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06/12/2011    Análisis microbiológico de alimentos       Microorganismos marcadores                                       ...
06/12/2011Un tratamiento de                                                    La presencia posible de                Los ...
06/12/2011         Aplicación del RAM                                          El RAM NO es útil para:                    ...
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06/12/2011         Pruebas de determinación de                                  Pruebas para detección y                 C...
06/12/2011       Determinación de E. coli                                          Recuento de Enterobacterias            ...
06/12/2011           Uso de Enterococcus como            indicadores en alimentos                                         ...
06/12/2011 Incubación en anaerobiosis                                                          Mohos y levaduras          ...
06/12/2011“La misión de la vida es descubrir la vocación y luegoentregarse a ella con todo el corazón”                    ...
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Microorganismos marcadores en alimentos

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Microorganismos marcadores en alimentos

  1. 1. 06/12/2011 Análisis microbiológico de alimentos Microorganismos marcadores En realidad… • La mayoría de los alimentos contienen microorganismos. • No es posible el análisis de todos los patógenos y de María Marcela Martínez Miranda Magister en Microbiología todos los Departamento de Ingeniería alterantes. Universidad de Caldas Marcela Martínez M.Sc. ¿Porqué buscar Microorganismos marcadores microorganismos marcadores?1. La detección de • Son organismos (o patógenos puede ser muy grupos) que advierten: complicada, muy lenta y/o muy costosa. – manejo inadecuado2. La investigación de – presencia de patógenos en alimentos microorganismos no facilita un enfoque patógenos preventivo. • Su detección en el3. Calidad microbiológica en términos de laboratorio es más microorganismos sencilla, rápida y/o marcadores. económica. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Características de un buen índice de Microorganismos marcadores contaminación en alimentos • Microorganismos cuya presencia 1. Origen específico en cantidades o niveles por encima de ciertos límites Índices numéricos indica la posible 2. Técnicas de laboratorio presencia de patógenos fiables y rápidas ecológicamente relacionados. 3. Resistencia a condiciones ambientales • Microorganismos cuya presencia y al procesado tanto o en cantidades determinadas indica un tratamiento o más que los patógenos a Indicadores procesado de inocuidad los cuales representa. inadecuado. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 1
  2. 2. 06/12/2011Un tratamiento de La presencia posible de Los principales microorganismos patógenos entéricos, es decir, inocuidad una función de índice para microorganismos de indicadores en alimentos son: insuficiente importancia para la saludcumpliendo de ese pública, como por ejemplo lasmodo una función shigelas, que se pudieran haber originado en la zona • Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de de indicador donde fueron tratados los camarones. proceso: – Aerobios Mesófilos – Psicrófilos y psicrotróficos – Termófilos o termodúricos – Mohos y levaduras Un microorganismo marcador dado – Coliformes totales puede funcionar a la vez como índice y como indicador. • Indicadores de contaminación fecal: Por ejemplo, la presencia de cantidades importantes de E. coli en los camarones – Coliformes fecales precocinados congelados indica: – E. coli – Enterococos Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. – Anaerobios sulfito-reductores Otros microorganismos Métodos de análisis microbiológico indicadores • Método: cualitativo – PRESENCIA / AUSENCIA en• Estafilococos coagulasa positiva 25 g o mL de muestra. (Staphylococcus aureus) • Salmonella sp. • Vibrio cholerae• Recuento de Anaerobios Mesófilos • Listeria monocytogenes • Método: cuantitativo• Recuento de Anaerobios Esporulados – Tubos múltiples: NMP/g o mL de muestra• Recuento de Virus entéricos – Recuento en placa: ufc/g o mL a. Por incorporación b. Por superficie Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Recuento de aerobios mesófilos Indicadores de condiciones de (RAM) manejo o de eficiencia de proceso  Se desarrollan en presencia de aire Aerobios a temperaturas medias (25-40°C). mesófilos  Dan lugar a la formación de colonias visibles después de 72 horas a 3Oº Psicrófilos y C (ó 48 horas a 37ºC) sobre un agar termófilos de recuento, incubado en condiciones de aerobiosis. Mohos y  Indican: levaduras  la calidad sanitaria de un alimento. Coliformes  las condiciones de manipulación. totales  las condiciones higiénicas de la Marcela Martínez M.Sc. materia prima. Marcela Martínez M.Sc. 2
  3. 3. 06/12/2011 Aplicación del RAM El RAM NO es útil para:  Alimentos fermentados.  Col acida, queso y otros Alimentos derivados lácteos. frescos,  Alimentos esterilizados refrigerados y (Recuento Microscópico congelados. Directo).  Alimentos deshidratados y Materias primas e congelados (Recuento insumos. Microscópico Directo).  Alimentos refrigerados Alimentos listos (Recuento de para consumir. psicrotróficas). Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Existen dos métodos clásicos para el recuento de aerobios mesófilos RAM por el método de siembra a profundidad Profundidad 10 -1 (48 h) 10 -2 A (48 h) 10 -2 B (48 h) 10 -3 A (48 h) 10 -3 B (48 h) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Un RAM elevado indica: Un RAM elevado puede significar: 1. Excesiva contaminación  En alimentos estables de la materia prima. – Materias primas muy contaminadas. 2. Deficiente manipulación – Tratamiento no satisfactorio. durante el proceso de elaboración.  En alimentos perecederos 3. La posibilidad de que – Materias primas muy contaminadas. existan patógenos, pues éstos son mesófilos. – Tratamiento no satisfactorio. 4. La inmediata alteración – Almacenamiento en condiciones de del producto. temperatura inadecuadas. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 3
  4. 4. 06/12/2011 Psicrotróficos Psicrotróficos• Por definición son Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram organismos que producen positivos y gram negativos; aeróbos; anaerobios y crecimiento visible a 7o C anaerobios facultativos. 1o C dentro de 7 a 10 – Aeromonas días, independiente de su – Bacillus temperatura de crecimiento óptima. – Clostridium – Lactobacillus• Los organismos mayormente asociados con – Escherichia alimentos refrigerados y – Listeria que causan daño son – Serratia, ect. psicrotróficos y no psicrofílicos – Hongos y levaduras Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Psicrotróficos Psicotróficos patógenos Métodos de detección Patógenos • Cultivo durante 10 días – Aeromonas hydrophila a 7oC para siembra en – Bacillus cereus (algunas profundidad. cepas) – Clostridium botulinum type E, • Cultivo durante 7-8 ByF días a 7o C para siembra en superficie – Listeria monocytogenes – Vibrio cholerae • Cultivo durante16 hr a 17O C seguido de 3 – Yersinia enterocolítica días a 7oC – Escherichia coli (algunas cepas) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Termodúricos Termodúricos Organismos que Género Alimento asociado Actinomycetes Leche pueden tolerar calor y Alcaligenes Leche por consiguiente Arthrobacter Leche tienen la capacidad Bacillus Leche/huevos de sobrevivir Clostridium Leche pausterización. Son Coryneform Huevos capaces de sobrevivir Lactobacillus Leche/carne/jugos el calentamiento de Microbacterium Leche un alimento a Micrococcus Leche/huevos temperaturas de 60 a Pseudomonas Huevos 80OC. Streptococcus/ Leche/carne/huevo Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Enterococcus 4
  5. 5. 06/12/2011 Coliformes Bacilos Gram negativos No esporulados Aerobios o anaerobios facultativos Fermentan la lactosa a 35⁰C con producción de ácido y gas Viven en el ambiente y en animales de sangra caliente Los coliformes totales incluyen los fecales Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Son algunas especies que pertenecen a los géneros:Género Fuente Heces (humanas yEscherichia animales)Klebsiella Heces, ambienteEnterobacter Heces, ambienteCitrobacter Ambiente Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Coliformes como indicadores de Aplicación del uso de Coliformes contaminación fecal como indicadores• Se encuentran en el intestino del hombre y de 1. Detección de prácticas sanitarias deficientes en el animales, pero también en otros ambientes manejo y en la fabricación de los alimentos. como: suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. 2. Evaluación de la calidad microbiológica de un• Son útiles como indicadores de contaminación producto. fecal por: 3. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias – Su frecuencia en heces e higiénicas en el equipo. – Su fácil detección en el laboratorio 4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de – Sus características semejantes a algunos miembros agua utilizados en las diferentes áreas del patógenos de la familia Enterobacteriaceae procesamiento de alimentos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 5
  6. 6. 06/12/2011 Pruebas de determinación de Pruebas para detección y Coliformes recuento de Coliformes1. Investigación y recuento en 1. Prueba presuntiva medio líquido • Se usa el Caldo – Caldo Lauril Triptosa (CLT). lactosado biliado verde – Caldo Mc. Conkey. brillante (Brilliant Green Bile Lactose: BGBL) – Caldo lactosado bilis verde brillante.2. Investigación y recuento en 2. Prueba confirmativa: medio sólido • Se utiliza el medio – Medio EC. selectivo agar biliado – Medio bilis lactosa (BLVB) rojo-violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Investigación y recuento en Coliformes fecales (CF) medio sólido  Origen intestinal Coliformes totales en placas de agar  Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae bilis rojo violeta, incubadas por 24 h  Bacilos Gram negativos, a 35 ºC anaerobios facultativos, no esporulados. UFC/g (o/mL) de  Fermentadores de lactosa a muestra. 44.5 °C con producción de gas.  Principalmente Escherichia coli (90%) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Determinación de CF Escherichia coli (coliformes termotolerantes) • Capacidad para producir indol a partir de triptófano • Producción de la enzima β- glucuronidasa. • Es el índice de contaminación fecal más adecuado. • Hay grandes cantidades de Escherichia coli en las Su determinación se hace a partir de la segunda etapa heces humanas y (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo animales. lactosado con incubación a 44.5 °C. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 6
  7. 7. 06/12/2011 Determinación de E. coli Recuento de Enterobacterias • Familia• Métodos basados en: Enterobacteriaceae – Producción de ácido y gas a partir de la lactosa. • Lactosa + y lactosa - – Producción de la enzima β- • Se usan como grupo glucuronidasa. indicador en lugar del grupo de coliformes• Los procedimientos incluyen: totales. – Filtración con una membrana que • Son de origen fecal y después se incuba en medios selectivos a 44–45 °C. no fecal. – «número más probable» Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias Qué indica niveles altos de Enterobacteiras en como indicadoras en lugar de los coliformes alimentos procesados? 1. Los coliformes son un • Tratamiento inadecuado y/o grupo mal definido contaminación posterior al taxonómicamente. tratamiento; más frecuentemente a partir de 2. Los coliformes solo materias primas, equipos tienen en cuenta las sucios o manejo no higiénico enterobacterias lactosa positiva. • Multiplicación microbiana que pudiera haber permitido 3. Las Enterobacterias el crecimiento de toda la son mas resistentes serie de microorganismos que los coliformes. patógenos y toxigénicos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Estreptococos fecales Métodos para el recuento de Enterobacterias Enterococcus • Se encuentran en las heces • Método de de los humanos y animales de sangre caliente. recuento • Animales de producción: – Recuento en vaca, cerdo, oveja, caballo, placa gallina y pato. – Recuento en • Son importantes en medio líquido Confirmación con situaciones donde se sabe prueba de oxidasa que hay contaminación • Método de VRBG Agar fecal y no se detectan ausencia coliformes. presencia Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 7
  8. 8. 06/12/2011 Uso de Enterococcus como indicadores en alimentos Especies de Enterococcus• Aunque se encuentran Grupo Especies Hábitat en cantidades menores que E. coli, son mas Enterococcus faecalis están normalmente resistentes. Grupo 1 Enterococcus faecium presentes en las heces de humanos y animales• Se consideran Enterococcus durans indicadores en alimentos Streptococcus bovis procesados, como Streptococcus equinus no se encuentran lácteos y cárnicos, en Grupo 2 comúnmente en las heces Enterococcus avium humanas los cuales E. coli no puede sobrevivir. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Recuento de esporas de Clostridium Clostridium sulfito reductores sulfito reductores Se pesan 10g o ml y se homogenizan Se realizan diluciones seriadas en • Bacterias Grampositivas, con 90ml de peptona 0.1% 9ml peptona 0.1% esporuladas, anerobias, reductoras de sulfitos. • Se utilizan como indicadores de contaminación fecal antigua. • Clostridium perfringens es de origen fecal y también se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Choque térmico para formación de esporas Siembra en fondo en agar SPSSe ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 Se siembra 1ml en fondo de la diluciónminutos para hacer luego el choque térmico y activar las esporas. que ha sido sometida a choque térmico Marcela Martínez M.Sc. y se agrega el medio SPS caliente. M.Sc. Marcela MartínezPara finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo. 8
  9. 9. 06/12/2011 Incubación en anaerobiosis Mohos y levaduras Se llevan a incubar las cajas en cámara Unicelulares hongos filamentosos de anaerobiosis por 72 horas a 37 C, con sobre generador de anaerobiosis e indicador atmosférico. • Crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que conservan humedad. • Las levaduras crecen mas rápidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a ellos. • Mohos son aerobios estrictos. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. • Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentación).Mohos y levaduras en alimentos Recuento de mohos y levaduras Importantes en alimentos • Se desarrollan en ácidos y en los de baja condiciones de aerobiosis. actividad de agua: • A temperaturas que varían – Frutas frescas entre 20 y 30⁰C. – Jugos – Vegetales • Crecen más lentamente que las bacterias. – Quesos – Cereales • Los medios de cultivo – Alimentos salazonados deben favorecer su desarrollo pero no el de las – Encurtidos bacterias. – Alimentos congelados y deshidratados Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.Medios de cultivo para mohos Recuento de mohos y levaduras Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC – 100 UFC Agar de Sabouraud Se reportan indistintamente mohos y levaduras Agar papa dextrosa Agar extracto de malta Agar Czapek-Dox Agar Micosel o micobiótico BHI + antibióticos BHI Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 9
  10. 10. 06/12/2011“La misión de la vida es descubrir la vocación y luegoentregarse a ella con todo el corazón” Marcela Martínez M.Sc. Buda 10

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