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    Análisis microbiológico de alimentos
       Microorganismos marcadores                                          En realidad…
                                                          • La mayoría de los
                                                            alimentos
                                                            contienen
                                                            microorganismos.
                                                          • No es posible el
                                                            análisis de todos
                                                            los patógenos y de
               María Marcela Martínez Miranda
                 Magister en Microbiología
                                                            todos los
                Departamento de Ingeniería                  alterantes.
                   Universidad de Caldas                                         Marcela Martínez M.Sc.




         ¿Porqué buscar
                                                          Microorganismos marcadores
  microorganismos marcadores?
1. La detección de                                        • Son organismos (o
   patógenos puede ser muy                                  grupos) que advierten:
   complicada, muy lenta y/o
   muy costosa.                                              – manejo inadecuado
2. La investigación de                                       – presencia de
   patógenos en alimentos                                      microorganismos
   no facilita un enfoque                                      patógenos
   preventivo.
                                                          • Su detección en el
3. Calidad microbiológica en
   términos de                                              laboratorio es más
   microorganismos                                          sencilla, rápida y/o
   marcadores.                                              económica.
                      Marcela Martínez M.Sc.                                     Marcela Martínez M.Sc.




                                                          Características de un buen índice de
  Microorganismos marcadores                                  contaminación en alimentos
                       • Microorganismos cuya presencia   1. Origen específico
                         en cantidades o niveles por
                         encima de ciertos límites
     Índices             numéricos indica la posible      2. Técnicas de laboratorio
                         presencia de patógenos              fiables y rápidas
                         ecológicamente relacionados.
                                                          3. Resistencia a
                                                             condiciones ambientales
                       • Microorganismos cuya presencia      y al procesado tanto o
                         en cantidades determinadas
                         indica un tratamiento o             más que los patógenos a
  Indicadores            procesado de inocuidad              los cuales representa.
                         inadecuado.


                      Marcela Martínez M.Sc.                                     Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                  1
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Un tratamiento de
                                                    La presencia posible de                Los principales microorganismos
                                                 patógenos entéricos, es decir,
    inocuidad                                     una función de índice para
                                                      microorganismos de                    indicadores en alimentos son:
   insuficiente                                    importancia para la salud
cumpliendo de ese                                pública, como por ejemplo las

modo una función
                                                   shigelas, que se pudieran
                                                  haber originado en la zona
                                                                                    • Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de
   de indicador                                    donde fueron tratados los
                                                           camarones.                 proceso:
                                                                                        – Aerobios Mesófilos
                                                                                        – Psicrófilos y psicrotróficos
                                                                                        – Termófilos o termodúricos
                                                                                        – Mohos y levaduras
                 Un microorganismo marcador dado                                        – Coliformes totales
               puede funcionar a la vez como índice y
                          como indicador.                                           • Indicadores de contaminación fecal:
              Por ejemplo, la presencia de cantidades
              importantes de E. coli en los camarones                                   – Coliformes fecales
                  precocinados congelados indica:
                                                                                        – E. coli
                                                                                        – Enterococos
                        Marcela Martínez M.Sc.                                                                    Marcela Martínez M.Sc.
                                                                                        – Anaerobios sulfito-reductores




        Otros microorganismos                                                        Métodos de análisis microbiológico
              indicadores                                                         • Método: cualitativo
                                                                                    – PRESENCIA / AUSENCIA en
• Estafilococos coagulasa positiva                                                    25 g o mL de muestra.
  (Staphylococcus aureus)                                                               • Salmonella sp.
                                                                                        • Vibrio cholerae
• Recuento de Anaerobios Mesófilos                                                      • Listeria monocytogenes
                                                                                  • Método: cuantitativo
• Recuento de Anaerobios Esporulados                                                – Tubos múltiples: NMP/g o mL
                                                                                      de muestra
• Recuento de Virus entéricos                                                       – Recuento en placa: ufc/g o mL
                                                                                        a. Por incorporación
                                                                                        b. Por superficie
                        Marcela Martínez M.Sc.                                                                    Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                        Recuento de aerobios mesófilos
     Indicadores de condiciones de
                                                                                                    (RAM)
    manejo o de eficiencia de proceso
                                                                                   Se desarrollan en presencia de aire
    Aerobios                                                                       a temperaturas medias (25-40°C).

     mesófilos                                                                     Dan lugar a la formación de colonias
                                                                                    visibles después de 72 horas a 3Oº
    Psicrófilos y                                                                  C (ó 48 horas a 37ºC) sobre un agar
     termófilos                                                                     de recuento, incubado en
                                                                                    condiciones de aerobiosis.
    Mohos y                                                                       Indican:
     levaduras                                                                        la calidad sanitaria de un
                                                                                       alimento.
    Coliformes
                                                                                      las condiciones de manipulación.
     totales
                                                                                      las condiciones higiénicas de la
                        Marcela Martínez M.Sc.
                                                                                       materia prima.          Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                                   2
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         Aplicación del RAM                                          El RAM NO es útil para:
                                                                                                         Alimentos fermentados.
                                                                                                         Col acida, queso y otros
 Alimentos                                                                                               derivados lácteos.
  frescos,
                                                                                                         Alimentos esterilizados
  refrigerados y                                                                                          (Recuento Microscópico
  congelados.                                                                                             Directo).
                                                                                                         Alimentos deshidratados y
 Materias primas e                                                                                       congelados (Recuento
  insumos.                                                                                                Microscópico Directo).
                                                                                                         Alimentos refrigerados
 Alimentos listos                                                                                        (Recuento de
  para consumir.                                                                                          psicrotróficas).
                     Marcela Martínez M.Sc.                                               Marcela Martínez M.Sc.




 Existen dos métodos clásicos para
 el recuento de aerobios mesófilos                        RAM por el método de siembra a
                                                                   profundidad




                                              Profundidad 10 -1 (48 h)   10 -2 A (48 h)         10 -2 B (48 h)     10 -3 A (48 h)   10 -3 B (48 h)




                     Marcela Martínez M.Sc.                                               Marcela Martínez M.Sc.




     Un RAM elevado indica:                            Un RAM elevado puede significar:

                                                                                                        1. Excesiva contaminación
  En alimentos estables
                                                                                                           de la materia prima.
    – Materias primas muy contaminadas.                                                                 2. Deficiente manipulación
    – Tratamiento no satisfactorio.                                                                        durante el proceso de
                                                                                                           elaboración.
  En alimentos perecederos
                                                                                                        3. La posibilidad de que
    – Materias primas muy contaminadas.                                                                    existan patógenos, pues
                                                                                                           éstos son mesófilos.
    – Tratamiento no satisfactorio.
                                                                                                        4. La inmediata alteración
    – Almacenamiento en condiciones de                                                                     del producto.
      temperatura inadecuadas.
                     Marcela Martínez M.Sc.                                               Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                                     3
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                  Psicrotróficos                                      Psicrotróficos
• Por definición son                                 Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram
  organismos que producen                            positivos y gram negativos; aeróbos; anaerobios y
  crecimiento visible a 7o C                         anaerobios facultativos.
  1o C dentro de 7 a 10                               – Aeromonas
  días, independiente de su
                                                      – Bacillus
  temperatura de crecimiento
  óptima.                                             – Clostridium
                                                      – Lactobacillus
• Los organismos
  mayormente asociados con                            – Escherichia
  alimentos refrigerados y                            – Listeria
  que causan daño son
                                                      – Serratia, ect.
  psicrotróficos y no
  psicrofílicos                                       – Hongos y levaduras
                          Marcela Martínez M.Sc.                               Marcela Martínez M.Sc.




                                                                      Psicrotróficos
     Psicotróficos patógenos                                       Métodos de detección
 Patógenos
                                                   • Cultivo durante 10 días
  – Aeromonas hydrophila
                                                     a 7oC para siembra en
  – Bacillus cereus (algunas                         profundidad.
    cepas)
  – Clostridium botulinum type E,                  • Cultivo durante 7-8
    ByF                                              días a 7o C para
                                                     siembra en superficie
  – Listeria monocytogenes
  – Vibrio cholerae                                • Cultivo durante16 hr a
                                                     17O C seguido de 3
  – Yersinia enterocolítica
                                                     días a 7oC
  – Escherichia coli (algunas
    cepas)
                          Marcela Martínez M.Sc.                               Marcela Martínez M.Sc.




                  Termodúricos                                        Termodúricos
  Organismos que                                               Género                           Alimento asociado
                                                               Actinomycetes                    Leche
  pueden tolerar calor y
                                                               Alcaligenes                      Leche
  por consiguiente
                                                               Arthrobacter                     Leche
  tienen la capacidad
                                                               Bacillus                         Leche/huevos
  de sobrevivir
                                                               Clostridium                      Leche
  pausterización. Son                                          Coryneform                       Huevos
  capaces de sobrevivir                                        Lactobacillus                    Leche/carne/jugos
  el calentamiento de                                          Microbacterium                   Leche
  un alimento a                                                Micrococcus                      Leche/huevos
  temperaturas de 60 a                                         Pseudomonas                      Huevos
  80OC.                                                        Streptococcus/                Leche/carne/huevo
                          Marcela Martínez M.Sc.                            Marcela Martínez M.Sc.
                                                               Enterococcus




                                                                                                                            4
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                    Coliformes
 Bacilos Gram negativos
 No esporulados
 Aerobios o anaerobios
  facultativos
 Fermentan la lactosa a 35⁰C
  con producción de ácido y
  gas
 Viven en el ambiente y en
  animales de sangra caliente
 Los coliformes totales
  incluyen los fecales
                           Marcela Martínez M.Sc.                              Marcela Martínez M.Sc.




      Son algunas especies que
      pertenecen a los géneros:
Género                      Fuente
                            Heces (humanas y
Escherichia
                            animales)
Klebsiella                  Heces, ambiente

Enterobacter                Heces, ambiente

Citrobacter                 Ambiente
                           Marcela Martínez M.Sc.                              Marcela Martínez M.Sc.




   Coliformes como indicadores de                        Aplicación del uso de Coliformes
          contaminación fecal                                   como indicadores
• Se encuentran en el intestino del hombre y de          1. Detección de prácticas sanitarias deficientes en el
  animales, pero también en otros ambientes                 manejo y en la fabricación de los alimentos.
  como: suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.
                                                         2. Evaluación de la calidad microbiológica de un
• Son útiles como indicadores de contaminación              producto.
  fecal por:                                             3. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias
   – Su frecuencia en heces                                 e higiénicas en el equipo.
   – Su fácil detección en el laboratorio                4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de
   – Sus características semejantes a algunos miembros      agua utilizados en las diferentes áreas del
     patógenos de la familia Enterobacteriaceae             procesamiento de alimentos.
                           Marcela Martínez M.Sc.                              Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                       5
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         Pruebas de determinación de                                  Pruebas para detección y
                 Coliformes                                            recuento de Coliformes
1.       Investigación y recuento en                          1. Prueba presuntiva
         medio líquido
     •      Se usa el Caldo
                                                                  – Caldo Lauril Triptosa (CLT).
            lactosado biliado verde                               – Caldo Mc. Conkey.
            brillante (Brilliant Green
            Bile Lactose: BGBL)                                   – Caldo lactosado bilis verde brillante.
2.       Investigación y recuento en                          2. Prueba confirmativa:
         medio sólido
     •      Se utiliza el medio                                   – Medio EC.
            selectivo agar biliado                                – Medio bilis lactosa (BLVB)
            rojo-violeta (Violet Red
            Bile Agar: VRBA)
                                Marcela Martínez M.Sc.                                   Marcela Martínez M.Sc.




           Investigación y recuento en
                                                                      Coliformes fecales (CF)
                   medio sólido
                                                              Origen intestinal
 Coliformes totales
  en placas de agar                                           Pertenecen a la familia
                                                               Enterobacteriaceae
  bilis rojo violeta,
  incubadas por 24 h                                          Bacilos Gram negativos,
  a 35 ºC                                                      anaerobios facultativos, no
                                                               esporulados.
 UFC/g (o/mL) de
                                                              Fermentadores de lactosa a
  muestra.                                                     44.5 °C con producción de gas.

                                                              Principalmente Escherichia coli
                                                               (90%)
                                Marcela Martínez M.Sc.                                   Marcela Martínez M.Sc.




                   Determinación de CF                                Escherichia coli (coliformes
                                                                           termotolerantes)
                                                             • Capacidad para producir
                                                               indol a partir de triptófano

                                                             • Producción de la enzima β-
                                                               glucuronidasa.

                                                             • Es el índice de
                                                               contaminación fecal más
                                                               adecuado.

                                                             • Hay grandes cantidades de
                                                               Escherichia coli en las
     Su determinación se hace a partir de la segunda etapa     heces humanas y
     (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo     animales.
     lactosado con incubación a 44.5 °C.
                          Marcela Martínez M.Sc.                                         Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                          6
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       Determinación de E. coli                                          Recuento de Enterobacterias
                                                                        • Familia
• Métodos basados en:                                                     Enterobacteriaceae
   – Producción de ácido y gas a partir
     de la lactosa.
                                                                        • Lactosa + y lactosa -

   – Producción de la enzima β-                                         • Se usan como grupo
     glucuronidasa.                                                       indicador en lugar del
                                                                          grupo de coliformes
• Los procedimientos incluyen:                                            totales.
   – Filtración con una membrana que                                    • Son de origen fecal y
     después se incuba en medios
     selectivos a 44–45 °C.
                                                                          no fecal.

   – «número más probable»
                           Marcela Martínez M.Sc.                                                 Marcela Martínez M.Sc.




 Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias                  Qué indica niveles altos de Enterobacteiras en
     como indicadoras en lugar de los coliformes                                    alimentos procesados?

 1. Los coliformes son un                                               • Tratamiento inadecuado y/o
    grupo mal definido                                                    contaminación posterior al
    taxonómicamente.                                                      tratamiento; más
                                                                          frecuentemente a partir de
 2. Los coliformes solo                                                   materias primas, equipos
    tienen en cuenta las                                                  sucios o manejo no
                                                                          higiénico
    enterobacterias
    lactosa positiva.                                                   • Multiplicación microbiana
                                                                          que pudiera haber permitido
 3. Las Enterobacterias                                                   el crecimiento de toda la
    son mas resistentes                                                   serie de microorganismos
    que los coliformes.                                                   patógenos y toxigénicos.

                           Marcela Martínez M.Sc.                                                 Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                  Estreptococos fecales
        Métodos para el recuento de
             Enterobacterias
                                                                                      Enterococcus
                                                                        • Se encuentran en las heces
 • Método de                                                              de los humanos y animales
                                                                          de sangre caliente.
   recuento
                                                                        • Animales de producción:
    – Recuento en                                                         vaca, cerdo, oveja, caballo,
      placa                                                               gallina y pato.
    – Recuento en                                                       • Son importantes en
      medio líquido                                 Confirmación con      situaciones donde se sabe
                                                    prueba de oxidasa     que hay contaminación
 • Método de                      VRBG Agar
                                                                          fecal y no se detectan
   ausencia                                                               coliformes.
   presencia
                           Marcela Martínez M.Sc.                                                 Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                   7
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           Uso de Enterococcus como
            indicadores en alimentos
                                                                                    Especies de Enterococcus
• Aunque se encuentran
                                                                               Grupo         Especies                         Hábitat
  en cantidades menores
  que E. coli, son mas                                                                       Enterococcus faecalis
                                                                                                                              están normalmente
  resistentes.                                                                 Grupo 1       Enterococcus faecium             presentes en las heces de
                                                                                                                              humanos y animales
• Se consideran                                                                              Enterococcus durans
  indicadores en alimentos                                                                   Streptococcus bovis
  procesados, como                                                                           Streptococcus equinus            no se encuentran
  lácteos y cárnicos, en                                                       Grupo 2                                        comúnmente en las heces
                                                                                             Enterococcus avium               humanas
  los cuales E. coli no
  puede sobrevivir.

                              Marcela Martínez M.Sc.                                                        Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                    Recuento de esporas de Clostridium
 Clostridium sulfito reductores                                                             sulfito reductores
                                                                               Se pesan 10g o ml y se homogenizan        Se realizan diluciones seriadas en
 • Bacterias Grampositivas,                                                    con 90ml de peptona 0.1%                  9ml peptona 0.1%
   esporuladas, anerobias,
   reductoras de sulfitos.
 • Se utilizan como
   indicadores de
   contaminación fecal
   antigua.
 • Clostridium perfringens es
   de origen fecal y también se
   encuentra ampliamente
   distribuida en la naturaleza.
                              Marcela Martínez M.Sc.                                                        Marcela Martínez M.Sc.




    Choque térmico para formación de
                esporas                                                            Siembra en fondo en agar SPS




Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10              Se siembra 1ml en fondo de la dilución
minutos para hacer luego el choque térmico y activar las esporas.                     que ha sido sometida a choque térmico
                               Marcela Martínez M.Sc.                                 y se agrega el medio SPS caliente. M.Sc.
                                                                                                            Marcela Martínez
Para finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.




                                                                                                                                                                 8
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 Incubación en anaerobiosis                                                          Mohos y levaduras
                         Se llevan a incubar las cajas en cámara       Unicelulares                                 hongos filamentosos
                         de anaerobiosis por 72 horas a 37 C,
                         con sobre generador de anaerobiosis e
                         indicador atmosférico.




                                                                   •    Crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que
                                                                        conservan humedad.
                                                                   •    Las levaduras crecen mas rápidamente que los mohos, pero con frecuencia
                                                                        junto a ellos.
                                                                   •    Mohos son aerobios estrictos.
                          Marcela Martínez M.Sc.                                                  Marcela Martínez M.Sc.
                                                                   •    Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentación).




Mohos y levaduras en alimentos                                         Recuento de mohos y levaduras
 Importantes en alimentos                                          • Se desarrollan en
 ácidos y en los de baja                                             condiciones de aerobiosis.
 actividad de agua:
                                                                   • A temperaturas que varían
 – Frutas frescas                                                    entre 20 y 30⁰C.
 – Jugos
 – Vegetales                                                       • Crecen más lentamente
                                                                     que las bacterias.
 – Quesos
 – Cereales                                                        • Los medios de cultivo
 – Alimentos salazonados                                             deben favorecer su
                                                                     desarrollo pero no el de las
 – Encurtidos
                                                                     bacterias.
 – Alimentos congelados y
   deshidratados      Marcela Martínez M.Sc.                                                      Marcela Martínez M.Sc.




Medios de cultivo para mohos                                           Recuento de mohos y levaduras
                                                                   Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC – 100 UFC
                     Agar de Sabouraud
                                                                   Se reportan indistintamente mohos y levaduras
                     Agar papa dextrosa
                   Agar extracto de malta
                       Agar Czapek-Dox
                Agar Micosel o micobiótico
                      BHI + antibióticos
                                 BHI
                          Marcela Martínez M.Sc.                                                  Marcela Martínez M.Sc.




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06/12/2011




“La misión de la vida es descubrir la vocación y luego
entregarse a ella con todo el corazón”
                    Marcela Martínez M.Sc.
                                                   Buda




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Microorganismos marcadores en alimentos

  • 1. 06/12/2011 Análisis microbiológico de alimentos Microorganismos marcadores En realidad… • La mayoría de los alimentos contienen microorganismos. • No es posible el análisis de todos los patógenos y de María Marcela Martínez Miranda Magister en Microbiología todos los Departamento de Ingeniería alterantes. Universidad de Caldas Marcela Martínez M.Sc. ¿Porqué buscar Microorganismos marcadores microorganismos marcadores? 1. La detección de • Son organismos (o patógenos puede ser muy grupos) que advierten: complicada, muy lenta y/o muy costosa. – manejo inadecuado 2. La investigación de – presencia de patógenos en alimentos microorganismos no facilita un enfoque patógenos preventivo. • Su detección en el 3. Calidad microbiológica en términos de laboratorio es más microorganismos sencilla, rápida y/o marcadores. económica. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Características de un buen índice de Microorganismos marcadores contaminación en alimentos • Microorganismos cuya presencia 1. Origen específico en cantidades o niveles por encima de ciertos límites Índices numéricos indica la posible 2. Técnicas de laboratorio presencia de patógenos fiables y rápidas ecológicamente relacionados. 3. Resistencia a condiciones ambientales • Microorganismos cuya presencia y al procesado tanto o en cantidades determinadas indica un tratamiento o más que los patógenos a Indicadores procesado de inocuidad los cuales representa. inadecuado. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 1
  • 2. 06/12/2011 Un tratamiento de La presencia posible de Los principales microorganismos patógenos entéricos, es decir, inocuidad una función de índice para microorganismos de indicadores en alimentos son: insuficiente importancia para la salud cumpliendo de ese pública, como por ejemplo las modo una función shigelas, que se pudieran haber originado en la zona • Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de de indicador donde fueron tratados los camarones. proceso: – Aerobios Mesófilos – Psicrófilos y psicrotróficos – Termófilos o termodúricos – Mohos y levaduras Un microorganismo marcador dado – Coliformes totales puede funcionar a la vez como índice y como indicador. • Indicadores de contaminación fecal: Por ejemplo, la presencia de cantidades importantes de E. coli en los camarones – Coliformes fecales precocinados congelados indica: – E. coli – Enterococos Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. – Anaerobios sulfito-reductores Otros microorganismos Métodos de análisis microbiológico indicadores • Método: cualitativo – PRESENCIA / AUSENCIA en • Estafilococos coagulasa positiva 25 g o mL de muestra. (Staphylococcus aureus) • Salmonella sp. • Vibrio cholerae • Recuento de Anaerobios Mesófilos • Listeria monocytogenes • Método: cuantitativo • Recuento de Anaerobios Esporulados – Tubos múltiples: NMP/g o mL de muestra • Recuento de Virus entéricos – Recuento en placa: ufc/g o mL a. Por incorporación b. Por superficie Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Recuento de aerobios mesófilos Indicadores de condiciones de (RAM) manejo o de eficiencia de proceso  Se desarrollan en presencia de aire  Aerobios a temperaturas medias (25-40°C). mesófilos  Dan lugar a la formación de colonias visibles después de 72 horas a 3Oº  Psicrófilos y C (ó 48 horas a 37ºC) sobre un agar termófilos de recuento, incubado en condiciones de aerobiosis.  Mohos y  Indican: levaduras  la calidad sanitaria de un alimento.  Coliformes  las condiciones de manipulación. totales  las condiciones higiénicas de la Marcela Martínez M.Sc. materia prima. Marcela Martínez M.Sc. 2
  • 3. 06/12/2011 Aplicación del RAM El RAM NO es útil para:  Alimentos fermentados.  Col acida, queso y otros  Alimentos derivados lácteos. frescos,  Alimentos esterilizados refrigerados y (Recuento Microscópico congelados. Directo).  Alimentos deshidratados y  Materias primas e congelados (Recuento insumos. Microscópico Directo).  Alimentos refrigerados  Alimentos listos (Recuento de para consumir. psicrotróficas). Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Existen dos métodos clásicos para el recuento de aerobios mesófilos RAM por el método de siembra a profundidad Profundidad 10 -1 (48 h) 10 -2 A (48 h) 10 -2 B (48 h) 10 -3 A (48 h) 10 -3 B (48 h) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Un RAM elevado indica: Un RAM elevado puede significar: 1. Excesiva contaminación  En alimentos estables de la materia prima. – Materias primas muy contaminadas. 2. Deficiente manipulación – Tratamiento no satisfactorio. durante el proceso de elaboración.  En alimentos perecederos 3. La posibilidad de que – Materias primas muy contaminadas. existan patógenos, pues éstos son mesófilos. – Tratamiento no satisfactorio. 4. La inmediata alteración – Almacenamiento en condiciones de del producto. temperatura inadecuadas. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 3
  • 4. 06/12/2011 Psicrotróficos Psicrotróficos • Por definición son Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram organismos que producen positivos y gram negativos; aeróbos; anaerobios y crecimiento visible a 7o C anaerobios facultativos. 1o C dentro de 7 a 10 – Aeromonas días, independiente de su – Bacillus temperatura de crecimiento óptima. – Clostridium – Lactobacillus • Los organismos mayormente asociados con – Escherichia alimentos refrigerados y – Listeria que causan daño son – Serratia, ect. psicrotróficos y no psicrofílicos – Hongos y levaduras Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Psicrotróficos Psicotróficos patógenos Métodos de detección Patógenos • Cultivo durante 10 días – Aeromonas hydrophila a 7oC para siembra en – Bacillus cereus (algunas profundidad. cepas) – Clostridium botulinum type E, • Cultivo durante 7-8 ByF días a 7o C para siembra en superficie – Listeria monocytogenes – Vibrio cholerae • Cultivo durante16 hr a 17O C seguido de 3 – Yersinia enterocolítica días a 7oC – Escherichia coli (algunas cepas) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Termodúricos Termodúricos Organismos que Género Alimento asociado Actinomycetes Leche pueden tolerar calor y Alcaligenes Leche por consiguiente Arthrobacter Leche tienen la capacidad Bacillus Leche/huevos de sobrevivir Clostridium Leche pausterización. Son Coryneform Huevos capaces de sobrevivir Lactobacillus Leche/carne/jugos el calentamiento de Microbacterium Leche un alimento a Micrococcus Leche/huevos temperaturas de 60 a Pseudomonas Huevos 80OC. Streptococcus/ Leche/carne/huevo Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Enterococcus 4
  • 5. 06/12/2011 Coliformes  Bacilos Gram negativos  No esporulados  Aerobios o anaerobios facultativos  Fermentan la lactosa a 35⁰C con producción de ácido y gas  Viven en el ambiente y en animales de sangra caliente  Los coliformes totales incluyen los fecales Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Son algunas especies que pertenecen a los géneros: Género Fuente Heces (humanas y Escherichia animales) Klebsiella Heces, ambiente Enterobacter Heces, ambiente Citrobacter Ambiente Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Coliformes como indicadores de Aplicación del uso de Coliformes contaminación fecal como indicadores • Se encuentran en el intestino del hombre y de 1. Detección de prácticas sanitarias deficientes en el animales, pero también en otros ambientes manejo y en la fabricación de los alimentos. como: suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. 2. Evaluación de la calidad microbiológica de un • Son útiles como indicadores de contaminación producto. fecal por: 3. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias – Su frecuencia en heces e higiénicas en el equipo. – Su fácil detección en el laboratorio 4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de – Sus características semejantes a algunos miembros agua utilizados en las diferentes áreas del patógenos de la familia Enterobacteriaceae procesamiento de alimentos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 5
  • 6. 06/12/2011 Pruebas de determinación de Pruebas para detección y Coliformes recuento de Coliformes 1. Investigación y recuento en 1. Prueba presuntiva medio líquido • Se usa el Caldo – Caldo Lauril Triptosa (CLT). lactosado biliado verde – Caldo Mc. Conkey. brillante (Brilliant Green Bile Lactose: BGBL) – Caldo lactosado bilis verde brillante. 2. Investigación y recuento en 2. Prueba confirmativa: medio sólido • Se utiliza el medio – Medio EC. selectivo agar biliado – Medio bilis lactosa (BLVB) rojo-violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Investigación y recuento en Coliformes fecales (CF) medio sólido  Origen intestinal Coliformes totales en placas de agar  Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae bilis rojo violeta, incubadas por 24 h  Bacilos Gram negativos, a 35 ºC anaerobios facultativos, no esporulados. UFC/g (o/mL) de  Fermentadores de lactosa a muestra. 44.5 °C con producción de gas.  Principalmente Escherichia coli (90%) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Determinación de CF Escherichia coli (coliformes termotolerantes) • Capacidad para producir indol a partir de triptófano • Producción de la enzima β- glucuronidasa. • Es el índice de contaminación fecal más adecuado. • Hay grandes cantidades de Escherichia coli en las Su determinación se hace a partir de la segunda etapa heces humanas y (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo animales. lactosado con incubación a 44.5 °C. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 6
  • 7. 06/12/2011 Determinación de E. coli Recuento de Enterobacterias • Familia • Métodos basados en: Enterobacteriaceae – Producción de ácido y gas a partir de la lactosa. • Lactosa + y lactosa - – Producción de la enzima β- • Se usan como grupo glucuronidasa. indicador en lugar del grupo de coliformes • Los procedimientos incluyen: totales. – Filtración con una membrana que • Son de origen fecal y después se incuba en medios selectivos a 44–45 °C. no fecal. – «número más probable» Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias Qué indica niveles altos de Enterobacteiras en como indicadoras en lugar de los coliformes alimentos procesados? 1. Los coliformes son un • Tratamiento inadecuado y/o grupo mal definido contaminación posterior al taxonómicamente. tratamiento; más frecuentemente a partir de 2. Los coliformes solo materias primas, equipos tienen en cuenta las sucios o manejo no higiénico enterobacterias lactosa positiva. • Multiplicación microbiana que pudiera haber permitido 3. Las Enterobacterias el crecimiento de toda la son mas resistentes serie de microorganismos que los coliformes. patógenos y toxigénicos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Estreptococos fecales Métodos para el recuento de Enterobacterias Enterococcus • Se encuentran en las heces • Método de de los humanos y animales de sangre caliente. recuento • Animales de producción: – Recuento en vaca, cerdo, oveja, caballo, placa gallina y pato. – Recuento en • Son importantes en medio líquido Confirmación con situaciones donde se sabe prueba de oxidasa que hay contaminación • Método de VRBG Agar fecal y no se detectan ausencia coliformes. presencia Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 7
  • 8. 06/12/2011 Uso de Enterococcus como indicadores en alimentos Especies de Enterococcus • Aunque se encuentran Grupo Especies Hábitat en cantidades menores que E. coli, son mas Enterococcus faecalis están normalmente resistentes. Grupo 1 Enterococcus faecium presentes en las heces de humanos y animales • Se consideran Enterococcus durans indicadores en alimentos Streptococcus bovis procesados, como Streptococcus equinus no se encuentran lácteos y cárnicos, en Grupo 2 comúnmente en las heces Enterococcus avium humanas los cuales E. coli no puede sobrevivir. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Recuento de esporas de Clostridium Clostridium sulfito reductores sulfito reductores Se pesan 10g o ml y se homogenizan Se realizan diluciones seriadas en • Bacterias Grampositivas, con 90ml de peptona 0.1% 9ml peptona 0.1% esporuladas, anerobias, reductoras de sulfitos. • Se utilizan como indicadores de contaminación fecal antigua. • Clostridium perfringens es de origen fecal y también se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Choque térmico para formación de esporas Siembra en fondo en agar SPS Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 Se siembra 1ml en fondo de la dilución minutos para hacer luego el choque térmico y activar las esporas. que ha sido sometida a choque térmico Marcela Martínez M.Sc. y se agrega el medio SPS caliente. M.Sc. Marcela Martínez Para finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo. 8
  • 9. 06/12/2011 Incubación en anaerobiosis Mohos y levaduras Se llevan a incubar las cajas en cámara Unicelulares hongos filamentosos de anaerobiosis por 72 horas a 37 C, con sobre generador de anaerobiosis e indicador atmosférico. • Crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que conservan humedad. • Las levaduras crecen mas rápidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a ellos. • Mohos son aerobios estrictos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. • Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentación). Mohos y levaduras en alimentos Recuento de mohos y levaduras Importantes en alimentos • Se desarrollan en ácidos y en los de baja condiciones de aerobiosis. actividad de agua: • A temperaturas que varían – Frutas frescas entre 20 y 30⁰C. – Jugos – Vegetales • Crecen más lentamente que las bacterias. – Quesos – Cereales • Los medios de cultivo – Alimentos salazonados deben favorecer su desarrollo pero no el de las – Encurtidos bacterias. – Alimentos congelados y deshidratados Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Medios de cultivo para mohos Recuento de mohos y levaduras Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC – 100 UFC Agar de Sabouraud Se reportan indistintamente mohos y levaduras Agar papa dextrosa Agar extracto de malta Agar Czapek-Dox Agar Micosel o micobiótico BHI + antibióticos BHI Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 9
  • 10. 06/12/2011 “La misión de la vida es descubrir la vocación y luego entregarse a ella con todo el corazón” Marcela Martínez M.Sc. Buda 10

Notas del editor

  1. La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos productos. En realidad, si se exceptúa el reducido número de productos esterilizados, cada bocado de alimento contiene levaduras inocuas, mohos, bacterias y otros microorganismos. La mayor parte de los alimentos se convierten en potencialmente peligrosos para el consumidor sólo después de que han sido violados los principios de higiene, limpieza y desinfección. Si los alimentos han estado sometidos a condiciones que pudieran haber permitido la llegada a los mismos y/o la multiplicación de agentes infecciosos o toxigénicos, pueden constituirse en vehículo de transmisión de enfermedades., tales como la salmonelosis o la intoxicación estafilocócica. La puesta en evidencia de estos riesgos se basa en el examen de muestras de alimentos para en busca de los propios agentes causales o de indicadores de una contaminación no admisible con lo que se busca determinar la calidad de los mismos.
  2. La calidad microbiológica de los alimentos es fundamental porque influye en su conservación y vida de anaquel y, sobre todo, porque los microorganismos presentes en ellos, pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por alimentos ó ETA’s (en inglés se denominan “foodborne illness” ó FBI).
  3. La detección en el laboratorio de los microorganismos patógenos puede ser muy complicada, muy lenta y/o muy costosa para determinaciones rutinarias. Además, es concluyente cuando se encuentra un microorganismo patógeno pero puede haber casos en que no se detecte por razones circunstanciales como el clima o la cantidad de individuos infectados que están contaminando, a pesar de que el manejo del alimento implique el riesgo de que el patógeno aparezca en cualquier momento. En todo caso, la investigación de microorganismos patógenos en alimentos no facilita un enfoque preventivo.
  4. Los indicadores son organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementan el riesgo de presencia de microorganismos patógenos en alimentos. Además de que su detección en el laboratorio es más sencilla, rápida y/o económica, los microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevención de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o contaminación.
  5. Conocer las fuentes de contaminación del alimento que se analiza. Valorar las normas de higiene utilizadas en la elaboración y manipulación de los alimentos. Detectar la posible presencia de flora patógena que suponga un riesgo para la salud del consumidor. Establecer en qué momento se producen fenómenos de alteración en los distintos alimentos, con el fin de delimitar su periodo de conservación.
  6. Criterios Microbiológicos Un criterio microbiológico para alimentos define la aceptabilidad de un proceso, producto o lote de alimentos basándose en la ausencia o presencia o el número de microorganismos y/o la investigación de sus toxinas por unidad de masa, volumen o área. Un criterio microbiológico, según se detalla en “Principios para el Diseño y la Aplicación de Criterios Microbiológicos Para Alimentos” - Codex Alimentarius Commission, consiste en: - señalar el alimento al que se aplicará el criterio, - elección de microorganismos y/o sus toxinas/ metabolitos a identificar y la razón de la elección para el producto, - un plan de muestreo indicando el número de muestras a tomar, el tamaño de la misma y las características de la unidad analítica, - los métodos para su detección y/o cuantificación, - los límites microbiológicos considerados apropiados para el alimento en el punto indicado de la cadena alimentaria, - el número de unidades analíticas donde se debe verificar el cumplimiento de dichos límites.
  7. La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los riesgos implicados y de lo que se requiera saber para liberar, controlar o mejorar el alimento, manteniendo el enfoque preventivo.
  8. En este grupo se incluyen todas las bacterias capaces de desarrollarse a 30 - 37°C en las condiciones establecidas. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima.
  9. Se lleva a cabo a partir de diluciones decimales de la muestra, que se inoculan en placas vertidas de agar triptona glucosa extracto o agar cuenta estándar. Las placas se incuban en condiciones de aerobiosis, a 35 °C durante 24 a 48 horas. Es importante aplicar las reglas para el recuento, de la NOM-092-SSA1- 1994. Bienes y Servicios. Método para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.
  10. Los mohos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, por lo que son frecuentes en la microbiota habitual de muchos alimentos; se dispersan fácilmente por el aire y el polvo. Ciertas especies de mohos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición. .
  11. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde las condiciones no favorecen el crecimiento bacteriano, por ejemplo: pH ácido, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, presencia de antibióticos u otros antibacterianos. Las levaduras y los mohos crecen mas lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que conservan humedad y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos. Sin embargo, en los alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua, crecen con mayor rapidez que las bacterias, determinando por ello importantes pérdidas por la alteración de frutas frescas y jugos, vegetales, quesos, productos cerealícolas, alimentos salazonados y encurtidos, así como en los alimentos congelados y en los deshidratados, cuyo almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas. Además, existe el peligro potencial de producción de micotoxinas por parte de los mohos.
  12. Como grupo indicador son útiles para evidenciar grado general de contaminación en alimentos con estas características o cuando los mesófilos aerobios no son útiles, como en alimentos fermentados. También son indicadores del riesgo de desarrollo de hongos toxigénicos en alimentos como frutos secos, especias, cereales y otros granos, y sus derivados. Para estudiar los mohos se usan los mismos métodos generales de cultivo que para las bacterias. Casi todos, se desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medios de cultivos bacteriológicos usuales, a temperaturas que varían entre 20 y 30 ºC. La mayor parte lo hacen mas lentamente que las bacterias, y así, cuando llegan a coexistir, el desarrollo de estas sobrepasa con creces el de los mohos. Si se quiere aislar los mohos, resulta muy práctico usar un medio de cultivo que favorezca su desarrollo pero que no sea óptimo para las bacterias. Medios ácidos ( ph 5,6) con concentraciones relativamente elevadas de azúcar con tolerados bien por los mohos pero inhiben muchas bacterias.
  13. Un medio natural de amplio uso para el cultivo de los hongos es una infusión de maíz al que se le adiciona agar y glucosa. Otro medio de cultivo para los mohos y levaduras contiene infusión de papa con agar y glucosa. Muchas fórmulas de los medios de cultivos para los mohos y levaduras contienen peptona, algún carbohidrato y agar; en cambio , los medios para los hongos patógenos necesitan ser enriquecidos con otras sustancias. Uno de los medios de cultivos mas conocido y antiguo para cultivar hongos Sabouraud, y contiene maltosa y peptona con sus ingredientes principales, pero fue modificado y ahora en Estados Unidos se usa uno que solo contiene glucosa. Este medio se utiliza mucho para aislar mohos y ciertas levaduras; además es muy útil para el crecimiento de hongos patógenos a partir del cuerpo y exudados. Su acción selectiva parcial se debe a su alta concentración de azúcar y bajo pH.
  14. El recuento se lleva a cabo a partir de diluciones decimales de la muestra, que se inoculan en placas vertidas de papa dextrosa agar (PDA) y agar extracto de malta (AEM) acidificados con ácido tartárico, para favorecer a los hongos y levaduras e inhibir bacterias (NOM-111-SSA1-1994. Bienes y Servicios . Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos). En algunos casos, se utilizan antibióticos para hacer más selectivo el medio de cultivo.
  15. La definición generalmente aceptada para el término “coliformes” describe a estos microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, aunque algunos pueden ser fermentadores tardíos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia , respectivamente. La mayoría de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo Escherichia coli . Por esta razón, su presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo más ampliamente utilizado en la microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. Como los coliformes también pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre coliformes totales y coliformes fecales. Esta práctica se refiere a coliformes totales.
  16. Incluye los géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Durante mucho tiempo se consideraron evidencia de contaminación fecal, pero se ha demostrado que muchos de ellos pueden vivir e incluso crecer en el suelo, el agua y otros ambientes. Actualmente se consideran un excelente indicador de la eficiencia de los procesos de sanitización y desinfección, así como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos procesados.
  17. Ser un habitante normal de la flora intestinal de individuos sanos. Estar presente, de forma exclusiva, en las heces de animales homeotérmicos. Estar presente cuando los microorganismos patógenos intestinales lo están. Presentarse en número elevado, facilitando su aislamiento e identificación. Debe ser incapaz de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos. Su tiempo de supervivencia debe ser igual o un poco superior al de las bacterias patógenas, su resistencia a los factores ambientales debe ser igual o superior al de los patógenos de origen fecal. Debe ser fácil de aislar y cuantificar. No debe ser patógeno.
  18. Detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos. Evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de origen no-fecal. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.
  19. Su determinación se basa generalmente en la capacidad de fermentar lactosa. Se pueden utilizar los métodos del número más probable (NMP ó MPN por sus siglas en inglés) que es un método estadístico en tres etapas y permite el hallazgo de cantidades muy bajas de coliformes. También se pueden detectar por cuenta en placa utilizando agar bilis-rojo violeta (ABRV ó RVBA por sus siglas en inglés) en el cual las colonias fermentadoras de lactosa causan el vire del indicador; pueden detectarse por filtración en membrana ( Millipore ) e incubación en medios adecuados, por métodos rápidos como Petrifilm y reacciones cromogénicas o fluorogénicas.
  20. No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo tanto, los coliformes totales —que comprende la totalidad del grupo— y los coliformes fecales —aquellos de origen intestinal—. Dentro del grupo coliforme, los de origen fecal son capaces de fermentar la lactosa también a 44.5 °C; se consideran el indicador más adecuado de contaminación con heces de animales y humanos, por ejemplo en pescados y mariscos, carnes, leche, alimentos RTE, entre otros. La determinación se hace a partir de la segunda etapa (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo lactosado con incubación a 44.5 °C. Este análisis permite descartar a Enterobacter , puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio crecerán en el medio de cultivo principalmente Escherichia coli (90%) y algunas bacterias de los géneros Klebsiella y Citrobacter . La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90% de probabilidad de que el coliforme aislado sea E. coli .
  21. No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo tanto, los coliformes totales —que comprende la totalidad del grupo— y los coliformes fecales —aquellos de origen intestinal—. Dentro del grupo coliforme, los de origen fecal son capaces de fermentar la lactosa también a 44.5 °C; se consideran el indicador más adecuado de contaminación con heces de animales y humanos, por ejemplo en pescados y mariscos, carnes, leche, alimentos RTE, entre otros. La determinación se hace a partir de la segunda etapa (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo lactosado con incubación a 44.5 °C. Este análisis permite descartar a Enterobacter , puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio crecerán en el medio de cultivo principalmente Escherichia coli (90%) y algunas bacterias de los géneros Klebsiella y Citrobacter . La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90% de probabilidad de que el coliforme aislado sea E. coli .
  22. Los Estreptococos fecales, actualizados taxonómicamente como Enterococcus incluyen un número de especies que se encuentran en las heces de los humanos y animales de sangre caliente. Esto es muy importante, ya que la contaminación fecal causada por animales puede involucrar riesgos sanitarios, por lo que hay que tener en cuenta los microorganismos más abundantes frecuentes en las heces de los animales, sobre todo en los de producción; vaca, cerdo, oveja, caballo, gallina y pato. En todos ellos se encuentran coliformes y Estreptococos fecales, aunque son más abundantes los estreptococos fecales. Los Estreptococos fecales no se multiplican en el medio ambiente, o si esto ocurre es solamente en raras ocasiones, son más persistentes en ambientes acuáticos y en suelos contaminados que E. coli. Son importantes en situaciones donde se sabe que hay contaminación fecal y no se detectan coliformes, como ocurre cuando las descargas son intermitentes o más antiguas, de modo que mueren los coliformes fecales y E. coli, y permanecen los estreptococos. Aunque se encuentran en cantidades menores por un orden de magnitud, en comparación con E. coli, tienen algunas ventajas como su mayor supervivencia. Se consideran indicadores en alimentos procesados, como lácteos y cárnicos, en los cuales E. coli puede no sobrevivir .
  23. Las especies de Enterococcus que están presentes en las heces y que se encuentran en aguas contaminadas pueden ser divididas en dos grupos: en el primer grupo se encuentran Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium y Enterococcus durans, estos organismos están normalmente presentes en las heces de humanos y animales, el segundo grupo incluye Streptococcus bovis, Streptococcus equinus y Enterococcus avium, estos organismos no se encuentran comúnmente en las heces humanas. La identificación de la especie puede ser un mejor indicativo de la fuente de contaminación (27).
  24. Los Clostridium sulfito reductores, por ser productores de esporas, tienen una mayor resistencia a las condiciones ambientales y a la desinfección por lo que se utilizan como indicadores de contaminación fecal antigua (29). El número de Clostridium en agua es mucho menor que el de Coliformes y Streptococcus, por esto no sustituyen a los anteriores, no obstante en aguas carentes de coliformes y Streptococcus informan sobre la posibilidad de contaminaciones no recientes. Clostridium perfringens es de origen fecal y no es patógeno en el intestino de los animales homeotérmicos. No es exclusivamente fecal se encuentra en suelos y guas contaminadas. Por ser una bacteria esporulada tolera elevadas temperaturas y desecación, pH extremos, falta de nutrientes, entre otras condiciones adversas. Cuando está presente en el agua potabilizada y desinfectada indica fallos en el tratamiento o en la desinfección. Su presencia en aguas cloradas se asocia con deficiencias en la filtración. Debido a su alta resistencia las esporas pueden indicar, de forma indirecta, la presencia de quistes de protozoarios .
  25. Se pesan 10g o ml y se homogenizan con 90ml de peptona 0.1% Se realizan diluciones seriadas en 9ml peptona 0.1%
  26. Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 minutos para hacer luego el choque térmico y activar las esporas. Para finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.
  27. Se siembra 1ml en fondo de la dilución que ha sido sometida a choque térmico y se agrega el medio SPS caliente.
  28. Por ultimo, se llevan a incubar las cajas en cámara de anaerobiosis por 72 horas a 37°C, con sobre generador de anaerobiosis e indicador atmosférico.