas de evaluacion para riesgos quimicos
Tecnicas de evaluacion para riesgos quimicosTecnicas de evaluacion para riesgos quimicos
Tecnicas de evaluacion para riesgos quimicosAlexandra_1717
 
Organica 1 practica 5 indice de refraccion
Organica 1 practica 5 indice de refraccionOrganica 1 practica 5 indice de refraccion
Organica 1 practica 5 indice de refraccionPeterr David
 
Clase 3 Métodos analíticos vía humeda
Clase 3 Métodos analíticos vía humedaClase 3 Métodos analíticos vía humeda
Clase 3 Métodos analíticos vía humedaMargarita Guzman
 
Muestreos activos contaminantes quimicos
Muestreos activos contaminantes quimicosMuestreos activos contaminantes quimicos
Muestreos activos contaminantes quimicosMagnin Alejandro
 
Determinaciones refractometricas en alimentos
Determinaciones refractometricas en alimentosDeterminaciones refractometricas en alimentos
Determinaciones refractometricas en alimentosLisbeth Condori Rojas
 
(1) refracción molar y especifica de sustancias puras y disoluciones
(1) refracción molar y especifica de sustancias puras y disoluciones(1) refracción molar y especifica de sustancias puras y disoluciones
(1) refracción molar y especifica de sustancias puras y disolucionesPablo Cuervo
 
Giuliano david bozzo moncada nº 2 demanda bioquímica de oxigeno
Giuliano david bozzo moncada nº 2 demanda  bioquímica de oxigenoGiuliano david bozzo moncada nº 2 demanda  bioquímica de oxigeno
Giuliano david bozzo moncada nº 2 demanda bioquímica de oxigenoGiulianoBo45
 

La actualidad más candente (18)

PRACTICA #16 LEY DE BEER
PRACTICA #16 LEY DE BEERPRACTICA #16 LEY DE BEER
PRACTICA #16 LEY DE BEER
 
Tema n° 1 Instrumentación y equipo de laboratorio
Tema n° 1 Instrumentación y equipo de laboratorioTema n° 1 Instrumentación y equipo de laboratorio
Tema n° 1 Instrumentación y equipo de laboratorio
 
Practica 3 garcia
Practica 3 garciaPractica 3 garcia
Practica 3 garcia
 
Presentación1 copia
Presentación1   copiaPresentación1   copia
Presentación1 copia
 
Tecnicas de evaluacion para riesgos quimicos
Tecnicas de evaluacion para riesgos quimicosTecnicas de evaluacion para riesgos quimicos
Tecnicas de evaluacion para riesgos quimicos
 
Practica 14
Practica 14Practica 14
Practica 14
 
Bibiana
BibianaBibiana
Bibiana
 
Organica 1 practica 5 indice de refraccion
Organica 1 practica 5 indice de refraccionOrganica 1 practica 5 indice de refraccion
Organica 1 practica 5 indice de refraccion
 
Clase 3 Métodos analíticos vía humeda
Clase 3 Métodos analíticos vía humedaClase 3 Métodos analíticos vía humeda
Clase 3 Métodos analíticos vía humeda
 
Abosorcion atomica
Abosorcion atomicaAbosorcion atomica
Abosorcion atomica
 
Muestreos activos contaminantes quimicos
Muestreos activos contaminantes quimicosMuestreos activos contaminantes quimicos
Muestreos activos contaminantes quimicos
 
Determinaciones refractometricas en alimentos
Determinaciones refractometricas en alimentosDeterminaciones refractometricas en alimentos
Determinaciones refractometricas en alimentos
 
Exposicion colorimetria
Exposicion colorimetriaExposicion colorimetria
Exposicion colorimetria
 
Espectrofotómetro
EspectrofotómetroEspectrofotómetro
Espectrofotómetro
 
Afsquimagua
AfsquimaguaAfsquimagua
Afsquimagua
 
(1) refracción molar y especifica de sustancias puras y disoluciones
(1) refracción molar y especifica de sustancias puras y disoluciones(1) refracción molar y especifica de sustancias puras y disoluciones
(1) refracción molar y especifica de sustancias puras y disoluciones
 
Giuliano david bozzo moncada nº 2 demanda bioquímica de oxigeno
Giuliano david bozzo moncada nº 2 demanda  bioquímica de oxigenoGiuliano david bozzo moncada nº 2 demanda  bioquímica de oxigeno
Giuliano david bozzo moncada nº 2 demanda bioquímica de oxigeno
 
Tema 2
Tema 2Tema 2
Tema 2
 

Destacado

Unidades de concentración iii medio
Unidades de concentración iii medio Unidades de concentración iii medio
Unidades de concentración iii medio cravargasp
 
Enfermedades bacterianas en bovinos de leche
Enfermedades bacterianas en bovinos de lecheEnfermedades bacterianas en bovinos de leche
Enfermedades bacterianas en bovinos de lecheCindy Montaño Calani
 
Uso y manejo adecuado del microscopio
Uso y manejo adecuado del microscopioUso y manejo adecuado del microscopio
Uso y manejo adecuado del microscopioliceo nacional
 
Trabajo de biologia unan-managua, jorge perez
Trabajo de biologia unan-managua, jorge perezTrabajo de biologia unan-managua, jorge perez
Trabajo de biologia unan-managua, jorge perezjorge perez
 
Enfermedades del-ganado-bovino
Enfermedades del-ganado-bovinoEnfermedades del-ganado-bovino
Enfermedades del-ganado-bovinoAinoa Bersani
 

Destacado (7)

Unidades de concentración iii medio
Unidades de concentración iii medio Unidades de concentración iii medio
Unidades de concentración iii medio
 
Laboratorio ok
Laboratorio okLaboratorio ok
Laboratorio ok
 
Enfermedades bacterianas en bovinos de leche
Enfermedades bacterianas en bovinos de lecheEnfermedades bacterianas en bovinos de leche
Enfermedades bacterianas en bovinos de leche
 
Uso y manejo adecuado del microscopio
Uso y manejo adecuado del microscopioUso y manejo adecuado del microscopio
Uso y manejo adecuado del microscopio
 
Trabajo de biologia unan-managua, jorge perez
Trabajo de biologia unan-managua, jorge perezTrabajo de biologia unan-managua, jorge perez
Trabajo de biologia unan-managua, jorge perez
 
Practica de-el-laboratorio
Practica de-el-laboratorioPractica de-el-laboratorio
Practica de-el-laboratorio
 
Enfermedades del-ganado-bovino
Enfermedades del-ganado-bovinoEnfermedades del-ganado-bovino
Enfermedades del-ganado-bovino
 

Similar a Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii

INFORME DE LABORATORIO 1 - BIOTECNOLOGIA.pdf
INFORME DE LABORATORIO 1 - BIOTECNOLOGIA.pdfINFORME DE LABORATORIO 1 - BIOTECNOLOGIA.pdf
INFORME DE LABORATORIO 1 - BIOTECNOLOGIA.pdfCinthiaSamanda
 
INFORME DE ELABORACION DE MAQUETAS-GRUPO 4B.pdf
INFORME DE ELABORACION DE MAQUETAS-GRUPO 4B.pdfINFORME DE ELABORACION DE MAQUETAS-GRUPO 4B.pdf
INFORME DE ELABORACION DE MAQUETAS-GRUPO 4B.pdfBrendaLissetVelasque
 
Guia de bioquimica_y_nutricion_2016-ii
Guia de bioquimica_y_nutricion_2016-iiGuia de bioquimica_y_nutricion_2016-ii
Guia de bioquimica_y_nutricion_2016-iiMijail JN
 
2. PPT micropipetas y microdiluciones.pdf
2. PPT micropipetas y microdiluciones.pdf2. PPT micropipetas y microdiluciones.pdf
2. PPT micropipetas y microdiluciones.pdfXimenaDeBarrenechea
 
Ud 1 el laboratorio clínico . equipamiento básico.
Ud 1 el laboratorio clínico . equipamiento básico.Ud 1 el laboratorio clínico . equipamiento básico.
Ud 1 el laboratorio clínico . equipamiento básico.Lucia Gil Alvarez
 
GENERALIDADES, INTRODUCCION A LA BIOQUIMICA CLINICA.docx
GENERALIDADES, INTRODUCCION A LA BIOQUIMICA CLINICA.docxGENERALIDADES, INTRODUCCION A LA BIOQUIMICA CLINICA.docx
GENERALIDADES, INTRODUCCION A LA BIOQUIMICA CLINICA.docxDeyvisAndresNievesFl
 
Manual del Estudiante_Laboratorista Clínico_ MI-Sub1.pdf
Manual del Estudiante_Laboratorista Clínico_ MI-Sub1.pdfManual del Estudiante_Laboratorista Clínico_ MI-Sub1.pdf
Manual del Estudiante_Laboratorista Clínico_ MI-Sub1.pdfmarcosantiago28141
 
Diapositivas bioquímica
Diapositivas bioquímicaDiapositivas bioquímica
Diapositivas bioquímicaCitlally Rubio
 
Calibracion de pipetas
Calibracion de pipetas Calibracion de pipetas
Calibracion de pipetas IPN
 
Practica 3 gluconato de calcio
Practica 3 gluconato de calcio Practica 3 gluconato de calcio
Practica 3 gluconato de calcio Moises Magallanes
 
PRACTICA 1-EQUIPOS Y MATERIALES DEL LAB. BIOLOGIA-1.pdf
PRACTICA 1-EQUIPOS Y MATERIALES DEL LAB. BIOLOGIA-1.pdfPRACTICA 1-EQUIPOS Y MATERIALES DEL LAB. BIOLOGIA-1.pdf
PRACTICA 1-EQUIPOS Y MATERIALES DEL LAB. BIOLOGIA-1.pdfJEMNIMIRIAMMEZONESCO
 
11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICA
11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICA11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICA
11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICAOlenka78
 
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO-URIBE.pdf
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO-URIBE.pdfRECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO-URIBE.pdf
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO-URIBE.pdfMelaniaU1
 

Similar a Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii (20)

Micologia general
Micologia general Micologia general
Micologia general
 
INFORME DE LABORATORIO 1 - BIOTECNOLOGIA.pdf
INFORME DE LABORATORIO 1 - BIOTECNOLOGIA.pdfINFORME DE LABORATORIO 1 - BIOTECNOLOGIA.pdf
INFORME DE LABORATORIO 1 - BIOTECNOLOGIA.pdf
 
Lab bioquimica 2
Lab bioquimica 2Lab bioquimica 2
Lab bioquimica 2
 
INFORME DE ELABORACION DE MAQUETAS-GRUPO 4B.pdf
INFORME DE ELABORACION DE MAQUETAS-GRUPO 4B.pdfINFORME DE ELABORACION DE MAQUETAS-GRUPO 4B.pdf
INFORME DE ELABORACION DE MAQUETAS-GRUPO 4B.pdf
 
Guia de bioquimica_y_nutricion_2016-ii
Guia de bioquimica_y_nutricion_2016-iiGuia de bioquimica_y_nutricion_2016-ii
Guia de bioquimica_y_nutricion_2016-ii
 
Informe 3 y 4
Informe 3 y 4Informe 3 y 4
Informe 3 y 4
 
2. PPT micropipetas y microdiluciones.pdf
2. PPT micropipetas y microdiluciones.pdf2. PPT micropipetas y microdiluciones.pdf
2. PPT micropipetas y microdiluciones.pdf
 
Practica 1
Practica 1Practica 1
Practica 1
 
6 mp bioquímica
6 mp bioquímica6 mp bioquímica
6 mp bioquímica
 
Ud 1 el laboratorio clínico . equipamiento básico.
Ud 1 el laboratorio clínico . equipamiento básico.Ud 1 el laboratorio clínico . equipamiento básico.
Ud 1 el laboratorio clínico . equipamiento básico.
 
GENERALIDADES, INTRODUCCION A LA BIOQUIMICA CLINICA.docx
GENERALIDADES, INTRODUCCION A LA BIOQUIMICA CLINICA.docxGENERALIDADES, INTRODUCCION A LA BIOQUIMICA CLINICA.docx
GENERALIDADES, INTRODUCCION A LA BIOQUIMICA CLINICA.docx
 
Manual del Estudiante_Laboratorista Clínico_ MI-Sub1.pdf
Manual del Estudiante_Laboratorista Clínico_ MI-Sub1.pdfManual del Estudiante_Laboratorista Clínico_ MI-Sub1.pdf
Manual del Estudiante_Laboratorista Clínico_ MI-Sub1.pdf
 
Diapositivas bioquímica
Diapositivas bioquímicaDiapositivas bioquímica
Diapositivas bioquímica
 
Calibracion de pipetas
Calibracion de pipetas Calibracion de pipetas
Calibracion de pipetas
 
Laboratorio
LaboratorioLaboratorio
Laboratorio
 
Practica 3 gluconato de calcio
Practica 3 gluconato de calcio Practica 3 gluconato de calcio
Practica 3 gluconato de calcio
 
Bioseguridad y Microscopía
Bioseguridad y Microscopía Bioseguridad y Microscopía
Bioseguridad y Microscopía
 
PRACTICA 1-EQUIPOS Y MATERIALES DEL LAB. BIOLOGIA-1.pdf
PRACTICA 1-EQUIPOS Y MATERIALES DEL LAB. BIOLOGIA-1.pdfPRACTICA 1-EQUIPOS Y MATERIALES DEL LAB. BIOLOGIA-1.pdf
PRACTICA 1-EQUIPOS Y MATERIALES DEL LAB. BIOLOGIA-1.pdf
 
11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICA
11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICA11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICA
11._MICROPIPETAS. EQUIPOS E INSTRUMENTOS EN EL ARRA ÁREA DE BIOQUÍMICA
 
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO-URIBE.pdf
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO-URIBE.pdfRECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO-URIBE.pdf
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO-URIBE.pdf
 

Guia bioquimica y-nutricion_2011-ii

  • 1. 3B-2 GUÍA DE PRÁCTICAS UnIDAD ACADémICA: ESCUELA ACADEmICO PROFESIOnAL DE OBSTETRICIA nOmBRE DE LA ASIGnATURA BIOQUÍmICA Y nUTRICIÓn nOmBRES Y APELLIDOS : JOSELInE RICCI CUELLAR AUTOR : Q.F. JAVIER F. mARTInEZ CARRERAS INTRODUCCIÓN La Bioquímica, que crece a un ritmo extraordinariamente vigoroso, ejerce una influencia cada vez mayor en las Ciencias de la vida. Actualmente se considera que la Bioquímica es el arma más poderosa con que se cuenta para interpretar el fenómeno biológico, con una profunda incidencia en numerosas áreas incluyendo la medicina y la nutrición humana. La presente guía de práctica comprende la aplicación experimental de los conceptos fundamentales, tanto básicos como de desarrollo de la capacidad crítica del estudiante más que en el almacenamiento memorístico de datos que tampoco puede, sin embargo, descuidarse. Cada Práctica de laboratorio incluye: Marco Teórico, Competencias, Materiales y Equipos, Procedimiento, Cuestionario y Fuentes de información que se deben desarrollar cuidadosamente durante la práctica. La guía de laboratorio debe ser revisada antes de iniciar la práctica. INSTRUCCIONES GENERALES El estudiante deberá estar en las prácticas en el horario programado, a la hora exacta y con mandil blanco. Todos los alumnos participarán activamente en el desarrollo de las prácticas. Es necesario que el alumno antes de cualquier experimento posea los conocimientos básicos: - Los objetivos de cada práctica. - El material y equipo de laboratorio necesario para la realización de dicha practica. - Los reactivos verificando su nombre, concentración, evitando contaminar los mismos. - El método seleccionado que permitirá obtener resultados objetables - Desarrollar su capacidad de observación y actitud crítica El modelo para el informe de cada práctica debe seguir el siguiente esquema: 1.− Título de la práctica 2.− Nombre del(los) integrante(s), fecha de entrega 3.− Materiales y Procedimientos 4.- Cálculos y Resultados 5.− Conclusiones (de acuerdo a los objetivos y resultados de la práctica) 6.− Desarrollo del cuestionario F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 1
  • 2. 7.− Bibliografía Práctica N° 1 “Reconocimiento de materiales y equipos de laboratorio bioquímica” 1.1 Marco teórico Para realizar con éxito las practicas programadas para el curso, se requiere de diferentes materiales de laboratorio como son pipetas, fiola, probeta y otros. Así mismo el uso de equipos e instrumentos como potenciómetro, balanza, espectrofotómetro y otros. Estos materiales y equipo tienen condiciones básicas para su uso como el estar calibrados, limpios y que sea el material correcto según nuestras necesidades. 1.2 Competencias • Demuestra y explica el uso correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un laboratorio. • Aprende el manejo correcto de los materiales y equipos de uso rutinario en un laboratorio. 1.3 Materiales y equipos Materiales y equipos a usar en la práctica: Tubos Beacker 100mL Refrigerante Alcohol 70° Centrífuga 13x100mm Tubos Beacker 500mL Bagueta Anaranjado de Baño maría 10x75mm metilo Tubos Matraz 50mL Pipeta pasteur Azul de metileno Potenciómetr 17x150mm o Tubo de Matraz 500mL Pipeta 1mL 1/10 Agua destilada Balanza centrífuga Probeta Micropipeta Pipeta 1mL 1/100 Mecheros de ron Incubadora 100mL 10-100uL Probeta Micropipeta Pipeta 2mL 1/10 Pinza para buretas Espectrofotó 1000mL 100-1000uL metro Bureta 25mL Tips amarillos Pipeta 5mL 1/10 Mortero Mechero de gas Gradillas Tips azules Pipeta 10mL 1/10 Propipeta Pinzas para tubos Luna de Reloj Matraz Kitazato Pipeta 25mL 1/10 Adaptador Tripode 500mL venoject Goteros Fiola 100mL Pipeta 5mL no Ligadura Embudo terminal Rejilla de Fiola 1000mL Pipeta 5mL volum Aguja venoject Soporte asbesto 21Gx1” universal 1.4 Procedimiento PIPETAS: Son materiales graduados que se emplean para medir o trasvasar volúmenes de líquidos. Primero deberá identificar si es una pipeta terminal (graduación llega a la punta) o no terminal (graduación finaliza antes de la punta). Luego identificar el volumen que puede medir con la pipeta (capacidad de la pipeta). Modo de uso: Introduzca la pipeta en el líquido sin tocar el fondo del recipiente, aspirar con la ayuda de una propipeta succionando suavemente hasta el volumen que requiere, tapar la pipeta CON EL DEDO INDICE, si se sobrepaso el volumen relaje lentamente su dedo y deje salir el líquido hasta que logre enrazar el líquido (nivel deseado). El profesor le enseñará el correcto uso de las pipetas. MICROPIPETAS: F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 2
  • 3. Son pipetas muy especiales que se emplean para medir volúmenes muy pequeños en el rango de los microlitros (uL), pueden medir un volumen fijo o medir diferentes volúmenes (regulables) se emplean con un aditamento en la punta llamado TIP o puntera, que es específico según la capacidad de la micropipeta. Modo de uso: Coloque el tip correspondiente, ajústelo, regule el volumen a medir girando el mando del émbolo, coloque el pulgar atravesado sobre el mando de la micropipeta, presione suavemente e introduzca el tip al líquido a medir, suelte suavemente el émbolo y observe que el líquido llene el tip, para depositar el contenido presione el émbolo completamente y el líquido será expulsado del tip. Para eliminar el tip usado presione el mando expulsor. RECUERDE QUE CUANDO SE EMPLEA CUALQUIER MUESTRA BIOLOGICA EL TIP DEBE SER ELIMINADO DENTRO DE UN DESINFECTANTE COMO LA LEJIA O SIMILAR. El profesor le enseñará el correcto uso de las micropipetas y demás materiales y equipos de laboratorio. 1.5 Cuestionario 1. Los materiales de vidrio son elaborados en vidrio de Borosilicato, describa las características de este material. 2. Describa los equipos que debe emplear para preparar soluciones. 3. El lavado es una parte importante del trabajo en el laboratorio, describa la forma correcta para el lavado de materiales de vidrio. 4. Describa cada uno de los materiales mostrados durante la práctica y explique su uso. 1.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 3
  • 4. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España Práctica N° 2 “Determinación del pH, Amortiguadores” 2.1 Marco teórico El concepto de pH fue dado a conocer por primera vez en 1909 por SORENSEN, y lo definió como el logaritmo negativo de la concentración de iones de hidrógeno es decir: pH = - log (H) ó = [H + ] = 10 – pH ó = - log ( 1 ) H Donde la concentración del hidrogenión es dada en unidades moles. La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y más utilizados en bioquímica puesto que esta medida determina características notables de la estructura y la actividad de las macromoléculas biológicas, por consiguiente, la conducta de las células y de los organismos. CALCULO DEL PH DE UNA SOLUCION: Procedimiento .- Consiste en calcular la concentración de iones hidrógeno [H+] Calcular el logaritmo de base 10 de [H+] El pH es el logaritmo negativo que ha sido encontrado en (1) Ejemplo: El agua pura (25ºC), de concentración 1 x 10 –7 M tiene como pH: PH = - log ( 1 x 10 – 7 ) PH = - ( - 7 ) PH = 7 El agua es un conductor eléctrico cuando se encuentra pura, debido a su propiedad disociativa, pero en pequeño grado. H2O + H2O H3O+ + HO– (1) A 25ºC existe 1 molécula de H3O + y una molécula de HO– por cada 5.55x108 moléculas de agua El número de agua por litro sería: 1000 g/L = 55.5 moles/L (2) 8 g/mol 55.5 x 108 moles de agua hacen 107g /L, existiendo solo un gramo de H3O+; es decir, 10–7 g/L, y un gramo de OH– ó 10 – 7 g/L. De la fórmula (1) se deduce que la constante de ionización del agua (Kw) es: Kw = [H3O+] [HO-] = [H3O+] [ OH - ] 2 2 [H2O] (55.5) De lo que: [H3O+] [OH-] = K(55.5)2 = Kw Por lo que: Kw = 10 – 7 x 10– 7 = 10 – 14 Por lo tanto: Log Kw = log [H3O+] + log [OH-] -Log KW = -log [ H3O+] + - log [OH-] - p Kw = p[H3O+] + p[HO-] -p Kw = pH + pOH Soluciones Buffer, tampón o amortiguadores : Son aquellas soluciones que se caracterizan por ser mezclas de ACIDOS y BASES DEBILES y sus sales, las cuales impiden las variaciones bruscas de pH; permitiendo que el cambio de este no sea el más mínimo. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 4
  • 5. APLICACIONES : En organismos vivientes, por ejemplo: Para conocer las alteraciones producidas en la composición química de la sangre. Para conocer las alteraciones del pH de otros líquidos biológicos: saliva, lagrimas, sudor, líquido cefalorraquídeo, etc. En ciertos fenómenos fisiológicos: respiración, aplicación de enzimas (catalizadores), etc. En química: Para determinar el pH de una solución. Para determinar el punto final de una titulación Demostración : reacciones químicas con liberación o consumo de iones H +. Otros 2.2 Competencias • Aplica los conceptos fundamentales sobre el pH y la acción de los sistemas buffer. • Utiliza las técnicas para medir el pH. 2.3 Materiales y equipos Materiales y equipos a usar en la práctica: Potenciómetro Anaranjado de Bureta 25mL Estandar de pH Pipeta 1mL metilo 10 Beacker 100mL Papel de tornasol Soporte Ac. Acético Pipeta 2mL azul universal 0,1N Matraz 100mL Papel de tornasol Pinza para Acetato sodio Pipeta 5mL rosado bureta 0,1N Estandar de pH Indicador de pH 1-14 Tubos Agua destilada Pipeta 10mL 4 13x100mL Estandar de pH Gradillas Vaso Fenolftaleina HCl 0,1N 7 descartable METODOS DE DETERMINACION DEL pH: Existen varios procedimientos: Mediante indicadores Mediante cintas o papel de pH universal Mediante el potenciómetro o pHmetro DETERMINACION DEL pH MEDIANTE EL USO DE INDICADORES: Indicadores.-Son soluciones o cuerpos químicos que se agregan a los líquidos para dosar, con el fin de ver el momento preciso del término de la reacción; manifestándose por la aparición, desaparición o modificación del color. Estas sustancias químicas pertenecen al grupo de los ácidos y bases débiles. Según Glaser, se clasifican en tres grupos: 1ero: Para valorar bases débiles con ácidos fuertes. Ejem: anaranjado de metilo, rojo de congo, etc. 2do: Para valorar bases y ácidos fuertes. Ejem : Tornasol, paranitrofenol, etc. 3ero: Para valorar ácidos débiles con bases fuertes. Ejem: fenolftaleina, etc. Aplicación : 1) En determinar el pH de una solución deseada. 2) En determinar el punto final de una titulación (volumétrica) 3) En determinar reacciones químicas con liberación o consumo de H Comprende: Elección de un indicador para una titulación, para lo que se debe tener en cuenta conceptos básicos sobre disociación de sales, la que está sujeta a una constante (pK) y a una variación de colores dependiente a su mayor o menor disociación de pK; el pK se emplea y se define como el log (1/Ka) ó el –log Ka para definir la fuerza de un ácido o de una base. Un ácido cuya constante de ionización sea 10 –4 tiene un pKa de 4. De igual forma pKb es – log Kb, para cualquier constante de equilibrio Kb. (Ka constante de ionización de un ácido; Kb, constante de ionización de una base). Continuando : a) Disociación de una sal formada a partir de un ácido fuerte y una base débil: F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 5
  • 6. NH4Cl NH4+ + Cl- H2O OH - + H+ NH 4Cl + H2O NH 4 OH + HCl La mayor tendencia de ionización del HCl frente a la del NH4OH lo hace una solución ACIDA. b) Disociación de una sal formada a partir de un ácido débil y una base fuerte. Ejemplo : Citaremos la titulación del CH3 – COOH con NaOH CH 3 – COONa CH 3–COO - + Na + H2O OH - + H + CH3–COOH + NaOH CH3COOH presenta menor tendencia a ionizarse que el NaOH siendo ésta una solución ALCALINA. c) Disociación de una sal formada a partir de un ácido y una base fuertes. Citaremos la titulación del HCl con NaOH. NaCl Na+ + Cl – H2O OH - + H+ NaOH + HCl La solución es NEUTRA ya que NaOH como el HCl tienen igual tendencia a ionizarse Determinación del pH mediante el uso del papel indicador : El papel Indicador: Es un papel especial que contiene absorbidos indicadores en serie o a lo largo, que al ponerse en contacto con la solución a evaluar da un color que corresponde al pH aproximado de la solución problema. En el comercio existen diferentes tipos de papeles indicadores, por ejemplo: el papel indicador universal (pH de 1 a 10); PH – YDRIEN papel (pH del 10 a 14) Podemos observar la siguiente tabla de indicadores: TABLA DE INDICADORES : INDICADOR Pk LIMITES COLOR Azul de timol 1.50 0.5 – 2.8 rojo – amarillo Azul de bromofenol 3.98 3.0 – 5.0 amarillo – azul Verde de bromofenol 4.68 3.7 – 5.7 amarillo - azul Anaranjado de metilo 4.00 3.5 – 4.5 anaranjado–amarillo Rojo de clorofenol 5.98 5.0 – 7.0 amarillo - rojo Púrpura de bromocresol 6.30 5.3 – 7.3 amarillo - púrpura Azul de bromotimol 7.00 6.0 – 8.0 amarillo - azul Rojo de fenol 7.90 6.9 – 8.9 amarillo - rojo Fenolftaleína 9.20 8.2 – 10.2 incoloro - rojo Rojo de metilo 5.10 4.4 - 6.0 rojo - amarillo F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 6
  • 7. DETERMINACIÓN DE pH MEDIANTE EL POTENCIÓMETRO O pHMETRO: Fundamento.- Se fundamenta en la generación de una diferencia de potencial que se establece cuando se emplean dos soluciones ioniozadas de diferente concentración en las cuales se hace pasar una corriente eléctrica, es decir la diferencia de potencial es proporcional a la diferencia de concentración(es) entre las soluciones. Partes que lo constituyen.- 1.-Electrodo de vidrio: Es un pequeño bulbo de vidrio soldado a un vástago de vidrio de borosilicato (pirex) dentro de él existe una solución de KCl 0.1N en la que está sumergido un electrodo de referencia interna que puede ser de plata cloruro de plata o de Calomell, quedando aislada dicha celda mediante un cierre hermético constituido por un dieléctrico de cera o plástico y un casco de metal o plástico. 2.-Un electrodo de referencia externa de Calomell 3.-Un tablero de control con diales que regulan el funcionamiento del equipo. PARTE OPERATIVA: La calibración consiste en darle información al equipo mediante el uso de estándares de pH, o sea soluciones cuyo pH es conocido y certificado. Pasos previos: Verificar la instalación correcta del equipo, su conexión con la corriente general. Calibrar la temperatura ambiente con la del equipo, lavando repetidas veces con agua destilada y secando los electrodos con papel filtro. Retirar cuidadosamente el jebe de seguridad del electrodo de vidrio. La aplicación se realiza luego, enjuagando los electrodos con agua destilada, secándolos con papel absorbente y sumergiéndolos en la solución problema, obteniéndose su pH que se leerá en el lector en una escala de 0 a 14. Actualmente se usan pHmetros portátiles, que funcionan con baterías o con una corriente alterna de 100 a 200 voltios, digitales, otros. 2.4 Procedimiento 1. Determinación del pH: El alumno deberá medir el pH de las diferentes muestras solicitadas por el profesor (leche, gaseosas, yogurt, saliva, orina, otras) empleando los métodos descritos en la práctica. 2. Titulación Acido-Base: 2.1.-Titular una base (NaOH 0.1N) con un ácido: Colocar en un Beacker 10 mL de NaOH (hidróxido de sodio) 0.1N y tres gotas de fenolftaleína Enrazar una bureta de 25mL con H2SO4 (ácido sulfúrico) 0.1N Comience a titular dejando caer gota a gota el H2SO4 0,1N sobre NaOH 0,1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de H2SO4 0,1N que se gastó en la titulación (gasto) 2.2.-Titular un ácido (H2SO4 0,1 N) con una base: Colocar en un Beacker 10mL de H2SO4 0,1N y tres gotas de anaranjado de metilo. Enrazar una bureta de 25mL con NaOH 0,1N. Comience a titular dejando caer gota a gota el NaOH 0,1N sobre el H2SO4 0,1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de NaOH 0,1N que se gastó en la titulación (gasto) F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 7
  • 8. 3. Cambios de pH en un sistema Buffer: 3.1. El agua como buffer Colocar en un beaker, 10 mL de agua destilada y tres gotas de anaranjado de metilo. Enrasar una bureta de 25mL con HCl 0,1N. Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0,1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de HCl 0,1N que se el gastó en la titulación. 3.2. Un ácido débil y su respectiva sal en diferentes proporciones: Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,5 mL de ácido acético 0.1N, 0,5mL de acetato de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo. Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N. Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación. 3.3. Un ácido débil y su respectiva sal en iguales proporciones: Colocar en un beaker 8 mL de agua destilada, 1,0mL de ácido acético 0.1N, 1,0mL de acetato de sodio 0.1N y tres gotas de anaranjado de metilo. Enrazar una bureta de 25mL con HCl 0.1N. Comience a titular dejando caer gota a gota el HCl 0.1N, agitando constantemente hasta que cambie el color. Anotar la cantidad (mL) de HCl 0.1N que se gastó en la titulación. 2.5 Cuestionario 1.-Mencione el pH normal de: Sangre, orina, líquido seminal, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, saliva y su correlación con alguna patología. 2.-Principales sistemas buffer orgánicos. 2.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 8
  • 9. 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España nOTA: EL ALUmnO DEBERÁ ASISTIR A LA PRÁCTICA COn mUESTRAS DE LEChE, YOGURT, GASEOSA, FRUTAS, JUGO DE FRUTAS. Practica N° 3 “Identificación de los carbohidratos“ “Determinación de glicemia y glucosuria“ 3.1 Marco teórico Los carbohidratos son los principales constituyentes de nuestra dieta, llegando a presentarse en un 50-60% de la misma. Así mismo, son la principal fuente de energía del humano, siendo los almidones los más abundantes. Entre los monosacáridos de mayor importancia se tiene a la glucosa, la manosa, la galactosa (aldohexosas), la ribosa (aldopentosa) y la fructuosa (cetohexosa), entre los disacáridos tenemos a la maltosa (Glu-Glu), la sacarosa (Fru-Glu) y la lactosa (Gal-Glu), y entre los polisacáridos el almidón vegetal, al almidón animal (glucógeno) y la celulosa.. Los azúcares, hidratos de carbono o carbohidratos son los compuestos más abundantes en la naturaleza y en nuestra dieta, en su mayoría del tipo aldohexosas y cetohexosas. Los carbohidratos se ingieren en la dieta como almidones (polisacárido), sacarosa y lactosa (disacáridos) y en menor proporción en como glucosa, galactosa y fructosa (monosacáridos). El producto principal de la digestión de los polisacáridos es la glucosa (monosacárido) la cual es absorbida ya sangre donde se mantiene en ayunas entre 70 a 110 mg/dL, lo que se conoce como los niveles de Glicemia. Para su dosaje existen diferentes métodos como el de la glucosa oxidasa, el método de la orto-tolouidina (en desuso por ser cancerígeno) y el de Somogy – Nelson. Las necesidades de glucosa son cubiertas inicialmente por el glucógeno o almidón animal que es la reserva de glucosa de la que se echa mano a través de la glucogenólisis. Esta vía es regulada por dos hormonas: el glucagon para el glucógeno hepático y la adrenalina para el hepático y muscular. Cuando el requerimiento de glucosa es grande y los depósitos están vacíos, se puede formar glucosa a partir de intermediarios anfibólicos (como el lactato, los aminoácidos, el glicerol, los ácidos grasos y los cuerpos cetónicos), mediante la gluconeogenesis, que se lleva a cabo en las células hepáticas, adiposas y musculares. De esta manera se mantienen los niveles sanguíneos de glucosa que son necesarios para las células, especialmente para las células cerebrales, que no tienen posibilidad de reserva y están a merced de la glucosa circulante. En el aspecto hormonal, la glucosa sanguínea está regulada principalmente por dos hormonas secretadas por el páncreas endocrino: F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 9
  • 10. La Insulina: Es una hormona formada por 51 aminoácidos dispuestos en dos cadenas. La insulina se forma a partir de la proinsulina, que está constituida por una sola cadena polipetídica que se sintetiza en las células β de los islotes pancreáticos de Langerhans. La insulina es el factor más importante de los que intervienen en la regulación de los niveles de glucosa sanguínea, que deben mantenerse dentro de unos límites rigurosos. Cuando la glucosa está elevada en la sangre el nivel de insulina se incrementa del mismo modo. El Glucagon: Es una hormona formada por una cadena polipeptídica compuesta por 29 aminoácidos; es sintetizada por las células α de los islotes pancreáticos de Langerhans y se incrementa en la sangre al disminuir la glucosa, estimulando la glucogenólisis hepática. Alteraciones del Metabolismo de los Carbohidratos: Para los efectos del establecimiento del diagnóstico en el trastorno o alteraciones del metabolismo de carbohidratos se han considerado dos situaciones clínicas bien definidas: Hiperglucemia: Es el estado biológico donde los niveles de glucosa sanguínea están por encima de los valores considerados normales: La hiperglucemia fisiológica en situaciones de excitación síquica, esfuerzos musculares, por exposición a baños calientes y a veces en el periodo menstrual, y la hiperglucemia patológica más común es la Diabetes mellitus que es un síndrome caracterizado por un aumento de los niveles de la glucosa en estado postprandial y ayuno, que conlleva a características de laboratorio como: Aumento de la glucosa en ayunas por encima de 7.8 mmol/L (140 mg/dl). Aumento exagerado de la glucosa a cualquier hora del día, por encima de 200mg/dl Aparición de glucosa en orina (glucosuria) cuando esta pasa de 180 mg/dL en sangre (umbral renal de filtración para la glucosa). El aumento de glucosa en orina produce un aumento en la osmolaridad y en la secreción de agua en orina, con aumento de la excreción de orina (poliurea). El aumento de glucosa sérica produce igualmente un aumento de la osmolaridad sanguínea, y un aumento de agua intravascular por dos mecanismos: por una parte, se produce una sed intensa que obliga a beber una cantidad (polidipsia) y, por otra parte, existe un trasvase del agua interior de la célula al exterior, que lleva a una hemodilución de los elementos formes. Aunque existe una gran cantidad de glucosa en la sangre esta no es capaz de ingresar a la célula y producir energía debido a la falta de insulina, produciéndose sensación de hambre y el enfermo come mucho (polifagia), pero a pesar de ello disminuye su peso corporal, ya que se utilizan las reservas, activándose la gluconeogénesis, con una gran formación de cuerpos cetónicos, que dan lugar a un estado de acidosis metabólica y de halitosis (aliento a manzanas). La Diabetes se acompaña de pérdida de proteína muscular y cetosis al aumentar el catabolismo de proteínas, el músculo libera mayor cantidad de alanina proporcionando substrato para la gluconeogénesis, promoviendo la hiperglucemia debido a la mayor disponibilidad de substrato, la gluconeogénesis puede contribuir con más del 30% de la producción de la glucosa hepática; la mayor utilización de aminoácidos produce la pérdida de proteína. Con el tiempo y con hiperglicemias constantes, se producen trastornos vasculares que afectan a vasos pequeños, como los de la retina, el riñón y los capilares de la circulación general, con lo que el enfermo puede acabar con problemas de ceguera, insuficiencia renal y gangrena en zonas periféricas. El diagnóstico precoz y un buen control de la enfermedad, encaminado a mantener los niveles de glucosa dentro de unos niveles adecuados, son condiciones necesarias para que el enfermo con diabetes mellitus pueda tener una buena calidad de vida y no sea esta enfermedad la que le produzca la muerte. Hipoglucemia: Hablamos de hipoglucemia cuando los niveles de glucosa en sangre se sitúan en 2.2 y 2.5 mmol/l (40-45 mg/dL). La hipoglucemia se puede presentar por un ayuno prolongado, ejercicio intenso o a un exceso de insulina, como ocurre en la hiperplasia de las células de los islotes pancreáticos (insulinomas), o pueden ser del tipo reactivas producidas por la administración exagerada de insulina exógena o por tratamiento con hipoglucemiantes orales en el caso de enfermos diabéticos. 3.2 Competencias F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 10
  • 11. Determina cualitativamente la presencia de carbohidratos en muestras de alimentos. • Diferencia entre almidones, monosacáridos y azúcares reductores presentes en los alimentos. • Determina la glucosa en sangre por el método enzimático de glucosa oxidasa. • Determina cualitativamente la glucosa en orina por el método de Benedict. 3.3 Materiales y equipos Tubos 17x150mm Bagueta Pipeta 1mL Rvo. Benedict Luna de reloj Alcohol Pipeta 5mL Rvo. Glicemia enzimático Mechero de ron Mortero Goteros Estd Glucosa 100mg/dL Pinza para tubos Agua destilada Rvo. Lugol Micropipeta 10-100uL Tubo 13x100mm Pipeta 1mL Algodón Rvo. orcinol Gradilla Pipeta 2mL Ligadura Rvo. Selivanoff Espectrofotómetro Pipeta 5mL Tips amarillos Alcohol amilico Baño maría Centrífuga Micropipeta 10-100uL Portacubetas Aguja venoject 21Gx 1” Glucosa Método enzimático de la Glucosa Oxidasa. Fundamento: Se basa en la oxidación de la glucosa por la enzima glucosa oxidasa, reacción en la que se consume oxígeno (O2) y se genera agua oxigenada (H2O2). Con esta reacción como principio, la glucosa se puede cuantificar por varios métodos: Reacción de la Glucosa Oxidasa: Glucosa + O2 GOD Acido Glucónico + H2O2 (suero) H2O2 + Cromógeno POD Compuesto coloreado+ H2O (505nm) GOD: Glucosa Oxidasa POD: Peroxidasa Para la determinación de glucosa en orina por el método de BENEDICT Fundamento.- Este método se basa en que la glucosa tiene la capacidad de reducir los iones cúpricos (Cu +2) a iones cuproso (Cu+).Por calentamiento los iones cuprosos forman oxido cuproso (Cu2O), este método detecta los azúcares reductores totales en orina. 3.4 Procedimiento 1.- Identificación de los carbohidratos Reacción de Benedict Reacción de Molisch para Reacción de Lugol para para determinar la determinar la presencia de determinar la presencia de presencia de Carbohidratos Monosacáridos C Almidones reductores Muestra Muestra Muestra Agregar 2 Agregar por las Agregar 2 Calentar al mechero Agregar 2– gotas de mL de Rvo. 3 gotas de Rvo. paredes por 1-2 min. Tenga lentamente 3mL de Benedict Rvo. Lugol Molisch cuidado de H2SO4 (+) Formación de anillo (+) Cambio de color al azul (+) Cambio de color al verdoso, castaño, amarillo, azul intenso o negro color VIOLETA marrón o rojo ladrillo F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 11
  • 12. Reacción de Bial. Para las Pentosas. a. En un tubo de prueba se coloca 5 ml. De Reactivo de orcinol, se calienta hasta ebullición y en este momento se adiciona gota a gota 1mL de solución problema. b. La aparición de un color verde oliva , soluble en alcohol amilico, indica presencia de pentosa. Reacción de Selivanoff. a. En un tubo de prueba se coloca 3 ml de solución clorhídrica de resorcinol y 6 ml de Muestra problema. b. Luego se coloca en Baño de María hirviente por unos minutos. c. El desarrollo inmediato de una coloración anaranjado rojiza indica presencia de pentosas. 2.- Determinación de glicemia Tomar una muestra de sangre (aprox. 3 mL), centrifugar a 3,000 rpm por 10 minutos. Separar el suero. Determinación de glucosa sanguínea: Colocar en tres tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema: REACTIVO / TUBO BLANCO ESTANDARD MUESTRA Estándar Glucosa(100mg/dL) -- 20 ul -- Muestra (suero) -- -- 20 ul Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml Mezclar e incubar en baño María a 37º C por 10 minutos. Leer a 505nm, llevando a cero el aparato con el blanco de reactivo. CALCULO DE LOS RESULTADOS: Glucosa (g/L) = D (Abs M) x f f = 1,00 g/L Abs. Std VALORES DE REFERENCIA: Suero o plasma: 0.70 – 1.10 g/L Sangre total: 0.60 – 1.00 g/L LCR: 0.40 – 0.74 g/L 3.- Determinación de glucosuria Determinación de glucosa en orina por el método de BENEDICT: Colocar en un tubo de ensayo 8 gotas de orina patológica y en otro tubo 8 gotas de orina de su compañero (no patológica), agregar a ambos tubos 2mL. del reactivo de Benedict, llevar a hervir durante 3 minutos, enfriar e interpretar los resultados. INTERPRETACION: Color Interpretación Azul negativo Azul verdoso vestigios Verde positivo + Verde parduzco positivo ++ Amarillo positivo +++ F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 12
  • 13. Rojo ladrillo positivo ++++ Normalmente en la orina no hay azucares, su presencia nos indica que hay glucosuria, que generalmente está en relación con el incremento de la glucosa en sangre sin embargo, hay algunas situaciones fisiológicas en la que esta presencia puede ser positiva pero por la presencia de otros glúcidos como la lactosa en la mujer gestante o en la que está dando de lactar sin que sea patológica. 3.5 Cuestionario 1.- Fundamento de la reacción de Molisch, Benedict y Lugol. 2.- Cuales son los azúcares característicos de cada una de las muestra empledas. 3.- Por qué la diferencia de reacción entre el azúcar blanca y rubia. 4.- Que es un “azúcar invertido” y su utilidad. 5.- Según la última clasificación de la OMS, cuantos tipos de diabetes existen. 6.- Como se produce la insulina recombinante. 3.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 13
  • 14. nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España NOTA: El alumno deberá asistir a la práctica con muestras de leche, yogurt, queso, gaseosa, cerveza, azúcar rubia, azúcar blanca, huevo, galleta, pan, frutas. Practica N° 4 Seminario N° 1: “Aspectos bioquímicos de la Diabetes Mellitus y la Diabetes Gestacional”. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Generalidades. Conceptos. Etiopatogenia 2.- Tipos de Diabetes. Factores predisponentes 3.- Insulina. Síntesis. Función. Deficiencia 4.- Complicaciones en el embarazo Seminario Nº2: “ Mecanismo Hormonales de Regulación Metabólica” Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Generalidades. Conceptos. Características generales de las hormonas. 2.- Clasificación de las hormonas 3.- Sistema de la adenilato ciclasa y la proteína quinasa A. 4.- Sistema de la fosfolipasa, inositol y Ca++. 5.- Receptores intracelulares Seminario N° 3: “Rol bioquímico y fisiológico del surfactante pulmonar en la maduración fetal y el de las prostaglandinas en el proceso de parto”. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Generalidades. Significado fisiológico. Composición química. 2.- Índices de madurez pulmonar 3.- Estructura y desarrollo del alveolo pulmonar 4.- Biosíntesis. Etapa embrionaria. Etapa pseudoglandular. Fase canalicular. Fase de saco terminal 5.- Aceleración de la madurez pulmonar fetal Importancia de la utilización de corticoides en la vida fetal Rol de los corticoides en el desarrollo prenatal 6.- Efectos adversos de la corticoterapia antenatal. Riesgos fetales y maternos 7.- Enfermedades por insuficiencia del surfactante pulmonar: Atelectasias. Membrana hialina. Embolia pulmonar. Síndrome distress respiratorio 8.- PROSTAGLANDINAS. Síntesis. Metabolismo . Actividad farmacológica de las prostaglandinas. Accion de la prostaglandina en el proceso de parto Seminario N° 4: Hormonas en Embarazo y lactancia. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 14
  • 15. Temas que se deben considerar en el seminario: 1.- Funciones 2.- Clasificación 3.- Metabolismo 4.- Regulación hormonal Practica N° 5 “Identificación y características de los lípidos“ 5.1 Marco teórico Los lípidos son macromoléculas orgánicas que se encuentran en el organismo formando parte estructural de la membrana celular, el tejido adiposo y otras formas moleculares funcionales; así mismo, constituyen una rica fuente de reserva energética de nuestro organismo. Los lípidos se caracterizan por ser insolubles en agua, pero solubles en solvente orgánicos no polares como eter, acetona, cloroformo, benceno, etc. Quimicamente están constituidos por unidades denominadas ácidos grasos, unidos covalentemente a moléculas de alcohol. Los podemos clasificar en Lípidos simples (ésteres de ac.graso y alcohol generalmente glicerol), lípidos complejos (alcohol, ac. graso y otras moléculas como fosfato, aminas, carbohidratos y similares) y lípidos derivados como los esteroides, el colesterol, la Vit D y los ácidos biliares. 5.2 Competencias • Determina la solubilidad de los lípidos y un esquema de extracción. • Demuestra el poder emulsificador de las sales biliares. • Determina la presencia de colesterol 5.3 Materiales y equipos Baño maría Pipeta Bagueta KOH saturado Alcohol 1mL Cocinilla Pipeta Gradilla HCl concentrado Acetona 2mL Beacker 1L Pipeta Bencina HNO3 concentrado Cloroformo 5mL Tubo 17x150mm Gotero Bilis en SSF Agua destilada Pinza para tubos Tubo 13x100mm Mechero de ron 5.4 Procedimiento 1.- Solubilidad de los lípidos: Reactivo/Tubos 1 2 3 4 5 Aceite de oliva (gotas) 5 5 5 5 5 Agua (mL) 2 --- --- --- --- Cloroformo (mL) --- 2 --- --- Eter Etílico (mL) --- --- 2 --- Benceno (mL) --- --- --- 2 Alcohol (mL) --- --- --- --- 2 Al tubo N°5 (con alcohol) agregar 3mL de agua y calentar lentamente en el mechero. Anotar los resultados de solubilidad e interpretar. 2.-Extracción de los lípidos: -1ra. extracción: Coloque en un beacker aprox. 1 g de yema de huevo (10 gotas) y agregue 5mL de eter etílico, mezcle con la bagueta hasta obtener una mezcla homogénea que vertirá en un tubo y agite fuertemente, F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 15
  • 16. luego centrifugue a 4000 rpm. por 5min. Observe el resultado y anote. -2da. extracción: Separe cuidadosamente, en un tubo, el sobrenadante de la 1ra. extracción, y agregue al residuo 10mL de acetona, agite para mezclar. Observe y anote el resultado. Filtre la mezcla, lave residuo del filtro con acetona. Observe el precipitado y el filtrado final, anote los resultados en el siguiente cuadro: SUSTANCIA OBTENIDA CARACTERISTICAS 1ra. extracción Sobrenadante (con Eter) Precipitado 2da. extracción Sobrenadante (con acetona) Precipitado 3.-Identificación del Colesterol: Reacción de Lieberman-Burchard -En un tubo de ensayo colocar 1mL de sobrenadante de la 2da extracción y evaporar el solvente con sumo cuidado, en baño maría de 36-40°C. -Agregar 2mL de anhidrido acético, luego, por las paredes del tubo, 0,2mL de H2SO4 concentrado. -Observe la reacción y la aparición de un color característico. Anote los resultados. Color resultante: ..................................... Corresponde a: ......................................... 5.5 Cuestionario 1.- Fundamento de las características de solubilidad de los lípidos. 2.- Composición y función de las sales biliares. 3.- Fundamento de la Reacción de Lieberman-Burchard para la identificación de colesterol. 4.- Importancia de los lípidos en la estructuración de la membrana celular. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 16
  • 17. 5.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España nOTA: EL ALUmnO DEBERÁ ASISTIR A LA PRÁCTICA COn: hUEVOS. Practica N° 6 “Hidrólisis enzimática de los lípidos“ 6.1 Marco teórico Los lípidos son compuestos orgánicos insolubles en el agua, pero solubles en solventes orgánicos como éter, cloroformo, benceno, disulfuro de carbono entre otros; participan en la absorción de vitaminas liposolubles, síntesis de hormonas etc. Desde el punto de vista energético constituye reserva calórica como tejido adiposo, proporcionando 9 kilocalorías por gramo. En general la hidrólisis de los lípidos libera ácidos grasos de alto peso molecular y un alcohol que depende del tipo de lípido, siendo el glicerol el mas frecuente. La digestión de los lípidos se inicia en el estómago, mediante una lipasa ácido- estable que se cree que en su mayoría se origina en la parte posterior de la lengua. Sin embargo, la velocidad de hidrólisis es lenta porque los triacilgliceroles forman una fase lipídica separada con una interfase agua-lípido limitada. La verdadera hidrólisis se realiza en la primera porción del yeyuno la primera acción de la lipasa pancréatica, esta enzima es específica para esteres en la posición 1 y 3 del glicerol y prefiere ácidos grasos de cadena larga de mas de 10 átomos de carbono. La hidrólisis de triacilgliceroles por la enzima pancreática también tiene lugar en la interfase agua-lípido de las partículas de la emulsión .La lipasa llega al intestino con el jugo pancreático requiere un pH optimo 8,sin embargo, el quimo ácido que viene del estómago no se neutraliza completamente por la alcalinidad del jugo pancréatico y la bilis. El pH intestinal es 6.5 y aún así la lipasa puede ejercer su acción. Por ejemplo a falta de la enzima cuando hay obstrucción del conducto pancreático por cualquier proceso patológico las grasas de la alimentación quedan sin digerir en las heces (esteatorrea). La lipasa libera los ácidos grasos de las posiciones 1 y 3 del glicerol, pasando sucesivamente por triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos, este último con el ácido graso (en posición 2), F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 17
  • 18. sobre el no actúa la lipasa interviniendo entonces una enzima, la ISOMERASA que transforma el monoglicérido de posición 2 a 1 ó 3, haciéndolo de esta manera suceptible a la acción lenta, los productos finales de la digestión de los triglicéridos son monoglicéridos, pequeña cantidad de diglicéridos, triglicéridos, glicerol y ácidos grasos libres. Las sales biliares, en especial el glicocolato y taurocolato de sodio, contenidos en la bilis llegan al hígado por el coledoco, participan en la digestión y absorción de los lípidos. Su papel en la digestión consiste en disminuir la tensión superficial de las gotas de lípidos (de 500 000 A de diámetro) originando una emulsión, en gotas de lípidos muy pequeñas, permitiendo una mayor superficie de acción a la lipasa y aumentando paulatinamente La actividad enzimática. Terminando el proceso digestivo por acción de las sales biliares, los productos finales forman complejos de 50 A de diámetro, llamadas MICELAS, que son absorbidas. Las sales biliares se absorben en el ileon y regresan al hígado por la vena porta. Los pasos de la digestión se pueden distinguir en el esquema siguiente: HIDRÓLISIS: O O H2C – O – C – R1 R1 – CO2H LIPASA + CH2 -- OH R2 – C – O – CH O + 2 H2O R2 -- CO2 --CH + H2C – O – C – R3 CH2 -- OH R3 – CO2H Triacilglicerol 2 ácidos grasos y 1 monoacilglicerol R = cadena hidrocarbonada En la hidrólisis pueden distinguirse al menos cinco fases diferentes: -Hidrólisis de triacilgliceroles a ácidos grasos libres y monogliceroles -Solubilización de los ácidos grasos libres y monogliceroles por detergentes (ácidos biliares ) y transporte desde la luz intestinal hacia a la superficie celular. -Captación de ácidos grasos libres y mono gliceroles al interior de la célula y resíntesis a triacilgliceroles. -Empaquetamiento de los triacilgliceroles recién sintetizados en glóbulos lipídicos especiales denominados quilomicrones. -Exocitósis de los quilomicrones desde las células y liberación a la linfa. 6.2 Competencias • Mide la actividad de la lipasa pancreática por titulación con una base. • Determina el efecto de las sales biliares sobre la digestión de los lípidos. 6.3 Materiales y equipos Tubos 17x150mm Bagueta Buffer fosfato pH 8 Gradilla Baño maría Bilis en Buffer pH 8 Pipeta 1mL Aceite de oliva KOH 0.1N Pipeta 5mL Fenolftaleina Sol. Pancreatina 2% Pipeta 10mL Agua destilada Hidrólisis del aceite por acción de la lipasa Fundamento: Se ha demostrado que los aceites no hidrolizables difícilmente se absorben en cantidades apreciables. Sin embargo, cuando el aceite está en forma de emulsión muy fina, puede ser absorbido a nivel intestinal en pequeña proporción. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 18
  • 19. Para que esto ocurra es necesario la presencia de las sales biliares (bilis) que van a producir la emulsión de las grasas y de esa manera facilitar su absorción y la acción enzimática de la lipasa pancreática sobre las grasas hasta el desdoblamiento en ácidos grasos y glicerol. En todo este proceso interviene el pH óptimo de 8.00. En el laboratorio su demostración se puede llevar a cabo empleando una enzima pancreática (sintética, solución de pancreatina) en lugar de la lipasa pancreática, la cual para poder ser aislada necesita un proceso laborioso, también debido a su inestabilidad. 6.4 Procedimiento Disponer una serie de 3 tubos de ensayo y proceder de la siguiente manera Reactivo / Tubos Nº 1 2 3 Aceite de oliva neutralizado mL 1 1 -- Buffer pH 8. 0 mL - 2 2 Sales biliares en buffer pH8 mL 2 -- 2 Agua destilada mL 2 2 1 Antes de agregar la solución de pancreatinina, debemos estar seguros de que no haya acidez libre en el medio que estamos preparando, para lo cual debemos emulsionar bien cada tubo y si el color rosado del indicador (fenolftaleína) no se mantiene, nos indica acidez en el medio de proceso; se añade unas gotas de KOH 0.1N, cuidando del exceso. Solución de pancreatina mL 5 5 5 Agitar y deje incubando durante 20 minutos a 37º C. Durante este tiempo la enzima libera los ácidos grasos del aceite que acidifican el medio, esto hace virar al indicador hacia la zona ácida. En el tubo que no contiene sales liberadas, la reacción habrá sido más lenta que la del primer tubo, y en el que no contiene aceite de pepita no habrá ninguna acidez. 6.5 Cuestionario 1.- Cual es el origen de la pancreatina empleada en la práctica. 2.- Cuantos tipos de Lipasa existen. 3.- Importancia clínica, tipos y composición de la bilis. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 19
  • 20. 6.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España Practica N° 7 “Identificación de proteínas, determinación de proteínas totales y fraccionadas“ 7.1 Marco teórico Las proteínas son macromoléculas compuestas de cadenas de aminoácidos. Todos los aminoácidos tienen la misma estructura básica, conformada por un carbono central α unido a un grupo amino (-NH2), un grupo carboxilo (-COOH), un hidrógeno y un radical variable (-R) que da la diferencia entre uno y otro aminoácido, confiriéndoles propiedades distintivas. Se define como Aminoácido a aquella molécula con grupo amino y grupo carboxilo que proviene de la hidrólisis de las proteínas, según ello se han identificado 20 aminoácidos los cuales difieren en sus propiedades fisicoquímicas, a tal punto que la secuencia exacta de ellos determina, la función, la solubilidad o no en agua, su función catalítica como enzima, su función reguladora como hormona o estructural. En algunos casos variaciones en un solo aminoácido ocasiona que una proteína pierda su función. Las proteínas presentan diferentes funciones muy importantes en los procesos biológicos, actúan como elementos estructurales, biocatalizadores, coagulación sanguínea, anticuerpos, hormonas, receptores hormonales y también como nutrientes de primer orden en la dieta y alimentación del humano. PROTEINAS SERICAS: El plasma sanguíneo es una solución coloidal con gran contenido de proteínas, aprox 7-7,5 g/dL. Al conjunto de proteínas del plasma se les denomina proteínas totales plasmáticas. Albúmina.- Las albúminas constituyen mas de la mitad del total de proteínas del organismo, debido a ello se les pueden considerar como una importante reserva proteica del organismo. Se caracterizan por su gran estabilidad, solubilidad en agua y soluciones salinas, bajo peso molecular siendo el mayor contribuyente en el mantenimiento de la presión osmótica coloidal intravascular. Es sintetizada por el hígado, se encarga de fijar y transportar numerosas sustancias que son insolubles en medios acuosos tales como los ácidos grasos, hormonas esteroidales, bilirrubina, catecolaminas ,etc. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 20
  • 21. Globulinas.- Son proteínas plasmáticas complejas, muy heterogéneas, de alto peso molecular, son insolubles en agua pero solubles en soluciones salinas, constituyen las proteínas conjugadas (glicoproteínas y lipoproteínas). Fibrinógeno.- Se sintetiza en el hígado y constituye la fase preliminar de la fibrina que interviene en el proceso de coagulación sanguínea, su concentración media es de 0.3g/dL. Variaciones en los Niveles de las Proteínas Séricas -Hiperproteinemia.- Se presenta en la deficiencia relativa de agua. Se trata de cambios en la concentración y no indica que haya alteración de la cantidad absoluta de proteínas, se aprecia en casos de deshidratación, en ciertas enfermedades crónicas: procesos inflamatorios crónicos, cirrosis hepática, etc. -Hipoproteinemia.- Se presenta en un exceso relativo de agua. Se trata de cambios en la concentración y no indica alteración de la cantidad absoluta de proteínas. Pérdida excesiva de proteínas, principalmente albúmina, a través del riñón en el síndrome nefrótico, por la piel en quemaduras graves, y por el intestino en enteropatías. Disminución de la síntesis proteica por deficiencia proteica grave en la dieta, hepatopatía grave o malabsorción. A niveles <4 g/dl, es frecuente la aparición de edemas. -Hiperalbuminemia.- Es el aumento anormal de albúmina y se presenta generalmente, en casos de deshidratación. -Hipoalbuminemia.- Es la disminución anormal de albúmina lo cual genera trastornos en la distribución de los líquidos orgánicos con formación de edema, acompañados de hipocalcemia (debido a su unión con el calcio plasmático), presentándose en cuadros de infección crónica, insuficiencia hepática, hemorragias y síndrome nefrótico. -Hiperglobulinemias.- Aumento anormal de globulinas, se presenta en daño hístico activo, como en procesos inflamatorios, procesos malignos, después de traumatismos, etc. -Hipoglobulinemias.- Es la disminución de globulinas presentándose en diversos cuadros dependiendo del tipo de globulina involucrada. Las α-globulinas, están disminuidas particularmente en casos de enfisema pulmonar y aumentadas en las reacciones inflamatorias. Las γ-globulinas, están disminuidas en casos de pérdida renal como en el síndrome nefrótico, disminución de su síntesis, deficiencias inmunitarias, edad avanzada, etc, encontrándose aumentadas generalmente en procesos inflamatorios crónicos y en algunas enfermedades autoinmunitarias. TERMINOLOGIA CLINICA : Proteinograma: Gráfico que representa cada una de las concentraciones proteicas en los distintos líquidos del organismo. Proteinemia: Concentración de las proteínas en la sangre. Proteinosis: Acumulación de proteínas en los tejidos. Proteinuria : Presencia de proteína en orina. Proteinuria falsa: Proteína extraña a la de la orina por contaminación, ejemplos: leucorrea vaginal, menstruación, semen, secreciones perianales o rectales, etc. Para evitar se recomienda recoger orina por cateterismo. 7.2 Competencias • Determina la presencia cualitativa de las proteínas en diferentes muestras. • Determina la concentración de proteínas totales y fraccionadas (albúmina y globulina) en suero. 7.3 Materiales y equipos Tubo 13x100mm Pipeta 1mL Centrífuga Rvo. Biuret Espectrofotómetro Pipeta 2mL Baño maría Rvo. Proti 2 Winer Prot.Tot Alcohol Pipeta 5mL Espatula Rvo. Proti 2 Winer albúmina Tips amarillos Gotero Bagueta Estándar Prot Totales y Albumina F-CV3-3B-2 venoject 21Gx 1” Aguja Gradilla Mortero Piceta Micropipeta 10-100uL Ligadura Algodón Rev. Junio 2007 21
  • 22. Método para la determinación de proteínas totales: Fundamento: Las proteínas en medio alcalino y en presencia de sulfato de cobre forman un complejo de color violeta, debido a que el ión cobre forma un complejo tetra coordinado con el nitrógeno del enlace peptídico C C H--N N--H R—H--C C—H--R Cu ++ C C H--N N--H Método para la determinación de Albúmina Fundamento: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la Bromo Cresosulfon Ftaleína (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a un pH 3.8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivos, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. 7.4 Procedimiento DETERMINACIONDE PROTEÍNAS EN MUESTRAS DE ALIMENTOS Colocar cada muestra en tubos de ensayo (si son alimentos líquidos) o en lunas de reloj (si son alimentos sólidos) y agregar 2 mL de Rvo de Biuret. El color violeta indicará la presencia de proteína y el mantenimiento del color celeste la ausencia. De requerirlo, un alimentos sólido (cereales, granos, otros) puede ser triturado en el mortero previo a la reacción. DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES Tomar una muestra de sangre (aprox. 3 mL), centrifugar a 3,000 rpm por 10 minutos. Separar el suero. Colocar en tres tubos de acuerdo al esquema siguiente: Rvo. / TUBOS BLANCO ESTANDARD MUESTRA Agua destilada 50 uL - - Estándar Prot. Tot. - 50 uL - Muestra (suero) - - 50 uL Rctv.EDTA/ Cu 3.5 mL 3.5mL 3.5 mL Mezclar e Incubar durante 15 minutos a 370C. Leer en espectrofotómetro a 540 nm llevando a cero con el tubo blanco. Estabilidad de la mezcla de reacción Final: El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso. DETERMINACION DE ALBUMINAS Colocar en tres tubos lo siguiente: Rvo. / TUBOS BLANCO ESTANDARD MUESTRA Estándar Albúminas - 10 uL - Muestra (suero) - - 10 uL Reactivo BCF 3.5 mL 3.5 mL 3.5 mL F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 22
  • 23. Mezclar y mantener los tubos entre 15 y 28º C durante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro a 625 nm llevando a cero con el blanco de reactivo. Estabilidad de la mezcla de reacción final: El color de la reacción es estable 20 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS: Proteínas Totales (g/dL) = Abs. Muestra x f f=[Std.P.T.g/dL] Abs Std Albúmina (g/dL) = Abs. Muestra x f f=[Std. Alb. g/dL] Abs. Std. Globulinas (g/dL) = [Proteínas Totales] - [Albúmina] Relación A/G = [Albúmina g/dL] [Prot. Tot. g/dL] - [Alb. g/dL] VALORES DE REFERENCIA: Proteínas totales: 6,1 a 7,9 g/dL Albúmina: 3,5 a 4,8 g/dL Globulinas: 2,0 a 3.6 g/dL Relación A / G: 1–2 7.5 Cuestionario 1.-Mencione usted las características moleculares de: Caseína, ovoalbúmina, suero de leche, gelatina, insulina, glutatión. 2.- Tratamientos contra las quemaduras empleando colágeno. 3.- Explique usted los cuadros de hipoproteinemia por pérdida renal. 7.6 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 23
  • 24. 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España NOTA: El alumno deberá asistir a la práctica con lo siguiente: Huevos, leche, yogurt, carne cruda, carne cosida, soya, quínua. Practica N° 9 “Determinación de Colesterol” 9.1 Marco teórico El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis y tejido cerebral. Es precursor de los ácidos biliares, esteroides, y vitamina D. Su determinación contribuye al diagnóstico y clasificación de las dislipidemias. 9.2 Competencias • Determina la concentración de Colesterol en suero • Relaciona la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico 9.3 Fundamentos del metodo El colesterol se determina por acción de las enzimas Colesterol ester hidrolasa y Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los ésteres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre produciéndose peróxido de hidrógeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe a 505 nm. Colesterol ester CEH Colesterol + ácidos grasos Colesterol + O2 CHOD Colest-4-en-3-ona + H2O2 2H2O2 + 4-AAP +p-HBA PAP Comp. Coloreado + 4H2O 9.4 Reactivos y Equipos Conservado entre 2° y 8° C. y protegido de la luz, estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El reactivo con el tiempo puede tomar un leve color rosado que no afecta los resultados. Descartar el reactivo si la absorbancia contra blanco de agua es superior a 0.4 D.O. a 505 nm. Preparación: El reactivo se provee listo para su uso. Composición del reactivo enzimático: Buffer fosfato pH 7.2 100 mM F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 24
  • 25. Colesterol ester hidrolasa >150 U/l Colesterol oxidasa (recombinante) >100 U/l Peroxidasa >1000 U/l 4-Aminoantipirina 0.4 mM Acido p-hidroxibenzoico 10 mM Azida sódica 0.1 g/dl Estabilizantes y preservantes no reactivos c.s. Solución standard: Colesterol en solución acuosa estabilizada 200 mg/dl Espectrofotómetro o fotocolorímetro de filtros capaz de medir absorbancia a 505 nm. (rango 500 - 550 nm.) Baño Maria Pipetas MUESTRAS Utilizar de preferencia suero o plasma (Heparina o EDTA) libre de hemólisis. La muestra debe tomarse con el paciente en ayunas. Los tubos y material de vidrio deben estar limpios y libres de residuos de detergentes. El colesterol es estable 7 días a temperatura ambiente, y 6 meses en congelador. 9.5 Procedimiento Llevar el reactivo a la temperatura que se realizará el ensayo. Las pipetas a utilizar deben estar limpias y libres de residuos para no contaminar el reactivo. Blanco Standard Muestra Muestra (ml) -- -- 0.01 Standard (ml) -- 0.01 -- Reactivo (ml) 1.00 1.00 1.00 Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C. ó 10 minutos a temperatura ambiente (>20°C.). Leer las absorbancias llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por a lo menos treinta minutos. 9.6 Calculos FACTOR = 200 Absorbancia Standard Colesterol (mg/dl)= Factor x Abs. Muestra RANGO DE REFERENCIA 140 a 200 mg/dl “Determinación de Acido Úrico en suero “ 9.7 Marco teórico Los nucleótidos de una célula se estan renovando continuamente. Los nucleotidos se degradan por hidrólisis a nucleósidos, por medio de las F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 25
  • 26. nucleotidasas. Las nucleósidos fosforilasas catalizan la ruptura fosforolítica de los nucleósidos para originar bases libres y ribosa -1-fosfato. Esta base libre proviene de una base nitrogenada de tipo purínica A pH fisiológico, el ácido úrico pierde un protón dando lugar a urato. En los seres humanos, el urato es el producto final de la degradación de las purinas y se excreta en la orina. Niveles elevados de urato en el suero provocan la gota, una enfermedad en la que las sales de urato forman cristales que deterioran las articulaciones y los riñones. En algunos casos se utiliza el alopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa para tratar la gota. También existen otros desórdenes que transcurren acompañados de hiperuricemia, tales como leucemia, policitemia, mieloma múltiple, intoxicación plúmbica, incluyendo alteraciones medicamentosas en los tratamientos con citostáticos o con tiazidas. Mientras que otros medicamentos (drogas uricosúricas tales como salicilatos y la fenilbutazona) aumentan la excreción del ácido úrico, disminuyendo los niveles séricos del mismo 9.8 Competencias • Determina la concentración de ácido úrico en suero • Relaciona la importancia de los niveles elevados con un trastorno metabólico 9.9 Materiales y equipos Micropipeta 10 a 200 ul Tips amarillo Pipetas 5 mL Suero Gradilla Estándar de ácido urico 10 mL x grupo Tubos 3 x mesa Rvo Enzimático de acido úrico 10 mL x grupo Espectrofotométro Baño María 9.10 Fundamento del método El ácido úrico es oxidado por la enzima específica uricasa, generándose alantoína y H2O2, el cual en una reacción mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac.3 dimetiaminobenzoico y 4 – AAP produciéndose un compuesto coloreado con un máximo de absorción a 555 nm., en cantidad proporcional a la cantidad de ácido úrico presente en la muestra. Acido Úrico uricasa Alantoína + H2O2 H2O2 + DMAB + 4- AAP POD H2O + Complejo coloreado 9.11 Procedimiento BLANCO STANDARD MUESTRA Muestra (ml) --- --- 0, 025 Standard (ml) --- 0, 025 --- Reactivo (ml) 1,00 1, 00 1, 00 Mezclar e incubar 10 minutos a 37º C, o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a 25ºC). Leer a una longitud de onda óptima 555 nm. Llevar a cero con agua destilada el espectrofotómetro Anote la absorbancia de la muestra:……………. La fórmula matemática a usar es el factor de calibración FACTOR = 10 mg/mL Absorbancia Estándar ACIDO ÚRICO (mg/dL.) = FACTOR X ABSORBANCIA DESCONOCIDO F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 26
  • 27. VALORES DE REFERENCIA: En Suero: Hombres.................. 3, 4 a 7, 0 mg/dl. Mujeres...................... 2, 4 a 5, 7 mg/dl. 9.12 Cuestionario 1.- ¿Cuáles son los otros factores de riesgo de padecer enfermedades cardíacas y vasculares, Además del exceso de colesterol? 2.- ¿Qué tipos de colesterol hay, haga un breve resumen de cada uno? 3.- ¿Cómo afecta a los niños el colesterol, y cuál es el nivel de colesterol recomendable en la infancia? 4.- Desarrolle el esquema metabólico de la formación del ácido úrico? 5.- Señale que otras muestras biológicas podemos usar para determinar ácido úrico? 9.13 Fuentes de información 1. BAZÁN VARGAS,NEYDA ARMINDA. Situación alimentaria y nutricional en el Perú desde 1970 hasta la actualidad. Monografía. 2005. Lima 2. DEVLIN,T.M. Bioquímica, Libro de texto con aplicaciones Clínicas. 5ta edición. 2008 Ed. Reverté. Barcelona 3. DOMINICZACK ,MAREK H. - BAYNES ,JOHN W Bioquímica Médica 2a ed. 2008 Barcelona (España) 4. GONZALES DE B. y Otros. Bioquímica Clínica.2da Edición.2002. Mac Graw-Hill Interamericana. Madrid 5. HUAMAN DIAZ, ROXANA alteraciones nutricionales durante el embarazo. monografía. 2004 lima 6. ARANCETA BATRINA,JAVIER - SERRA MAJEM,LLUÍS Nutrición y Salud Pública 2da edición. 2006. Barcelona (España) 7. ISLACHE, KAREN JACQUELIN Malnutrición Y Embarazo. Complicaciones Materno-Fetales. Monografía.2003. Perú. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 27
  • 28. 8. LAGUNA JOSE Bioquímica de laguna.6ta edición 2009 .México 9. LEHNINGER, A. Bioquímica. Las bases moleculares. 5ta edición. 2009. Ed.Omega. Barcelona. 10. LEVANO, MARITA MERCEDES Nutrición Durante El Embarazo. Monografía. 2003. Perú 11. LOZANO y Col. Bioquímica y Biología Molecular para Ciencias de la Salud. 2da.Edic. 2003. Edit. McGraw-Hill – Interamericana. España. 12. MARTINEZ MONZO, JAVIER. Nutrición y Dietética 1era edición. 2003 Madrid 13. MURRAY y Col Harper Bioquímica Ilustrada.16va. Edición 2005 Ed. Manual Moderno. México 14.- STRYER , L. Bioquímica.6ta Edición. 2008 Edit. Reverte. España Practica N° 10 “Actividad enzimática y factores que la afectan“ 10.1 Marco teórico Las Enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químico-biológicas acelerando la velocidad de dichas reacciones hasta su punto de equilibrio. Los substratos son las moléculas sobre las que actúan las enzimas. En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes substratos en tanto permanece fija la concentración de la enzima. La Actividad Enzimática se puede expresar como: a.- La DESAPARICION del SUBSTRATO. E + S E + b.- La APARICION del PRODUCTO P c.- Por la MODIFICACION de COFACTORES Factores que Modifican la Actividad Enzimática Donde: C C´ Son diversos: E = Enzima 1.- pH del medio S = Substrato 2.- Temperatura P = Producto 3.- Concentración de Enzima 4.- Concentración de Substrato C = Cofactor antes de la reacción 5.- Acción de Inhibidores y Activadores 10.2 Competencias • Comprueba la acción de los factores que regulan la actividad enzimática • Demuestra como la actividad enzimática puede ser expresada. 10.3 Materiales y equipos Tubos 17x150mm Pipeta 1mL Indicador de pH Solución Salina 1-14 Fisiológica Potenciómetro Pipeta 5mL Estandar de pH 4 Albúmina de huevo en SSF Baño maría Pipeta 10mL Estandar de pH 7 Pepsina en SSF Hielo Bagueta Estandar de pH 10 Agua destilada Beacker 500mL Gradillas Portacubetas NaCO3 10% Espectrofotómetr HCl 1N o Para nuestros experimentos estudiaremos el efecto de la PEPSINA sobre la ALBUMINA. La PEPSINA es una enzima que hidroliza cadenas grandes de proteínas convirtiéndolas en cadenas pequeñas. La ACTIVIDAD ENZIMATICA se demostrará por desaparición del substrato, o sea la disminución de la turbidez de una solución de Albúmina de huevo sobre la cual actuará la enzima. La turbidez se leerá en el ESPECTROFOTOMETRO. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 28
  • 29. 10.4 Procedimiento Experiencia Nº1 EFECTO DEL PH Principios Teóricos.- Si actúa una enzima sobre un Efectos del pH sobre la Actividad substrato n cantidades equimoleculares (iguales) Enzimática. variando el pH del medio de reacción, se observará que existe una región o punto de actividad óptima, A E pH óptimo correspondiendo al pH, al cual se denomina pH c n 1 OPTIMO, que varía con la pureza de la enzima, el t z tipo de sustancia sobre el cual actúa, las sales del medio, etc. Ello debido a la interacción E–S (Enzima i i –Substrato) que se realiza, en gran parte, a través de v m los grupos ionizados existentes en sus moléculas. La i á concentración de iones (H+) u Oxhidrilos (OH-) d t presentes en el medio, alteran los grupos ionizados a i e impiden la asociación de las moléculas. d c Procedimiento Experimental: a Preparar 6 tubos de acuerdo al esquema siguiente: 0 Tubo Nº 1 2 3 4 5 BAJO pH 6 H2O dest. (mL) --- 1,5 2 1,5 --- --- HCl 1N (mL) 2,0 0,5 --- --- --- Na2CO3 10%(mL) --- --- --- 0,5 2,0 --- Albúmina (mL) 5 5 5 5 5 --- Pepsina (mL) --- --- --- --- --- 20 pH del tubo 1.0 2 6.0 10 11.0 --- Incubar por 5 min los 6 tubos en Baño maría a 37ºC. Añadir 3 mL de la pepsina pre-incubada (tubo 6), a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5, y mezclar bien. Volver a incubar los tubos 1 al 5 por 5 min en baño maría a 37ºC. Leer la absorbancia de los tubos del 1-5 al espectrofotómetro a una longitud de onda de 440nm, usando un blanco de agua destilada. La lectura debe realizarse tan pronto sale de la incubación, de no ser así, mantener los tubos en agua helada hasta el momento de la lectura. CALCULOS: Para obtener la actividad enzimática se debe restar la mayor absorbancia obtenida menos la absorbancia de cada tubo. Graficar los resultados, en un papel milimetrado, colocando el pH en las abcisas y la actividad enzimática en las ordenadas. RESULTADOS: Encontrar el pH óptimo de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA Experiencia Nº2 EFECTO DE LA TEMPERATURA Efectos de la Temperatura sobre la Principios Teóricos.- La temperatura acelera la velocidad Actividad Enzimática. de las reacciones al aumentar las colisiones efectivas entre A E Temperatura los elementos reaccionantes. En una reacción enzimática también deben colisionar E-S óptima (Enzima-Sustrato) para que la reacción progrese, por c n 1 tanto, las reacciones enzimáticas serán más rápidas a t z mayores temperaturas, sin embargo y dada la naturaleza i i proteica de las enzimas, la temperatura no puede v m aumentarse indefinidamente, pues comenzarán a romperse los puentes de hidrógeno, alterándose las i á estructuras secundarias, situación que se conoce como d t DESNATURALIZACION (Ver esquema). a i d c Procedimiento Experimental: 1º Preparar dos series de 5 tubos cada una, de acuerdo al esquema siguiente: Reactivo / Tubo N° CONTROL 1 2 3 4 5 H2O dest. (mL) 3,0 3,5 3,5 3,5 3,5 --- F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 29
  • 30. HCl 1N (mL) --- 0,5 0,5 0,5 0,5 --- Albúmina (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 --- Pepsina (mL) --- --- --- --- --- 11 Incubar por 5 min a 37°C en baño maría Agregar 2 mL de la pepsina pre incubada (Tubo 5) a cada uno de los tubos del 1 al 4 e inmediatamente incubar por 5min según el esquema siguiente: Tubo 1 2 3 4 Temperatura °C 0 (hielo) 25(Ambiente) 37 100 (ebullición) Al finalizar el tiempo, colocar inmediatamente los tubos en agua helada para detener la reacción, hasta el momento de su lectura. Leer al espectrofotómetro los tubos 1-4 y el control, usando un blanco con agua destilada. CALCULOS: La actividad enzimática se encontrará restando la lectura de cada tubo (1-4) de la lectura del tubo CONTROL (SIN INCUBAR). Graficar los resultados en un papel milimetrado, colocando la temperatura en las abscisas y la actividad enzimática en las ordenadas. RESULTADOS: Encontrar la T° óptima de acción la PEPSINA sobre la ALBUMINA 10.5 Cuestionario 1.- Explique el mecanismo de acción de la las enzimas 2.- Escriba la reacción que cataliza la pepsina. 3.- Con los datos de la práctica elabore las gráficas de pH vs Actividad y T° vs Actividad, y explique en función a la bibliografía recomendada. 4.- A que llamamos especificidad por el sustrato? 5.- Uso del dosaje de enzimas para el diagnóstico clínico, de ejemplos. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 30