ETA causadas por otras bacterias

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  • Estimada Dra, muy excelente sus presentaciones, si pudiera me podria enviar la presentacion de INTRODUCCION AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS.
    Cordial saludo.

    SANDRO SOTOMAYOR
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ETA causadas por otras bacterias

  1. 1. 06/12/2011 Marcela Martínez M.Sc. Se han establecido 3 grupos de especies dentro del género Campylobacter• Bacilos delgados de forma • Grupo 1: espiralada o vibriode. Campylobacter patógenos:• Gram negativos con un movimiento característico – C. coli de sacacorchos. – C. jejuni C. jejuni• Necesita una atmósfera con una concentración de – C. fetus C. coli O2 del 3-15% y CO2 en la misma proporción. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. C. fetus Hábitat natural Campilobacteriosis• Las bacterias del género • Campylobacter puede producir diferentes Campylobacter viven en enfermedades: el intestino, la cavidad – enteritis oral y los órganos reproductores del – abortos hombre y los animales. – septicemia• Su reservorio más • En el hombre, la abundante son los enfermedad más frecuente es la enteritis pequeños roedores. producida por C. jejuni. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 1
  2. 2. 06/12/2011 Campilobacteriosis Contagio Síntomas: diarrea, calambres, dolor abdominal y fiebre dentro de 1 a 5 días después de la exposición al organismo. La diarrea puede ser sanguinolenta y puede ir acompañada de náusea y de vómitos. La enfermedad dura típicamente una semana. La dosis infectiva muy variable: de 500 a 1.000.000 de células, dependiendo de diferencias entre cepas y entre individuos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Campilobacteriosis: alimentos Carne de aves es la principal fuente implicados de Campylobacter • La fuente de infección • Carne poco cocinada. más importante para el hombre son alimentos • Contaminación cruzada de origen animal: entre carne cruda contaminada y comida que – Carne de ave no se cocina antes de comer. – Leche • Contaminación por – Mariscos manipuladores que contaminan sus manos – Carne de vacuno y cordero durante la evisceración de las aves. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Factores que afectan el crecimiento de Campylobacter La leche ha sido responsable de • Temperatura: se destruye a muchos de los brotes de 55°C. Resiste T° de campilobacteriosis refrigeración. En la mayoría de los casos se trataba de leche sin pasteurizar. • Radiaciones: Se destruye a En ocasiones se ha considerado dosis de 1 Kgy responsable de brotes a leche pasteurizada deficientemente. • Desecación: Muere en La contaminación de la leche con alimentos con Aw ligeramente Campylobacter ocurre a través de reducida. las heces. Campylobacter es sensible al ácido • pH: Es muy sensible a la acidez. láctico así que los derivados pH óptimo entre 6,5 y 7,5 lácteos fermentados no suponen un riesgo de campilobacteriosis. • Atmosfera de conservación: sobrevive mejor al vacío que al Marcela Martínez M.Sc. aire con cierta humedad. Martínez M.Sc. Marcela 2
  3. 3. 06/12/2011 Investigación de Campylobacter en los alimentos Existen 2 sistemas • Las muestras deben ser procesadas rápidamente y básicos de aislamiento trasportarse a 4°C y nunca de Campylobacter a congelarse. partir de muestras de • La supervivencia se favorece en alimentos: un ambiente libre de oxígeno. En muestras líquidas añadir 1. Filtración a través de tioglicolato sódico al 0,15%. y membranas de 0,65 bisulfato sódico al 0,01%. m. • Las muestras sólidas pueden trasportarse en el medio Cary- 2. Enriquecimiento y Blair o en un medio de aislamiento. enriquecimiento adecuado. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Enriquecimiento de Campylobacter Aislamiento de CampylobacterComo caldo de enriquecimiento seusan caldos como el "Preston", • Campylobacter necesita"Doyle y Roman" o "Rosef" que llevan factores de crecimientoPolimixina B, Trimethroprim y para crecer.Vancomicina o Rifampicina. • Los medios más utilizados son el Preston, Skirrow, Butzler y el Campy-Bac • Contienen sangre y un número variable de antibióticos como Suelen incubarse al menos dos caldos, polimixina, vancomicina, poniendo uno a 37ºC y otro a 42-3ºC; la etc., para evitar el temperatura de 37ºC es la más adecuada crecimiento de la flora para recobrar C. jejuni de muestras de competidora. agua y algunas susbespecies de C. fetus que no crecen a 43ºC. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Incubación de Campylobacter Campylobacter - Morfología• El cultivo de Campylobacter debe hacerse en condiciones de microaerofilia,• Pueden utilizarse estufas especiales o jarras a las que se añaden sobres generadores de la mezcla de gases adecuada.• Se incuba a 37ºC y 42ºC durante 24-48 horas. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 3
  4. 4. 06/12/2011 Características bioquímicas de Diferenciación de especies Campylobacter Catalasa positiva C. jejuni, hidroliza el hipurato y es sensible a Ácido Nalidíxico, C. coli y C. fetus no hidrolizan el hipurato y Oxidasa positivo C. fetus es además resistente a Ácido Nalidíxico Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Clostridium perfringens • Bacilo Gram positivo. Gastroenteritis producida por • Catalasa negativo. Clostridium perfringens • Esporulado. • Anaerobio. • Hay 5 tipos de Cl. perfringens: A, B, C, D, y E que pueden distinguirse por sus toxinas letales. Marcela Martínez M.Sc. Gastroenteritis producida por Cl. Hábitat y distribución perfringens• Cl. perfringens tipo A es • La ETA se debe a la acción común en el intestino de una enterotoxina que se grueso de los humanos. produce en el intestino.• También forma parte de • Las cepas enterotoxigénicas la flora intestinal de del tipo A se han visto otros animales. implicadas, a veces, en diarreas derivadas del• Suelo y el polvo. consumo de antibióticos.• Aguas residuales y por • Cl. perfringens tipo A se ha lo tanto en aguas asociado con casos de dulces y sedimientos diarreas infantiles y de muerte súbita en bebés. marinos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 4
  5. 5. 06/12/2011 Síntomas de gastroenteritis por Cl. perfringens• Esta bacteria es además responsable de varias • Dolor abdominal, diarrea y enfermedades naúseas en ocasiones extraintestinales del vómitos. hombre y los animales, entre otras produce la: • El periodo de incubación va de 8 a 22 horas. – Gangrena gaseosa • La enfermedad es de corta – Hemolisis intravascular duración. – Bacteriemia • Los síntomas pueden confundirse con la – Abscesos en el peritoneo e intoxicación por la toxina infecciones en el tejido diarreica de Bacillus cereus. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Alimentos implicados en la Factores implicados en la transmisión transmisión de Cl. perfringens de Cl. perfringens• Las carne y productos cárnicos (70% de los • Cocinado de grandes piezas. casos). – Carnes crudas: vacuno, • Enfriamiento lento de las cerdo, cordero y aves. piezas cocinadas. – Carnes cocinadas. • Conservación a temperatura ambiente• Leche y derivados hasta el consumo.• Pescado • Recalentamiento insuficiente. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.Factores implicados en la transmisión Investigación de Cl. perfringens en el de Cl. perfringens laboratorio• Temperatura • Se hace por recuento en – Por debajo de 10°C su crecimiento se ve restringido. placa o en tubo. – No ocurre crecimiento en las 2 primeras horas del cocinado. • Se siembra en medio – Crecimiento exponencial a 45°C. selectivo en condiciones – A 55-60°C se puede evitar su reproducción. anaerobias. – Muerte a 75°C. • Medios más usados: Agar SPS, Agar Wilson-• pH: Crece a pH entre 5 y 9 Blair, Agar Eisen, Agar• Potencial redox: es relativamente tolerante al Oxígeno. Resiste un TS. potencial redox de hasta 350mv Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 5
  6. 6. 06/12/2011Investigación de Cl. perfringens en el Choque térmico para formación de esporas laboratorioSe pesan 10g o ml y se Se realizan diluciones seriadas enhomogenizan con 90ml de 9ml peptona 0.1%peptona 0.1% Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 minutos para activar las esporas. Marcela Martínez M.Sc. Para finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo. Marcela Martínez M.Sc. Siembra en fondo en agar SPS Incubación en anaerobiosis Se llevan a incubar las cajas en cámara de anaerobiosis por 72 horas a 37°C, con sobre generador de anaerobiosis e indicador atmosférico. Se siembra 1ml en fondo de la dilución que ha sido sometida a choque térmico y se agrega el medio SPS caliente. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Listeria monocytogentes • Cocobacilo Gram positivo. • Disposición en cadenas. empalizada, adopta formas en V y Y. • No capsulado. • Móvil a 22°C, inmóvil a 37°C. • En AS forma colonias pequeñas, hemolíticas. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 6
  7. 7. 06/12/2011 Crecimiento y distribución Resistencia a factores ambientales • Crece a pH 5-9,5. • Capacidad de sobrevivir durante • Soporta concentraciones de largos períodos de tiempo en NaCl de hasta el 30%. muchos medios diferentes. • Capacidad de reproducirse a bajas • Temperatura mínima de temperaturas. crecimiento: 5ºC. • Sobrevive en plantas, suelo y • Metabolismo anaerobio estiércol. facultativo. • Resiste la desecación. • Sobrevive y crece en suelos, • Resiste la congelación y el ambientes acuáticos (canales, almacenamiento a —18°C. lagos, aguas residuales), leche cruda y heces de animales. • No resiste la pasteurización. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Presencia en la industria alimentaria Supervivencia en alimentos • Acceso a la industria a través de suciedad en los zapatos, vehículos de transporte, animales y materias primas. • Se aísla frecuentemente de • Temperatura de crecimiento: 5 - 45°C los equipos pues puede • Destrucción por calor: algunas cepas resisten pasteurización. colonizar diversas superficies (acero inoxidable, vidrios y • Puede crecer entre pH 5 y 9,5 gomas) y crecer formando "biofilms". • El acido mas efectivo para prevenir el crecimiento es el ácido acético. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Listeriosis Listeriosis• Aparece como ETA por cambios en la producción de alimentos de primera necesidad: • Es una ETA atípica por su – Producción en gran escala de gravedad (muerte en 20- materias primas. 30% de los casos de listeriosis sistémica) . – Expansión de la industria agrícola. – Desarrollo de sistemas de • Carácter no entérico almacenaje en frio. (meningitis, septicemia, – Modificaciones en la tecnología aborto). del tratamiento de alimentos.• Por mayor demanda de: • Su período de incubación en frecuentemente largo. – Alimentos listos para comer. – Alimentos refrigerados y • Presenta predilección por congelados. individuos – Alimentos precocinados para inmunodeprimidos. preparación rápida. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 7
  8. 8. 06/12/2011 Alimentos implicados en los Síntomas de la listeriosis brotes de literiosis • La enfermedad suele cursar con síntomas gripales (fiebre, mialgia y dolor de cabeza). • Leche y productos lácteos. • Los síntomas entéricos puedan no darse o ser de carácter • Leche cruda y quesos frescos. leve. • Productos cárnicos listos para consumir. • En individuos inmunocomprometidos y en embarazadas puede haber septicemia y producirse: • Verduras y hortalizas frescas. – Meningitis y encefalitis (70% de mortalidad). • Factores que contribuyen: – Abortos, septicemia neonatal, mortalidad perinatal. – Contaminación post-tratamiento térmico. – Enfermedad gastrointestinal (30% de mortalidad en individuos inmunocomprometidos). – Almacenamiento prolongado en refrigeración. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Medidas de control Detección de Listeria monocytogenes • Saneamiento. Sembrar un asada del caldo • Buenas Practicas de Manufactura. Enriquecimiento en caldo enriquecido en una placa de Listeria agar selectivo para Listeria • Rotar los desinfectactes para Incubar por 24 h a 37°C Incubar por 24 h a 37°C evitar resistencia. • Los desinfectantes que han Pasado el tiempo se observa la mostrado mayor efectividad son Si se tuviera colonias formación de colonias. Si se sospechosas, se procederá a ven colonias verde los de amonio cuaternario. hacer pruebas bioquímicas fosforescentes (verde- para su identificación. amarillo), se sospecha de • Evitar formaciones de Listeria spp biopelículas. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Enriquecimiento Listeria Colonias verde fosforescentes sospechas de Listeria spp.Se pesan 25g se incuban en225ml de caldo deenriquecimiento para Listeria.Se incuba 24h a 37 C y luegose siembra por aislamiento enmedios selectivos ydiferenciales Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 8
  9. 9. 06/12/2011 Listeria en OXFORD Listeria en PALCAM Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Confirmación de Listeria monocytogenes Colonias de L. monocytogenes en AS L. monocytogenes muestra una zona estrecha de hemolisis alrededor de las colonias que puede ser difícil de detectar Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Prueba de CAMP - Listeria Listeria monocytogentes Movilidad en sombrilla Observe la débil hemolisis intensificada hacia S. aureus de L. TSI (A/A) monocytogenes (primera fila). Listeria monocytogentes Marcela Martínez M.Sc. SH2 (-) Marcela Martínez M.Sc.Reaccion de Voges Proskauer positiva 9
  10. 10. 06/12/2011 Azúcares Listeria Infecciones producidas por VibrioListeria monocytogenes es•Manitol (negativo)•Rhamnosa (positivo)•Xylosa - (Negativo) Marcela Martínez M.Sc. Especies patógenas transmitidas Vibrio por alimentos • Bacilos Gram negativos, rectos V. parahaemolyticus o ligeramente curvos, móviles. • Oxidasa positivos. • Metabolizan la glucosa tanto por vía oxidativa como fermentativa. V. cholerae • La mayoría de las especies son de origen marino y, salvo V. cholerae necesitan concentraciones elevadas de NaCl para crecer. Marcela Martínez M.Sc. V. vulnificus Marcela Martínez M.Sc. Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus • Dosis infectiva es relativamente alta (108 células). • Patogenicidad: • Produce gastroenteritis con – no es invasivo dolor abdominal, fiebre, vómitos y diarrea. – es enterotoxigénico – se adhiere a las células intestinales y • Es invasivo – producción de sintetiza la toxina colérica (CT) hemolisina – provoca la pérdida masiva de agua y sales minerales • Dosis mínima infectiva se • La diarrea colérica se caracteriza por la diarrea en agua de arroz y considera entre 106 y 109 consecuente deshidratación. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 10
  11. 11. 06/12/2011 Vibrio vulnificus Alimentos implicados - V. cholerae• Actúa por un mecanismo • El colera gravis es históricamente invasivo . una enfermedad transmitida por el agua.• Se asume que la dosis mínima • Pero se han responsabilizado infectiva es muy baja. alimentos: – Zumos• Usualmente causa fiebre, – Frutas escalofríos, hinchazón y – Ensaladas enrojecimiento de la piel en – Mariscos los brazos o piernas, con • Agua empleada para la ampollas pigmentadas de preparación de alimentos, lavado sangre, y baja presión arterial de utensilios y contaminación por y shock séptico-septicémico. manipuladores. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Alimentos implicados - V. parahaemolyticus Factores que afectan la supervivencia de Vibro en alimentos  Crecen entre 5 y 43°C, siendo V. cholerae el que crece a temperaturas más bajas.  Se destruyen fácilmente por calor.  Los vibrios son sensibles a dosis de 1 kgy de irradiación.  Los vibrios prefieren pHs neutros o alcalinos, pueden crecer hasta a valores de pH de 10-11.  Todos los vibrios son halotolerantes• Consumo de pescados y maricos crudos es la causa mas y crecen a concentraciones de NaCl importante. de al menos el 6%.• Pescado cocinado – falta deMartínez M.Sc. o cocción inadecuada. Marcela higiene Marcela Martínez M.Sc. Aislamiento de Vibrio Brucelosis• Enriquecimiento – Agua de peptona alcalina (pH 8,4) suplementada con NaCl al 3%• Medios de primo-aislamiento – Medio TCBS• Pruebas bioquímicas: – Lisina descarboxilasa – Ornitina descarboxilasa Zoonosis producida por – _galactosidasa microorganismos del género Brucella – Prueba oxidasa que puede además transmitirse por el – Voges proskauer Marcela Martínez M.Sc. consumo de alimentos. 11
  12. 12. 06/12/2011 Brucella Especies patógenas Bacterias Gram negativas. • Hay especies patógenas del: Aerobias – ganado vacuno (B. abortus). De forma bacilar (mayoría). Pueden vivir intracelularmente. – del ganado ovino y caprino (B. melitensis). Algunas especies son bacilos muy cortos (cocobacilos) o incluso cocos – del porcino (B. suis). que se agrupan unos a otros. Son inmóviles. • La brucelosis humana Los aislamientos humanos son asociada al consumo de oxidasa y catalasa positivos. alimentos se produce en la mayoría de los casos por B. Su crecimiento se ve favorecido por la melitensis. presencia de CO2 en la atmósfera de cultivo. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. B. melitensis Síntomas de la brucelosis • La especie mas virulenta. • Parásito intracelular del • Fase bacteriemia: Fiebre, sistema retículo endotelial. sudoración, dolor de cabeza y de las articulaciones, falta de • Capaz de evadir la respuesta apetito, fatiga, debilidad y inmune humoral. depresión. • Puede sobrevivir prolongados • Posteriormente la bacteria períodos de tiempo en el migra hacia los órganos interior de los macrófagos. reproductivos y el sistema • La especie con mayor retículo endotelial. capacidad para resistir el • La enfermedad puede entrar efecto bactericida del suero y en fase subaguda. de los fagocitos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Alimentos implicados en la Brucelosis subaguda transmisión de brucelosis • Con períodos febriles. • Consumo de alimentos • Se caracteriza por la procedentes de animales presencia de fatiga y infectados: dolor de espalda. – Leche cruda • Se produce afectación – Queso elaborado con leche del nervio ciático (B. no pasteurizado melitensis). – Queso curado • Suele durar entre 12 y 16 meses. – Carne poco cocinada. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 12
  13. 13. 06/12/2011 Detección de Brucella Síndromes producidos por• Aislamiento: Las brucelas son microorganismos delicados de crecimiento lento en el aislamiento Aeromonas, Plesiomonas, primario. Pseudomonas y otras• Medios bifásicos: Medio Castañeda sólido/líquido. Brucella crece en la interfase. bacterias• También crece en medios ricos como el agar sangre, agar chocolate o el agar tripticasa soja (TSA).• Identificación: pruebas con anticuerpos específicos anti-Brucella y crecimiento en presencia de fuscina y tionina. Marcela Martínez M.Sc. Aeromonas Aaeromonas hidrophyla• Bacilos Gram negativos • Patógeno oportunista.• Catalasa y oxidasa positivos • Mesófilo y móvil.• Con capaces de metabolizar • Capaz de producir la glucosa tanto por vía bacteriemia en individuos oxidativa como fermentativa. inmunodeprimidos y de• Casi todas las especies son contaminar heridas. flageladas y móviles. • Gastroenteritis• Especie patógena A. transmitidas por agua y hidrophyla alimentos a individuos sanos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Aislamiento de Aeromonas Gastroenteritis Filtración por membrana• Puede ocurrir de dos formas: 1. Siembra en medios selectivos con o sin enriquecimiento previo en medio líquido Caldo de Triptina Soja (TSB) – Forma colérica suplementado con Ampicilina – Forma disentérica 2. Aislamiento en placa: se utilizan para el aislamiento de• Toxinas producidas Enterobacterias, suplementados con Ampicilina: Agar Hektoen MacConkey y CIN – Enterotoxina citolítica: actividad entérica y citolítica. Afecta a la estabilidad de las membranas de las 3. Identificación con sistema multipruebas como el API 20E células eucarióticas, tiene actividad ß hemolítica. 4. Vibriostato 129:compuesto que permite diferenciar – Toxina citotónica Aeromonas de Vibrio y Plesiomonas. Aeromonas es – Toxina citotóxica resistente, mientras que los otros dos géneros son sensibles. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 13
  14. 14. 06/12/2011 Alimentos asociados con la Hábitat natural infección• Ubícua en ambientes • Carne acuáticos• Ríos y lagos • Pescados y mariscos• Aguas residuales y todo • Productos vegetales tipo de desagües frescos.• Sistemas de distribución de aguas tanto cloradas • Leche como no cloradas, de manantiales y de aguas embotelladas. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.Factores que afectan la supervivencia de Aeromonas en los alimentos Plesiomonas• Son capaces de crecer a bajas temperaturas. • Pertenecientes a la familia Vibrionaceae, de forma• Se destruyen por calor pero las curvas de supervivencia bacilar, Gram negativos y al calor son bifásicas debido a la presencia en casi todos Oxidasa positivos. los cultivos de células termorresistentes. • Se diferencia de los Vibrios por que no requiere NaCl• Son relativamente sensibles a las radiaciones (3KGY). para crecer y por su incapacidad para fermentar• No sobreviven a pHs menores de 6 el manitol.• Su crecimiento se inhibe a concentraciones de NaCl del • La mayoría de las cepas son flageladas y móviles. 5%. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Plesiomonas shigelloides Hábitat • Agua dulce y de estuarios aunque se ha aislado algunas ocasiones de agua de mar. • También habita en el intestino de todo tipo de animales. Habitante normal del intestino humano, • La enteritis se asocia al pero puede producir enteritis en humanos, consumo de agua, pescados y mariscos. normalmente de forma oportunista, en Además, pollo. niños, ancianos Marcela Martínez M.Sc. e inmunodeprimidos. Marcela Martínez M.Sc. 14
  15. 15. 06/12/2011Factores que afectan el crecimiento de Plesiomonas en los alimentos Pseudomonas• Temperatura • Bacilos Gram negativos, rectos o ligeramente curvados y – Crecen bien a 10ºC, algunas cepas crecen a 8ºC y un móviles por uno o varios porcentaje menor puede crecer a 0ºC. flagelos polares. – Temperatura ÓPTIMA de crecimiento: 37-8ºC • Bacterias quimioheterotrofas y aerobias de metabolismo – Temperatura MÁXIMA: 40-45ºC respiratorio utilizando O2 (y a veces nitrato) como aceptor de• pH electrones. • Ampliamente distribuidas en la – Plesiomonas crece bien a pH 4,5 naturaleza: suelo, el agua y el TGI de los animales incluido el hombre Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Investigación de Pseudomonas aeruginosa Pseudomona aeruginosa• Importante patógeno • Siembra en medios oportunista. selectivos con nitrofurantoína, ácido• Posee fimbrias de nalidíxico, cetrimida o adherencia y una capa algún otro antibacteriano mucilaginosa extracelular y en condiciones que interfiere la selectivas de temperatura fagocitosis. (crecimiento a 42ºC).• Indicador de calidad de • Identificación con el agua embotellada no sistema API 20NE carbonatada. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Si quieres ser sabio, aprende a interrogar razonablemente, a escuchar con atención, a responder serenamente y a callar cuando no tengas nada que decir. Johann Kaspar Lavater Marcela Martínez M.Sc. 15

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