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INTERACCIÓN DE LACTOBACILOS PROBIÓTICOS
                     CON Escherichia coli ENTEROHEMORRÁGICA




Hugo, A. A. 2007. Tesis Doctoral Capacidad probiótica de la cepa CIDCA 133 (Lactobacillus delbrueckii subsp lactis):
un recorrido desde modelos in vitro a in vivo



Kakisu, E. 2010. Tesis Doctoral. Desarrollo y optimización del proceso para la elaboración de leches fermentadas con
microorganismos aislados de gránulos de kefir con características tecnológicas y probióticas definidas.


Hugo, A. A.; Kakisu, E.J.; De Antoni G.L y Pérez, P.F. 2008. “Lactobacilli antagonize biological effects of
enterohaemorrhagic Escherichia coli in vitro”. Trabajo publicado en Letters in Applied Microbiology. 46: 613-619.



Kakisu, E; Abraham, A. G; Tironi Farinati, C, Ibarra, C y De Antoni, G.L. Lactobacillus plantarum isolated from kefir protects
from damage induced by shiga toxin type II- produced by enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Trabajo en
prensa en el Journal of Dairy Research.
PROBIÓTICOS

•“Los  probióticos son microorganismos vivos que administrados en cantidades
apropiadas confieren un beneficio en la salud del hospedador” (FAO y WHO, 2001).

• Generalmente se trata de bacterias de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium.
• El género Lactobacillus conforma un grupo heterogéneo de microorganismos,
perteneciente al grupo de las bacterias ácido lácticas (BAL).

• La cepa CIDCA 133 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) constituye un aislado de
leche cruda. La cepa CIDCA 83114 (Lactobacillus plantarum) constituye un aislado de
gránulos de kefir. Ambos pertenecen al grupo de lactobacilos homofermentativos.
¿Qué hacen los probióticos?


                                                         Control de la
                                                         inflamación
                                                                              Alivio de
                                                           intestinal
                                                                                alergia
    Resistencia a la            Normalización de la                          alimentaria
     colonización               microbiota intestinal
                                                        Balance de la rta
                                                            inmune

                                                                              Mejora de la
    Supresión de                                            Inmuno
                                                                              rta inmune
     patógenos                                             modulación
                                                                                 innata
                                PROBIÓTICOS

  Reducción del
riesgo de cáncer       Fuente de SCFA y                 Deconjugación y     Disminución
    de colon              vitaminas                      secreción de
                                                         sales biliares
                                                                            del colesterol
                                  Efectos metabólicos
         Disminución de las
        reacciones químicas                               Hidrólisis de      Mejora de la
        mutagénicas a nivel                                 lactosa         tolerancia a la
             intestinal                                                         lactosa
Interacción entre lactobacilos probióticos y
                         E. coli EHEC: modelos in vitro

Epidemiología

• E. coli enterohemorrágica (EHEC) es un conjunto de cepas patógenas que producen
diarrea, colitis hemorrágica (CH) o síndrome urémico hemolítico (SUH) en el hombre.

• El SUH complica el 10% de los casos de infección por E. coli EHEC, con una tasa de
mortalidad entre el 2-10%, siendo los niños menores de 5 años especialmente susceptibles

• En Argentina el SUH es endémico con aproximadamente 300 nuevos casos anuales
reportados.

• La transmisión de EHEC se realiza principalmente través de alimentos contaminados con
materia fecal, particularmente de origen bovino.
Patogenia

                                 Principales factores de
                                   virulencia de EHEC




                 Shiga toxinas                         Región LEE



            Stx1           Stx2             TTSS           Tir      Intimina


            Interrupción de la                             Lesión A/E
             síntesis proteica


                            Diseño experimental

       Células         EHEC 0157:H7                                     Células
                                                     Lactobacilos
        Vero           (Stx2+;eae+) y/o         +                       Hep-2
                       sobrenadantes

                                   Daño celular
Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero


                                                          Rojo Neutro
                                       140
                                             sn EHEC
                                             133 GEN+sn EHEC
                                                                                                  La presencia de la cepa CIDCA 133
                                             LBR GEN+sn EHEC                                     (Lb delbrueckii subsp lactis) protegió
                                             control                        b                b
Porcentaje de células sobrevivientes




                                       120             b
                                                                                                      a las células Vero del daño
                                       100                                                        provocado por los sbdtes de EHEC.
                                                                                     b

                                       80                                                        Las células coincubadas con la cepa
                                                                    b                    a
                                                  b
                                                                                                      LBR, (Lb delbrueckii subsp.
                                              a
                                       60
                                                      a         a
                                                                        a        a
                                                                                                   bulgaricus) mostraron un daño
                                       40
                                                                                                        semejante al control.

                                       20


                                        0
                                                  1/5               1/30             1/180
                                                  Concentración de sobrenadante de EHEC
Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero

                              Lb delbrueckii subsp lactis (CIDCA133)       LDH                                   Lb plantarum (CIDCA 83114)
                                                   i   p
                             30                    n   a
                                    sn EHEC                                                          30
                                                   a   r
                                      a
                                                   c   e   v
                             25                    t   d   i                                         25




                                                                            Percentage LDH release
                                                   i   e   a
Porcentaje de LDH liberado




                                                   v   s   b                                         20
                             20                    a   b   l
                                               b           e                                                                                     *             *
                                                                                                     15
                             15                            b

                                                                                                     10
                             10
                                                                                                      5

                              5                                                                       0
                                                                  c                                                li                           14           114
                                                                                                               . co nt                       831
                                                                                                           sch rnata
                                                                                                          E e   sn EHEC            a   rum
                                                                                                                                                CIDCA tarum 83 Paredes
                                                                                                           sup                  ant                        an
                                                                                                                          Lb
                                                                                                                            . pl                 114Lb. p-lwalls
                              0                                                                                                                      cel
                                                                                                                                                        l




                              El efecto protector de los lactobacilos se                                                 Kakisu et al, 2012 (en prensa)
                             verifica tanto con la bacteria entera, como
                                           con sus paredes.
Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero

                                                                                       LDH                                                               1     2     3    4
                                                                                                                                                    SN EHEC + SN EHEC VLMW LMW
                         30                                                                                                                         paredes
                                    SN EHEC
                                                                        100 ºC
                                                                                                                        Pep
                         25                                                                              Prt K
                                                                                                                                   α QuimP                                       94
Percentage LDH release




                                                                                                                                             Trip                                67
                         20                                                                                                                  *
                                                               *                                                                                                                 43
                         15

                                                                                                                                                                                 30
                         10                                                                                                                                                      26.9

                          5                                                                                                                                                      20.1
                                                                                                                                                                                 16.9
                          0                                                                                                                                                      14.4
                                          a nt                              14                                                  w it
                                                                                                                                    h
                                  ernat              311
                                                           4         8 31        min             w it
                                                                                                     h
                                                                                                                 w it
                                                                                                                     h
                                                                                                                           14            w it
                                                                                                                                             h

                         EC
                              sup
                                           ta r
                                               Paredes ldearum0 ºC 10 m 83114 m 83114 rum 831
                                                 8
                                                um                                                       8 31
                                                          ant 10 Paredes con tratamiento térmico y enzimático
                                                                                                              14
                     EH                  an          b. p e d a t        u
                                                                      tar k      ru    ta     in     rum
                                  . pl                                       nta    lan tryps
                                              Lb plantarum b. plan ase b. plan Lb. p ymo b. plan
                                                    L at                                         nta
                               Lb
                                                     tre             n                 L                                L                                                        6.5
                                                                    L    tei                si          -c
                                                                                                            h               psi
                                                                     pro                pep                              try


           Péptidos termosensibles de la superficie celular
           de Lb. plantarum CIDCA 83114 intervienen en la                                                                                                SDS-PAGE
                    captura o proteólisis de la Stx 2
                                                                                                                                                     Kakisu et al, 2012 (en prensa)
Interacción de E. coli EHEC y lactobacilos con células Hep-2



                                                                     EHEC en
                        Cristal violeta                            sobrenadante           M
           EHEC
                                                                                          G
                              LBB   LBR
                                                                                          G

                                          133   114
                  133   114               UV    UV
                                                                               200X


                                                      control




                                                Hugo et al, 2010
Lb . delbrueckii susp lactis (CIDCA 133) y
                                                                                   200X
      Lb. plantarum (CIDCA 83114)
protegieron las monocapas tratadas con                             133 + EHEC en
EHEC resuspendida en su sobrenadante.                              sobrenadante
Microscopía electrónica de barrido (MEB)

                      1000X                              1000X                      1000X




           Control                             EHEC                    114 + EHEC

2500X                                                    2500X                      2500X

                     EHEC

                     MLP
        blebs




           EHEC                             133 + EHEC                 Control

                                                                          Hugo et al, 2010
Interacción de E. coli EHEC y lactobacilos con células Hep-2




 Asociación de EHEC a                              1e+7
                                                          a
    células Hep-2 en                                                a                   EHEC en sn
                                                                                        133 + EHEC en sn
presencia de la cepa 133                           1e+6


                                                                         b




                                    Log (UFC/ml)
                                                                                    b
                                                   1e+5


     La disminución de la                                                               c

 asociación de EHEC no sería                       1e+4
                                                                                                  d

 el mecanismo que explica la
   protección que ejerce el
 lactobacilo sobre las células                     1e+3

                                                              EHEC 108       EHEC 107       EHEC 106
         eucarióticas
CONCLUSIONES

• Los lactobacilos CIDCA 133 y CIDCA 83114 fueron capaces de antagonizar el efecto
biológico de los distintos factores de virulencia de E. coli enterohemorrágica (EHEC)
sobre células Vero y Hep-2.

• La viabilidad de los lactobacilos no es necesaria para ejercer el efecto protector tanto
sobre la acción de la Shiga toxina en las células Vero como sobre la acción combinada de
EHEC y su sobrenadante sobre las células Hep-2.
• La capacidad de ejercer un efecto antagónico sobre la Shiga toxina reside en las
paredes del lactobacilo y estaría asociada al secuestro o proteólisis por parte de un
componente proteico.
• La protección observada en las células Hep-2 infectadas con EHEC no se debe al
desplazamiento del patógeno por el lactobacilo.

• El efecto protector observado en los sistemas ensayados no es una propiedad
inherente a todos los lactobacilos sino que es cepa dependiente.
MUCHAS GRACIAS

POR SU ATENCIÓN

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  • 1. INTERACCIÓN DE LACTOBACILOS PROBIÓTICOS CON Escherichia coli ENTEROHEMORRÁGICA Hugo, A. A. 2007. Tesis Doctoral Capacidad probiótica de la cepa CIDCA 133 (Lactobacillus delbrueckii subsp lactis): un recorrido desde modelos in vitro a in vivo Kakisu, E. 2010. Tesis Doctoral. Desarrollo y optimización del proceso para la elaboración de leches fermentadas con microorganismos aislados de gránulos de kefir con características tecnológicas y probióticas definidas. Hugo, A. A.; Kakisu, E.J.; De Antoni G.L y Pérez, P.F. 2008. “Lactobacilli antagonize biological effects of enterohaemorrhagic Escherichia coli in vitro”. Trabajo publicado en Letters in Applied Microbiology. 46: 613-619. Kakisu, E; Abraham, A. G; Tironi Farinati, C, Ibarra, C y De Antoni, G.L. Lactobacillus plantarum isolated from kefir protects from damage induced by shiga toxin type II- produced by enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Trabajo en prensa en el Journal of Dairy Research.
  • 2. PROBIÓTICOS •“Los probióticos son microorganismos vivos que administrados en cantidades apropiadas confieren un beneficio en la salud del hospedador” (FAO y WHO, 2001). • Generalmente se trata de bacterias de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium. • El género Lactobacillus conforma un grupo heterogéneo de microorganismos, perteneciente al grupo de las bacterias ácido lácticas (BAL). • La cepa CIDCA 133 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) constituye un aislado de leche cruda. La cepa CIDCA 83114 (Lactobacillus plantarum) constituye un aislado de gránulos de kefir. Ambos pertenecen al grupo de lactobacilos homofermentativos.
  • 3. ¿Qué hacen los probióticos? Control de la inflamación Alivio de intestinal alergia Resistencia a la Normalización de la alimentaria colonización microbiota intestinal Balance de la rta inmune Mejora de la Supresión de Inmuno rta inmune patógenos modulación innata PROBIÓTICOS Reducción del riesgo de cáncer Fuente de SCFA y Deconjugación y Disminución de colon vitaminas secreción de sales biliares del colesterol Efectos metabólicos Disminución de las reacciones químicas Hidrólisis de Mejora de la mutagénicas a nivel lactosa tolerancia a la intestinal lactosa
  • 4. Interacción entre lactobacilos probióticos y E. coli EHEC: modelos in vitro Epidemiología • E. coli enterohemorrágica (EHEC) es un conjunto de cepas patógenas que producen diarrea, colitis hemorrágica (CH) o síndrome urémico hemolítico (SUH) en el hombre. • El SUH complica el 10% de los casos de infección por E. coli EHEC, con una tasa de mortalidad entre el 2-10%, siendo los niños menores de 5 años especialmente susceptibles • En Argentina el SUH es endémico con aproximadamente 300 nuevos casos anuales reportados. • La transmisión de EHEC se realiza principalmente través de alimentos contaminados con materia fecal, particularmente de origen bovino.
  • 5. Patogenia Principales factores de virulencia de EHEC Shiga toxinas Región LEE Stx1 Stx2 TTSS Tir Intimina Interrupción de la Lesión A/E síntesis proteica Diseño experimental Células EHEC 0157:H7 Células Lactobacilos Vero (Stx2+;eae+) y/o + Hep-2 sobrenadantes Daño celular
  • 6. Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero Rojo Neutro 140 sn EHEC 133 GEN+sn EHEC La presencia de la cepa CIDCA 133 LBR GEN+sn EHEC (Lb delbrueckii subsp lactis) protegió control b b Porcentaje de células sobrevivientes 120 b a las células Vero del daño 100 provocado por los sbdtes de EHEC. b 80 Las células coincubadas con la cepa b a b LBR, (Lb delbrueckii subsp. a 60 a a a a bulgaricus) mostraron un daño 40 semejante al control. 20 0 1/5 1/30 1/180 Concentración de sobrenadante de EHEC
  • 7. Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero Lb delbrueckii subsp lactis (CIDCA133) LDH Lb plantarum (CIDCA 83114) i p 30 n a sn EHEC 30 a r a c e v 25 t d i 25 Percentage LDH release i e a Porcentaje de LDH liberado v s b 20 20 a b l b e * * 15 15 b 10 10 5 5 0 c li 14 114 . co nt 831 sch rnata E e sn EHEC a rum CIDCA tarum 83 Paredes sup ant an Lb . pl 114Lb. p-lwalls 0 cel l El efecto protector de los lactobacilos se Kakisu et al, 2012 (en prensa) verifica tanto con la bacteria entera, como con sus paredes.
  • 8. Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero LDH 1 2 3 4 SN EHEC + SN EHEC VLMW LMW 30 paredes SN EHEC 100 ºC Pep 25 Prt K α QuimP 94 Percentage LDH release Trip 67 20 * * 43 15 30 10 26.9 5 20.1 16.9 0 14.4 a nt 14 w it h ernat 311 4 8 31 min w it h w it h 14 w it h EC sup ta r Paredes ldearum0 ºC 10 m 83114 m 83114 rum 831 8 um 8 31 ant 10 Paredes con tratamiento térmico y enzimático 14 EH an b. p e d a t u tar k ru ta in rum . pl nta lan tryps Lb plantarum b. plan ase b. plan Lb. p ymo b. plan L at nta Lb tre n L L 6.5 L tei si -c h psi pro pep try Péptidos termosensibles de la superficie celular de Lb. plantarum CIDCA 83114 intervienen en la SDS-PAGE captura o proteólisis de la Stx 2 Kakisu et al, 2012 (en prensa)
  • 9. Interacción de E. coli EHEC y lactobacilos con células Hep-2 EHEC en Cristal violeta sobrenadante M EHEC G LBB LBR G 133 114 133 114 UV UV 200X control Hugo et al, 2010 Lb . delbrueckii susp lactis (CIDCA 133) y 200X Lb. plantarum (CIDCA 83114) protegieron las monocapas tratadas con 133 + EHEC en EHEC resuspendida en su sobrenadante. sobrenadante
  • 10. Microscopía electrónica de barrido (MEB) 1000X 1000X 1000X Control EHEC 114 + EHEC 2500X 2500X 2500X EHEC MLP blebs EHEC 133 + EHEC Control Hugo et al, 2010
  • 11. Interacción de E. coli EHEC y lactobacilos con células Hep-2 Asociación de EHEC a 1e+7 a células Hep-2 en a EHEC en sn 133 + EHEC en sn presencia de la cepa 133 1e+6 b Log (UFC/ml) b 1e+5 La disminución de la c asociación de EHEC no sería 1e+4 d el mecanismo que explica la protección que ejerce el lactobacilo sobre las células 1e+3 EHEC 108 EHEC 107 EHEC 106 eucarióticas
  • 12. CONCLUSIONES • Los lactobacilos CIDCA 133 y CIDCA 83114 fueron capaces de antagonizar el efecto biológico de los distintos factores de virulencia de E. coli enterohemorrágica (EHEC) sobre células Vero y Hep-2. • La viabilidad de los lactobacilos no es necesaria para ejercer el efecto protector tanto sobre la acción de la Shiga toxina en las células Vero como sobre la acción combinada de EHEC y su sobrenadante sobre las células Hep-2. • La capacidad de ejercer un efecto antagónico sobre la Shiga toxina reside en las paredes del lactobacilo y estaría asociada al secuestro o proteólisis por parte de un componente proteico. • La protección observada en las células Hep-2 infectadas con EHEC no se debe al desplazamiento del patógeno por el lactobacilo. • El efecto protector observado en los sistemas ensayados no es una propiedad inherente a todos los lactobacilos sino que es cepa dependiente.