BIOTECNOLOGIA EN INMUNOLOGIA CLÍNICA Dr. Martin Villarroel Mareño Doctorando Inmunología  Experto en Docencia Universitari...
Plan de la clase <ul><li>Tecnología de anticuerpos </li></ul><ul><ul><li>Uso de los anticuerpos en el laboratorio:  inmuno...
1. Usos diagnósticos y terapéuticos de los anticuerpos <ul><li>Técnicas analíticas/diagnósticas:  miden generalmente fuera...
1. Uso de anticuerpos en el laboratorio   <ul><li>Fundamento:  Pueden ser utilizados como  nanoherramientas  capaces de  r...
Cuantificación de antígeno <ul><li>Miden analitos mediante anticuerpos especificos unidos a isotopos ra dioactivos  (RIA) ...
Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicos <ul><li>Inmunoprecipitación  </li></ul><ul><li>Se so...
Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicos <ul><li>Western e inmunoblot  </li></ul><ul><li>S ep...
Identificación, purificación y caracterización de células <ul><li>Citometría de flujo.  </li></ul><ul><li>La expresión de ...
Localización del antígeno en tejidos o células <ul><li>Inmunofluorescencia  Anticuerpos fluoromarcados en microscopia ópti...
Localización del antígeno en pacientes <ul><li>Inmunoresonancia  marcaje con anticuerpos unidos a sustancias con propiedad...
Uso de anticuerpos para separación celular . <ul><li>  Métodos de fase sólida  Fijación de anticuerpos por su región Fc a ...
Métodos fluorescentes inteligentes  <ul><li>FACS  (Fluorescence Activated Cell Sorting)  </li></ul><ul><li>anticuerpos uni...
2. Terapia con anticuerpos monoclonales “from magical bullets to smart bombs” <ul><li>La idea era de principios del siglo ...
2. Uso terapéutico de los anticuerpos <ul><li>Radioconjugados  </li></ul><ul><ul><li>Fósforo, Estroncio, Yodo, Ytrio   </l...
Anticuerpos sin conjugar <ul><li>Terapia antitumoral selectiva </li></ul><ul><ul><li>1999 AntiCD20 Rituximab para linfomas...
Conjugados  con partículas magnéticas <ul><li>AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por sele...
Antagonistas de citocinas <ul><li>Anticuerpos anticitocina  Anti-TNF  Infliximab  </li></ul><ul><ul><li>Neutralizan medi...
3. Producción de anticuerpos <ul><li>Obtención de  antisueros  (anticuerpos policlonales) </li></ul><ul><li>Síntesis de  a...
Obtención de antisueros  (anticuerpos policlonales)  <ul><li>Uso diagnóstico </li></ul><ul><li>En terapia antisueros antit...
Síntesis de anticuerpos monoclonales Kohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975). -  PROTEÍNA - PLÁSMIDO - CÉLULAS  -VÍA: paren...
Problemas para el uso terapéutico inmunogenicidad de los anticuerpos xenogénicos
Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerpos <ul><li>Anticuerpos xenogénicos  </li></ul><ul><ul><li>Estimulan la f...
Síntesis de anticuerpos quiméricos Morrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne (Nature, 1984).
Variantes biotecnológicas <ul><li>Quimeras con región Fc.  alargan vida media de la molécula asociada </li></ul><ul><li>An...
El “toque humano” ha permitido el uso clínico <ul><li>Anticuerpos quiméricos (1995-) V murina C humana </li></ul><ul><ul><...
Citometria de flujo
Ejemplo de aplicación de la citometria de flujo. Inmunofenotipo en mieloma múltiple y evaluación de la EMR
VALORACION DE RESPUESTA CELULAR
Hemos aprendido <ul><ul><li>Métodos de uso de los anticuerpos en el  laboratorio   </li></ul></ul><ul><ul><li>Posibilidade...
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Inmunodiagnosticoeinmunoterapia Umsa 2008

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    1. 1. BIOTECNOLOGIA EN INMUNOLOGIA CLÍNICA Dr. Martin Villarroel Mareño Doctorando Inmunología Experto en Docencia Universitaria UAH - Alcalá de Henares, España Instituto Boliviano de oncohematología Paolo Belli. Laboratorio de Biología Celular Facultad de Medicina. Universidad Mayor de San Andrés. La Paz - Bolivia
    2. 2. Plan de la clase <ul><li>Tecnología de anticuerpos </li></ul><ul><ul><li>Uso de los anticuerpos en el laboratorio: inmunodiagnóstico </li></ul></ul><ul><ul><li>Uso clínico de los anticuerpos: inmunoterapia </li></ul></ul><ul><ul><li>Producción de anticuerpos para uso clínico y diagnóstico </li></ul></ul>
    3. 3. 1. Usos diagnósticos y terapéuticos de los anticuerpos <ul><li>Técnicas analíticas/diagnósticas: miden generalmente fuera del organismo por técnicas &quot; in vitro &quot; algún parámetro </li></ul><ul><ul><li>ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad </li></ul></ul><ul><ul><li>WESTERN inmunoelectroforesis de proteínas, inmunodetección </li></ul></ul><ul><ul><li>IMMUNOHISTOQUIMICA , biopsias, anatomía patológica </li></ul></ul><ul><ul><li>NEFELOMETRIA turbidometría, Ig séricas </li></ul></ul><ul><ul><li>CITOMETRIA DE FLUJO Diagnóstico de leucemias </li></ul></ul><ul><li>Técnicas terapéuticas : diseñadas para curar. </li></ul><ul><ul><li>Tratamiento antineoplásico destrucción células tumorales </li></ul></ul><ul><ul><li>Tratamientos antiinflamatorios . Neutralización de mediadores proinflamatorios </li></ul></ul>
    4. 4. 1. Uso de anticuerpos en el laboratorio <ul><li>Fundamento: Pueden ser utilizados como nanoherramientas capaces de reconocer específicamente y a las que nosotros podemos sujetar, localizar o medir. </li></ul><ul><li>Especificidad en el reconocimiento aportada por la región Fab del anticuerpo. </li></ul><ul><li>2. Posibilidad de marcaje : radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente biotina-avidina. Detección y medida. </li></ul><ul><li>3. Unión a soportes ( magnéticos o de plástico) por región Fc. Separación y purificación molecular y celular. </li></ul>1. Ag. 2. * 3.
    5. 5. Cuantificación de antígeno <ul><li>Miden analitos mediante anticuerpos especificos unidos a isotopos ra dioactivos (RIA) o a enzimas (ELISA), comparan con una curva estándar con concentraciones conocidas de la sustancia problema. </li></ul><ul><li>ELISA o RIA competitivo . Antígeno pegado. El antígeno de la muestra inhibe la unión de un anticuerpo indicador al antígeno pegado al pocillo. </li></ul><ul><li>  ELISA o RIA sandwich . 1 er anticuerpo pegado captura antígeno segundo anticuerpo indicador unido a enzima o radiomarcado reconoce otro determinante del antígeno. </li></ul>
    6. 6. Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicos <ul><li>Inmunoprecipitación </li></ul><ul><li>Se solubilizan proteinas celulares con detergentes </li></ul><ul><li>S e usa un anticuerpo especifico para precipitar una proteína, </li></ul><ul><li>Se lava y así se la separa de las otras sustancias. </li></ul><ul><li>Se libera el antígeno por cambio de pH que reduce la afinidad de la unión Ab-Ag. </li></ul><ul><li>Estudios de coinmunoprecipitación +western . Estudio de complejos moleculares. </li></ul>
    7. 7. Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicos <ul><li>Western e inmunoblot </li></ul><ul><li>S eparación analítica por electroforesis en gel de (SDS)-poliacrilamida separa proteínas por su peso molecular </li></ul><ul><li>Son transferidas a un filtro poroso por capilaridad. </li></ul><ul><li>Las proteínas son reconocidas por anticuerpos radiomarcados o unidos a enzimas. </li></ul>
    8. 8. Identificación, purificación y caracterización de células <ul><li>Citometría de flujo. </li></ul><ul><li>La expresión de antígenos es medida en cada célula haciéndolas pasar de una en una por delante de un haz de luz, anticuerpos marcados fluorescentes son utilizados como moléculas indicadoras. </li></ul><ul><li>Marcaje de superficie celular </li></ul><ul><li>Marcaje intracelular </li></ul><ul><li>Marcaje de células secretoras </li></ul>
    9. 9. Localización del antígeno en tejidos o células <ul><li>Inmunofluorescencia Anticuerpos fluoromarcados en microscopia óptica. estructuras no marcadas no se ven, dificultando la localización precisa del marcaje fluorescente. </li></ul><ul><li>Citometría Láser de barrido ilumina con láser, lee fluorescencia a varios colores </li></ul><ul><li>Inmunohistoquímica: Utilización en microscopia óptica de anticuerpos unidos a enzimas que producen compuestos coloreados e insolubles que precipitan en la posición del ag . </li></ul><ul><li>Microscopia inmunoelectrónica: Utiliza anticuerpos unidos a compuestos electrodensos, como el oro coloidal.   </li></ul>
    10. 10. Localización del antígeno en pacientes <ul><li>Inmunoresonancia marcaje con anticuerpos unidos a sustancias con propiedades de conservación de spin caracteristicas </li></ul><ul><li>Inmuno scanner radiológico marcaje de anticuerpo con compuestos radio-opacos </li></ul><ul><li>InmunoPET . Marcaje con anticuerpos sustancias emisoras de positrones.   </li></ul><ul><li>Inmunoliposomas permiten marcar anticuerpos con casi cualquier cosa </li></ul>
    11. 11. Uso de anticuerpos para separación celular . <ul><li>  Métodos de fase sólida Fijación de anticuerpos por su región Fc a una fase sólida. </li></ul><ul><ul><li>Panning </li></ul></ul><ul><ul><li>Fijación de anticuerpos a plástico. Células portadoras del antígeno se unen al soporte. lavado y separación mecánica o química. </li></ul></ul><ul><ul><li>MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) </li></ul></ul><ul><ul><li>Anticuerpos unidos a micropartículas magnéticas son retenidos en una matriz ferromagnética (fase sólida) cuando se aplica un campo magnético. Células portadoras del antígeno se unen al soporte. lavado y elución por eliminación del campo magnético. </li></ul></ul>
    12. 12. Métodos fluorescentes inteligentes <ul><li>FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) </li></ul><ul><li>anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie de cada célula. </li></ul><ul><li>Células de los fenotipos seleccionados son reconocidas una a una y separadas en función de las combinaciones de parámetros seleccionados. </li></ul><ul><li>Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída de la célula hacia el contenedor de fracción deseado. </li></ul><ul><li>Se pueden clonar células de características específicas. </li></ul>
    13. 13. 2. Terapia con anticuerpos monoclonales “from magical bullets to smart bombs” <ul><li>La idea era de principios del siglo XX </li></ul><ul><li>Tecnología anticuerpos monoclonales 1975. Nobel a un Posdoc Kohler </li></ul><ul><li>Limitaciones de anticuerpos murinos </li></ul><ul><ul><li>Vida media corta en humanos </li></ul></ul><ul><ul><li>No interaccionan óptimamente con sistemas efectores humanos </li></ul></ul><ul><ul><li>Estimulan formación de anti-anticuerpos (reacciones anafilácticas) </li></ul></ul><ul><li>Anticuerpos humanizados </li></ul><ul><li>200 anticuerpos distintos en pruebas clínicas y a diferencia de antiangiogénicos están funcionando en terapia antitumoral. </li></ul><ul><li>Estimulan activación complemento, ADCC, fagocitosis. </li></ul>
    14. 14. 2. Uso terapéutico de los anticuerpos <ul><li>Radioconjugados </li></ul><ul><ul><li>Fósforo, Estroncio, Yodo, Ytrio </li></ul></ul><ul><ul><li>I-antiCD45 leucemias mieloides agudas </li></ul></ul><ul><ul><li>Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Itrio 90 emisión  </li></ul></ul><ul><ul><li>Bexxar antiCD20 de ratón Iodo131 </li></ul></ul><ul><li>Quimioconjugados </li></ul><ul><ul><li>AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen apoptosis. </li></ul></ul><ul><ul><li>Se emplea en leucemias mieloides agudas. El antígeno CD33 se endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33. </li></ul></ul><ul><ul><li>AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas. </li></ul></ul><ul><li>Anticuerpos puros </li></ul><ul><ul><li>AntiCD40 induce AICD en linfomas. </li></ul></ul><ul><ul><li>AntiCD20 mata células de linfomas y leucemias (depende de polimorfismo Receptores Fc). </li></ul></ul>
    15. 15. Anticuerpos sin conjugar <ul><li>Terapia antitumoral selectiva </li></ul><ul><ul><li>1999 AntiCD20 Rituximab para linfomas y Leucemias de células B </li></ul></ul><ul><ul><li>2001 Anti CD52 Campath 1H tumores de células B, enfermedad mínima residual, rechazo de órganos e injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes </li></ul></ul><ul><li>Eliminación de células indeseables de inóculos para trasplante de médula ósea. </li></ul><ul><ul><li>AntiCD3 OKT-3 Purgado de linfocitos T de inóculos alogénicos anti-CD3 </li></ul></ul><ul><ul><li>Purgado de células tumorales de inóculos autólogos. </li></ul></ul>
    16. 16. Conjugados con partículas magnéticas <ul><li>AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por selección inmunomagnética. </li></ul><ul><li>Permite purificar células madre a partir de sangre periférica. </li></ul>
    17. 17. Antagonistas de citocinas <ul><li>Anticuerpos anticitocina Anti-TNF  Infliximab </li></ul><ul><ul><li>Neutralizan mediadores proinflamatorios </li></ul></ul><ul><ul><li>Tienen un efecto drástico efecto antiinflamatorio </li></ul></ul><ul><ul><li>Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide. </li></ul></ul><ul><li>Receptores solubles de TNF Etanercep </li></ul><ul><ul><li>También neutralizan TNF pero tienen vida más corta. </li></ul></ul><ul><li>Quimeras con región Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble </li></ul>
    18. 18. 3. Producción de anticuerpos <ul><li>Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales) </li></ul><ul><li>Síntesis de anticuerpos monoclonales </li></ul><ul><li>Reducción de su inmunogenicidad. Síntesis de anticuerpos quiméricos </li></ul>
    19. 19. Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales) <ul><li>Uso diagnóstico </li></ul><ul><li>En terapia antisueros antitetánicos </li></ul><ul><li>VENTAJAS: rápido y de bajo coste </li></ul><ul><li>INCONVENIENTES: Reproducibilidad limitada, cantidad limitada de Ab. </li></ul>
    20. 20. Síntesis de anticuerpos monoclonales Kohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975). - PROTEÍNA - PLÁSMIDO - CÉLULAS -VÍA: parenteral, intramuscular... -DOSIS: 3/4 inóculos -ADYUVANTES Y CARRIERS. CEPA: BALB/c, Y3 PROTEÍNAS VIRALES MÉTODOS ELECTRICOS CEPAS: P3/x63.Ag8.653, NSI/0, NSI/1 ELISA, IFI, RIA, WESTERN, INMUNOCITOQUÍMICAS, FACS....... - DILUCIÓN - AGAR
    21. 21. Problemas para el uso terapéutico inmunogenicidad de los anticuerpos xenogénicos
    22. 22. Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerpos <ul><li>Anticuerpos xenogénicos </li></ul><ul><ul><li>Estimulan la formación de antianticuerpos </li></ul></ul><ul><li>Anticuerpos quiméricos </li></ul><ul><ul><li>Regiones variables murinas </li></ul></ul><ul><ul><li>Regiones constantes humanas funciones efectoras </li></ul></ul><ul><li>Anticuerpos humanizados </li></ul><ul><ul><li>Reemplazo de regiones armazón originales del domino variable por otras humanas para disminuir todavía más la inmunogenicidad. </li></ul></ul>
    23. 23. Síntesis de anticuerpos quiméricos Morrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne (Nature, 1984).
    24. 24. Variantes biotecnológicas <ul><li>Quimeras con región Fc. alargan vida media de la molécula asociada </li></ul><ul><li>Anticuerpos biespecíficos. </li></ul><ul><li>Inmunopartículas biespecíficas </li></ul><ul><li>Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos monoclonales </li></ul><ul><li>letales como transportadores de sustancias toxicas intracelulares ej. RNAasas </li></ul>
    25. 25. El “toque humano” ha permitido el uso clínico <ul><li>Anticuerpos quiméricos (1995-) V murina C humana </li></ul><ul><ul><li>Simulect rechazo </li></ul></ul><ul><ul><li>Remicade Infliximab Crohn, AR </li></ul></ul><ul><li>Humanizados HVR murina FR humana C humana </li></ul><ul><ul><li>Zenapax (1997) (CD25) </li></ul></ul><ul><ul><li>Herceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptor </li></ul></ul><ul><ul><li>Campath (2001) antiCD52 </li></ul></ul><ul><ul><li>Xolair Omalizumab(2003) anti IgE asma alérgica </li></ul></ul><ul><ul><li>Efalizumab (2004) psoriasis </li></ul></ul><ul><ul><li>200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos. </li></ul></ul>
    26. 26. Citometria de flujo
    27. 27. Ejemplo de aplicación de la citometria de flujo. Inmunofenotipo en mieloma múltiple y evaluación de la EMR
    28. 28. VALORACION DE RESPUESTA CELULAR
    29. 29. Hemos aprendido <ul><ul><li>Métodos de uso de los anticuerpos en el laboratorio </li></ul></ul><ul><ul><li>Posibilidades de uso clínico de los anticuerpos en inmunoterapia </li></ul></ul><ul><ul><li>Tecnologías de producción de anticuerpos para uso clínico y diagnóstico </li></ul></ul>

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