3. Introduction
La Biotechnologies végétales:
Développement et utilisation de
techniques de cultures in vitro dans
différents domaines relatifs au végétal et
à l’amélioration variétale.
4. Introduction
Les domaines abordés de la
biotechnologie végétale: Ensemble des
pratiques faisant appel aux cultures in
vitro de plantes et aux techniques de
biologie moléculaire dans les domaines
de l’agronomie, l’industrie et la recherche
fondamentale.
5. A Suivre…
Totipotence de la cellule végétale
Etapes callogenèse
Techniques de culture in vitro de
Balance hormonal et minérale
6. Totipotence
Chez les plantes, la totipotence peut se
définir comme la propriété qu’ont
certaines cellules de pouvoir régénérer un
individu lorsqu’elles sont placées dans des
conditions appropriées, en passant
éventuellement par une étape de
dédifférenciation.
7. Pourquoi les cellules végétales
sont totipotentes ???
Petit nombre de types cellulaires.
Seulement 3 ou 4 types d’organes fondamentaux
(racine, tige, feuilles) dont les fleurs, vrilles, épines, fruits et
tubercules sont des dérivés.
Grande plasticité génomique: la croissance peut
rester presque normale malgré de profonds
remaniements chromosomiques.
29. Une hormone :est une molécule synthétisée par un
organisme et qui, à très faible concentration, va avoir
une action sur le développement de certains tissus de
cet organisme.
les phytohormone: sont des Produits de types divers,
d’origine synthétique ou végétale (naturelle),qui
peuvent circuler plus ou moins loin selon le cas ,
susceptibles d’exercer une action physiologique sur le
végétal dont ils vont agir sur des cellules cibles
possédants les récepteurs qui leurs correspondants
30. ils peuvent agir :
o sur la dimension des cellules : accélération de la
germination des graines, augmentation de croissance,
réduction de croissance.
o sur la multiplication des cellules : inhibition de la
germination, bouturage, mise à fleur.
o modification du métabolisme : augmentation de la
précocité, de la productivité, effets divers.
32. •La synthèse de l'auxine s'effectue dans les apex méristématiques des
tiges, et dans les jeunes feuilles des bourgeons terminaux.
•Le transport de l'auxine s'effectue de façon polarisée, de l'apex vers
la base dans la tige par la sève
1)l’auxine
1.1)Mode de production des auxines
Site de production:
bourgeon apical
Diffusion des
hormones
•dominance apicale
• stimulation de la
rhizogenèse
-
33. 1.2 ) role de l’auxine
Elle inhibe les bourgeons qu’elle rencontre. ( dominance apicale )
Elle stimule la croissance primaire ( en longueur des cellules de la
tige).
Elle stimule la croissance secondaire ( en épaisseur ) en provoquant
la division des cellules du cambium et en influençant sur la
différenciation du xylème secondaire.
Lorsque la plantule est jeune, la concentration en auxine arrivant
aux niveau de l’apex racinaire est forte et elle stimule la
rhyzogénèse .
Puis en grandissant, la distance entre les bourgeons terminaux et les
racines augmente; La concentration en auxine diminue. Elle stimule
alors l’élongation des cellules au niveau de la racine.
elles inhibent l'abscission (chute) des feuilles et des fruits.
L'auxine induit également le phototropisme d'un végétal
34. L’auxine synthétisée par les graines en
développement favorise la maturation du fruit.
36. Applications en culture in vitro
A partir d’un vitro plant
On coupe un fragment de tige
d’environ 1,5 cm portant 2 feuilles.
Les feuilles sont enlevées en
prenant soin de laisser intact les
bourgeons axillaires.
On réalise 3 milieux de cultures
différents :
Milieu de culture Résultats
Milieu MS ½
Sans auxine
Pas d’enracinement
Milieu MS ½
Avec auxine 0,5 μmol.L-1
Formation de racine
Photo A
Milieu MS ½
Avec auxine 2 μmol.L-1
Formation d’un cal
Photo B
Photo A
Photo
B
37. 2) Cytokine
Synthèse dans les racines puis migrent
dans la plante via la sève brute (xylème)
2.1)Mode de production des cytokinines
Site de production:
Racines
Transport vers les
sites d ’action :
- levée de dominance
apicale
- débourrement des
bourgeons axillaires
38. 1.2 ) role de l’auxine
Elle inhibe les bourgeons qu’elle rencontre. ( dominance apicale )
Elle stimule la croissance primaire ( en longueur des cellules de la
tige).
Elle stimule la croissance secondaire ( en épaisseur ) en provoquant
la division des cellules du cambium et en influençant sur la
différenciation du xylème secondaire.
Lorsque la plantule est jeune, la concentration en auxine arrivant
aux niveau de l’apex racinaire est forte et elle stimule la
rhyzogénèse .
Puis en grandissant, la distance entre les bourgeons terminaux et les
racines augmente; La concentration en auxine diminue. Elle stimule
alors l’élongation des cellules au niveau de la racine.
elles inhibent l'abscission (chute) des feuilles et des fruits.
L'auxine induit également le phototropisme d'un végétal
39. L’auxine synthétisée par les graines en
développement favorise la maturation du fruit.
41. les effets de l’auxine dans la plante en
fonction de sa concentration
Elle stimule la rizhogénèse
à forte concentration
Elle stimule la
différenciation de
bourgeon à très faible
concentration
A forte concentration,
elle inhibe le
développement des
bourgeons = inhibition
apicale.
Elle inhibe la chute
des feuilles et des
fruits
Elle active la
formation de la chaire
des fruits
Elle active l’élongation
des racines mais à très
faible concentration.
42. Applications en culture in vitro
A partir d’un vitro plant
On coupe un fragment de tige
d’environ 1,5 cm portant 2 feuilles.
Les feuilles sont enlevées en
prenant soin de laisser intact les
bourgeons axillaires.On réalise 3 milieux de cultures
différents :
Milieu de culture Résultats
Milieu MS ½
Sans auxine
Pas d’enracinement
Milieu MS ½
Avec auxine 0,5 μmol.L-1
Formation de racine
Photo A
Milieu MS ½
Avec auxine 2 μmol.L-1
Formation d’un cal
Photo B
Photo A
Photo
B
43. 2) Cytokine
Synthèse dans les racines puis migrent
dans la plante via la sève brute (xylème)
2.1)Mode de production des cytokinines
Site de production:
Racines
Transport vers les
sites d ’action :
- levée de dominance
apicale
- débourrement des
bourgeons axillaires
44. 2.2) rôle de cytokinines
Stimule l’élongation cellulaire et l’organogenèse
Les cytokinines en présence d'auxine stimulent la
division cellulaire, leur rôle précis portant sur la
duplication des chromosomes et le
recloisonnement cellulaire.
Elles favorisent l'extension radiale des tiges et des
racines.
Elles activent la production de chlorophylle
Expérience réalisée sur un morceau de parenchyme prélevé dans une tige
Culture sans aucun ajout d’hormone Les cellules deviennent très grosses
mais ne se divisent pas
+ cytokinines Pas d’effet
+ cytokinines + auxines Les cellules se divisent
45. Régulation de la dominance apicale :
L’auxine est fabriquée au niveau des
bourgeons terminaux
Les cytokinines sont fabriquées
au niveau de la racine
• Dans la tige, L’auxine
inhibe le développement
des bourgeons axillaires.
• Mais les cytokines
bloquent l’effet de l’auxine
qui arrive vers le bas.
• Les rameaux du bas se
développent en premier…
Et descend par le
phloème
Et remonte par le
xylème
• Dans la racine, Les
cytokinines inhibent la
formation de racines
secondaires,
• Mais l’auxine
bloquent l’effet des
cytokines.
• Les racines
secondaires les plus
46. 3)Gibberllienes
Les sites de synthèse des gibbérellines sont les jeunes
feuilles, les fruits, les graines, les apex des tiges et des
racines
Elles ont une influence sur la levée ou interruption de la
dormance.
elles interviennent sur l'initiation de la floraison et le
débourrement des bourgeons.
Elles stimulent l’élongation des tiges et des limbes des
feuilles. Stimulation ainsi stimule la croissance internodale
Elle stimule la germination des graines.
Elle stimule la maturation des fruits.
Inhibition de la croissance racinaire à la lumière et
Favorise au contraire la croissance racinaire à l’obscurité
47. BALANCE HORMONALE
Les auxines et les cytokinines sont les plus
importantes, elles assurent le
grandissement et l’activité mitotique;
dont le rapport auxines / cytokinines
détermine le devenir des tissus en culture
50. -Pour se développer et fructifier, une plante a besoin d'eau, de
lumière et d'éléments nutritifs.
- Elle fabrique sa matière organique à partir de sels minéraux, d'eau
et de gaz carbonique (CO2) en exploitant l'énergie solaire : c'est le
phénomène de la photosynthèse.
- Elle puise dans le sol les éléments minéraux et l'eau, nécessaires à
sa croissance. Les principaux éléments nutritifs dont elle a besoin
pour sa croissance sont l'azote, le phosphore et la potassium,
désignés respectivement par leurs symboles chimiques : N, P, K.
Il y a des éléments minéraux qui constituent environ 1% de la
matière sèche de la plante comme le manganèse (Mn), fer (Fe),
cuivre (Cu) … ; sont les microéléments ou oligoéléments
51. L’azote (N):
L’azote (N) est l'engrais de la croissance :
il participe au développement du
feuillage et des parties aériennes des
plantes. Si les plantes manquent d’azote,
elles sont lentes à se développer, leur
feuillage est vert clair ou jaunâtre.
52. Le phosphore (P):
Le phosphore (P) stimule le
développement des racines, la floraison
et la fructification. Si les plantes manquent
de phosphore, leur feuillage est foncé,
rouge ou marqué de taches rouges, la
floraison est peu abondante et la
maturation des fruits est longue.
53. Le Potassium (k):
Le potassium (K) est utile à la circulation de la sève
et à l’assimilation des éléments nutritifs par les
plantes. Il améliore leur résistance au gel, aux
ravageurs et maladies, ainsi que la couleur et la
qualité gustative des fruits.
54.
55. Genre Fragaria
Nombre d’espèces Une cinquantaine
Ploïdie diploïde, tétraploïde,
hexaploïde et
Octoploïde
Nombre
chromosomique de
base
7 chromosomes
Espèce Fragaria X ananassa Duch
Ploïdie octoploïde (2n =8x =
56)
issu d’un hybride spontané entre deux espèces
octoploïdes
originaires d’Amérique : Fragaria chiloensis Duch.
et F. virginiana L
56. Culture in vitro
La technique in vitro est un mode de
multiplication végétative artificielle des
plantes.
Il s’agit d’un ensemble de méthodes
faisant intervenir d'une part l'asepsie
(stérilisation du matériel, désinfection des
explants)
57. d'autre part des conditions de culture parfaitement
contrôlées (milieux de culture définis pour chaque
type de plante, température, lumière, humidité,...)
58.
59. Milieu Knop: Milieu MS:
La solution de Knop (ou
liquide de Knop) a été
inventée par le chimiste
allemand wilhelm Knop
(1817-1891).
Utilisé plus particulièrement
dans la culture des plantes
à chlorophylle.
Il existe différentes types.
Ces différentes solutions ne
possèdent pas de source de
carbone. Elles permettent
d'expérimenter les
exigences des plantes en
faveur de tel ou tel élément
non carbonaté
Le milieu de Murashige
et Skoog (ou Milieu MS
ou MSO).
inventé par les
physiologistes
végétalistes Toshio
murashige et Folke K
Skoog.
utilisé dans les
laboratoires de biologie
végétale pour la culture
de cellules ou de tissus
de plantes.
60.
61. Liquide de Knop complet:
1 g de nitrate de calcium
0,25 g de nitrate de potassium
0,25 g de sulfate de magnésium
0,25 g de phosphate monopotassique ou
dihydrogénophosphate
0,05 g de sulfate ferrique
1000ml d'eau distillée
62. Liquide de Knop sans phosphate:
1 g de nitrate de calcium
0,5 g de nitrate de potassium
0,25 g de sulfate de magnésium
0,10 g de sulfate ferrique ou sulfate de fer
(III)
1 litre d'eau distillée
63. Liquide de Knop sans potassium:
1,25 g de nitrate de calcium
0,25 g de sulfate de magnésium
0,25 g de sulfate ferrique
1 litre d'eau distillée
64. Liquide de Knop sans azote:
1 g de chlorure de calcium
0,25 g de phosphate mono potassique
0,1 g de sulfate ferrique
0,5 g de chlorure de potassium
0,25 g de sulfate de magnésium
1 litre d'eau distillée
69. Fragments foliaires :
Dimension : 5 × 5 mm
Origine:
Feuilles de jeunes
plantules âgées de 8
semaines issues de la
germination in vitro
d’akènes stockés à
l'obscurité à 4°C
pendant au moins 4
mois
Des pousses issues de la
culture d’apex sur un milieu
de multiplication.
70. Cotylédons :
Cotylédons
embryonnaires
Cotylédons non
embryonnaires
prélevés à partir
d’akènes ayant subi une
stérilisation par NaOCl (10
%) pendant 10 minutes, 3
rinçages à l'eau distillée
stérile suivis d'une
imbibition de 24 heures
pour
ramollir les téguments.
prélevés sur de jeunes
plantules âgées de
4 semaines issues de la
germination in vitro
d’akènes afin de
comparer leur
réponse callogène avec
celle des cotylédons
embryonnaires.
71. Le plus utilisé pour la callogenèse : milieu Murashige et
Skoog
Composition :
D’autres éléments :
2,4 D : Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique
BA: BenzylAdenine
sels minéraux
(essentiellem
ent des
macroélémen
ts)
des
sucres
des vitamines
B
auxines cytokinine
s
72. L’induction des cals a été réalisée sur le milieu MS
additionné de :
30 g/l de saccharose
Diverses combinaisons de BA (0,5 ; 1 ; 2 ; 2,5 ;5 mg/l)
2,4-D (0,5 ; 1 ; 2 ; 2,5 ; 5 mg/l)
phytohormones appropriées pour l’initiation des
cals chez plusieurs variétés de Fraisier [3,6,10,15].
Le milieu solidifié par 8 g/l d'agar est autoclavé
pendant 20 minutes à 120°C.
73. Matériel :
6 boites de pétri contenant 30ml du milieu pour chaque
traitement
Manipulation:
Fragments foliaires Cotylédons
- Les fragments foliaires ont
été déposés face supérieure
en contact avec le milieu
(Les explants sont placés à
raison de 4 par boîte de Petri
)
La même chose pour es
fragments
Cotylédonaires.
On répète l’experience 3 fois Même chose
74. Incubation
Les cultures ont été soumises deux semaines à l'obscurité
et à 20±2°C pour une meilleure induction des cals
Ensuite, et dans les expériences ultérieures, les cultures
ont été transférées dans une salle de culture à 24±1°C et
75 % d'humidité relative, l'éclairement, d'une intensité de
4000 lux (0,54 W.m-2), est fourni 16 heures par jour par
des tubes fluorescents
Le pourcentage d’explants formant des cals et l’aspect
des cals ont été notés après 4, 6 et 8 semaines de
culture.
75. Effet des
phytohormones
La combinaison 2 mg/l de 2,4-D et 1 mg/l de BA
donne la meilleure
callogenèse pour les deux types d’explants chez
les deux cultivars et a été retenue.
Effet de la source des
explants
-Le taux de callogenèse est de 100 % pour les
cotylédons embryonnaires de 2 cultivars.
95 et 98 % des fragments foliaires prélevés sur
des feuilles de plantules de 8 semaines issues de
germination sont callogènes contre seulement
72,4 et 57,3 % pour les fragments foliaires de
pousses de la phase
de multiplication, respectivement pour
‘Chandler’ et ‘Tudla’.
76. Effets de milieu de culture sur
les cals de fraisier:
Pennell a étudier chez cette variété l’effet des
solutions MS,Knop,B5,Heller… et remarqué que :
Le milieu Knop favorise l’apparition de bourgeons
individualisés
Le milieu MS donne, au contraire un bon
développement des bourgeons axilliaires mais
avec des signes de vitrifivation.
