1. MÓDULO 1
Introducción a las herramientas para la
detección de ácidos nucleicos
(PARTE I)
Herramientas moleculares I:
parámetros y validación para el diagnóstico bioquímico
Dr. Diego Chouhy

2. INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO
Sala de preparación de reactivos
Preparación de
reactivos para la PCR
Preparación de la mezcla
de PCR
Sala de preparación de muestras
Procesamiento de
muestras clínicas.
Aislamiento de ácidos
nucleicos
Agregado de ácidos
nucleicos a los tubos
de reacción de PCR
Sala de amplificación y detección
PCR (termocicladores) Detección de los
productos amplificados
 Pipetas
 Microcentrífuga
 Vortex
 Pipetas
 Microcentrífuga
 Pipetas
 Microcentrífuga
 Cicladores térmicos
 Cubas de electroforesis
 Fuentes de poder
 Transiluminador UV
 Microondas

3.  OBTENCIÓN
- sangre entera anticoagulada con EDTA
- plasma / suero
- líquido cefalorraquídeo
- biopsia
- etc
ETAPAS EN EL PROCESAMIENTO
MÉTODOS MOLECULARES
 CONSERVACIÓN
- dentro de las 24 horas: 2 - 8°C
- más de 24 horas congelar a –20°C o –70 °C.
 EXTRACCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
1- REQUERIMIENTOS DE LA MUESTRA
2- AMPLIFICACIÓN
3- DETECCIÓN

4. MÉTODOS MOLECULARES
AMPLIFICACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
AMPLIFICACIÓN DE
LA SEÑAL
AMPLIFICACIÓN DE
LA SONDA
Branched DNA signal amplification (bDNA)
Ligase Chain Reaction (LCR)
Amplificación Isotérmica
TMA
NASBA
3SR
SDA
LMPA
Amplificación No Isotérmica
Standard PCR
RT-PCR
Multiplex PCR
Nested PCR
real time PCR

5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
KARY MULLIS
1985: PCR
1993: PREMIO
NOBEL DE QUÍMICA
Amplificación Génica
Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias
Reacción en Cadena de la Polimerasa

6. Luego de 30-40 ciclos ≈ 109 – 1012 copias
La PCR es una metodología que consiste en la amplificación enzimática en
ciclos repetidos de un fragmento específico de ADN utilizando la enzima
ADN polimerasa termoestable (Taq)
La amplificación in vitro del ADN se logra
en tres pasos básicos:
1).-Desnaturalización del ADN a copiar
(molde o diana) mediante el incremento
de la temperatura (92-95°C).
2).-Hibridación de los cebadores al ADN
molde mediante la disminución de la
temperatura a la temperatura de anillado
de los cebadores (55-65°C).
3).-Copia de las cadenas delimitadas por
los cebadores. Se consigue elevando la
temperatura de la reacción a la óptima
de la ADN polimerasa utilizada.
N=1N=2N=4
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Reacción en Cadena de la Polimerasa

7.  Oligonucleótidos (cebadores)
 Tampón (Buffer)
 ADN Polimerasa termoestable
 Desoxinucleótidos (dNTPs)
 Cloruro de Magnesio (MgCl2)
 ADN molde
Reacción en Cadena de la Polimerasa
COMPONENTES DE LA PCR

8. COMPONENTES DE LA PCR
Secuencias cortas de ADN (18 - 24 nucleótidos) que flanquean el fragmento
a amplificar y actúan como iniciadores (“cebadores”) de la polimerización.
1- Oligonucleótidos
Necesario para crear las condiciones óptimas para la actividad de la ADN
polimerasa. A menudo contienen Tris-HCl, KCl, y a veces, MgCl2.
2- Tampón (Buffer)
Sustrato necesario para la formación de las cadena de ADN.
Unen iones Mg2+. Para 1.5 mM de MgCl2, la [dNTPs] ideal es de 200 μM.
Pequeños incrementos en la [dNTPs] pueden inhibir la reacción porque
atraparan los iones Mg2+ necesarios para que la ADN-polimerasa funcione.
Si cambiamos la [dNTPs] es importante tener en cuenta que existe una
relación entre las cantidades de MgCl2 y las de dNTPs en la reacción.
3- Desoxinucleótidos (dNTPs)
Reacción en Cadena de la Polimerasa

9. La [MgCl2] afecta a la incorporación de dNTPs, la actividad polimerasa y
temperatura de hibridación del híbrido cebador-ADN templado.
  [MgCl2]   Especificidad de la reacción.
  [MgCl2]   Eficiencia de la reacción
A: 0,5 mM - B: 0,8 mM - C: 1,5 mM
D: 2,0 mM - E: 2,5 mM - F: 3,0 mM
Efecto de la concentración de MgCl2
4- Cloruro de Magnesio (MgCl2)
 Producto final debe estar limpio y libre de cualquier residuo de buffers.
 Estos productos residuales pueden inhibir la acción de la enzima o
modificar la concentración salina del buffer de reacción.
 Inhibidores en la muestra (Columnas vs Técnicas manuales de extracción)
5- ADN molde
Reacción en Cadena de la Polimerasa
COMPONENTES DE LA PCR

10. COMPONENTES DE LA PCR
Dirección de polimerización 5’-3’.
Solamente añaden desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a una
cadena cebadora ya existente unida a una cadena molde.
No inicia síntesis de ADN de novo.
6- ADN Polimerasas
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Pfu ADN polimerasa
Taq ADN polimerasa Hot Start Taq ADN polimerasa
Mix de enzimas
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11. PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN
Componente Volumen Concentración
final
Tampón (buffer) 10X 5 µl 1X
dNTP 2 mM 5 µl 0.2 mM
Cebador sentido (10
pmol/µl)
0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM
Cebador antisentido (10
pmol/µl)
0.5-5.0 µl 0.1-1.0 µM
MgCl2 25 mM 2-8 µl 1-4 mM
ADN templado 5 µl 10 pg – 1 µg
Taq ADN polimerasa 5 U/µl 0.2-0.5 µl 1.0-2.5 U
H2O (libre de nucleasas) hasta 50 µl
Volumen Total 50 µl
Reacción en Cadena de la Polimerasa

12. Paso Temperatura Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 95ºC 3-5 min. 1
Desnaturalización 95ºC 30-60 seg.
25-40Anillado 50-68ºC 30-60 seg.
elongación 72ºC 30-60 seg.
Elongación final 72ºC 5-10 min. 1
PROTOCOLO GENERAL DE MEZCLA DE REACCIÓN
Reacción en Cadena de la Polimerasa

13. ARN
ADNc
Retrotranscripción, M-MLV
PCR, Taq
cebadores
RT-PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa

14. En esta modificación de la PCR se incluyen dentro de la misma
reacción de amplificación múltiples pares de cebadores específicos
para diferentes dianas, por lo que se produce una co-amplificación
de diferentes dianas.
Esta modificación tiene las siguientes ventajas:
 se pueden testear grandes regiones de una única secuencia de
ADN en busca de alteraciones o modificaciones.
 se pueden testear segmentos no relacionados del genoma diana.
 se pueden incluir controles internos de amplificación de la muestra.
 se puede testear una misma muestra contra diferentes patógenos.
200 pb 300 pb500 pb
Electroforesis
200 pb
300 pb
500 pb
PCR
PCR multiplex
Reacción en Cadena de la Polimerasa

15. Desventaja:
 Mayor probabilidad de contaminación.
No es recomendable la apertura del 1° tubo de amplificación (sobre todo en laboratorios de
diagnóstico clínico), ya que durante la transferencia se producen aerosoles que pueden
contaminar reacciones sucesivas. Para evitar esto se han desarrollado alternativas a fin de
evitar la transferencia de un tubo a otro tras la 1° amplificación.
500 pb
250 pb
1ª amplificación
2ª amplificación
Nested-PCR o PCR anidada
Ventajas:
Mejor sensibilidad.
Se puede detectar una sola copia de
la diana sin necesidad de hibridar
con sondas marcadas.
Mejor especificidad.
La re-amplificación con el par de
cebadores internos sirve para
verificar la especificidad de la
primera ronda de amplificación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa

16.  Los procesos de amplificación y detección se producen simultáneamente.
 Disminución del riesgo de contaminación.
 Por detección fluorescente se puede medir la cantidad de ADN sintetizado en
cada momento durante la amplificación .
 Posibilidad de cuantificación  La emisión de fluorescencia producida en la
reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.
Los sistemas de detección por fluorescencia
empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de
dos tipos:
 Agentes intercalantes: fluorocromos que
aumentan la emisión de fluorescencia al unirse al
ADN de doble hélice. Baja especificidad.
 Sondas de hibridación específicas: sondas
marcadas con 2 fluorocromos (un donador y un
aceptor) y el fenómeno de Transferencia de
energía fluorescente mediante resonancia (FRET).
Real time-PCR o PCR en tiempo real
Reacción en Cadena de la Polimerasa

17. DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
1- Electroforesis
 Separación de moléculas
 Matriz tamponada (agarosa, acrilamida)
 Separación de moléculas mediante el uso
de un campo eléctrico
“Electro” se refiere a la electricidad y “foresis” (del griego phoros) significa “trasladar”.
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
 Agarosa
 Tampón o Buffer de corrida
 Tampón o Buffer de carga (Loading Buffer)
 Visualización
Reacción en Cadena de la Polimerasa

18. 1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
Polisacárido extraído de algas.
 Electroforesis rápida, pero con una resolución limitada.
Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene
determinada por su concentración.
Un fragmento de ADN migra a
diferentes velocidades a través de
los geles según la concentración
de agarosa.
AGAROSA

19. 1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
 La movilidad electroforética del ADN está afectada por la composición y la
fuerza iónica del medio.
En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra
lentamente o ni siquiera se desplaza.
Con elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se
genera una importante cantidad de calor. Generalmente el gel se funde y el
ADN se desnaturaliza.
BUFFER DE CORRIDA
 Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE),
tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una
concentración de 50 mM (pH 7,5 – 7,8).
EDTA vs degradacion enzimática.
 Debido a la carga negativa del ADN, la migración
en la corrida es hacia el ánodo (color rojo).
Reacción en Cadena de la Polimerasa

20. 1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
BUFFER DE CARGA
Xylene cyanol
Migra a aprox. 4Kb
Azul de bromofenol
Ayuda a visualizar que la
muestra este migrando en el
gel. Migra a aprox. 200 - 400
pb (depende del porcentaje
de la agarosa)
GLICEROL
Añade densidad a la muestra.
incorporar un colorante a la muestra que,
en un campo eléctrico, se desplace hacia el
ánodo a una velocidad previsible.
Añadir color a la
muestra
aumentar la densidad de las
muestras para que el ADN caiga
uniformemente en el pocillo
Reacción en Cadena de la Polimerasa

21. Aplicar 80 V
De 30-40 min
1- Electroforesis
CARGADO DE MUESTRA
Reacción en Cadena de la Polimerasa

22. 1- Electroforesis
COMPONENTES PARA UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
VISUALIZACIÓN
 Para cuantificar y/o visualizar el ADN se utilizan agentes colorantes
fluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisión cuando se unen a
la doble hélice.
 Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del ADN.
 Generalmente son policíclicos aromáticos, hidrofobos y planares:
BROMURO DE ETIDIO
 Reactivo mutagénico, por lo que se
deben trabajar con equipo de seguridad.
 El material contaminado con ellos
generalmente se trata con nitrito sódico y
ácido hipofosforoso para su degradación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa

23. 1- Electroforesis
DETECCIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO
1. Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lámpara de UV
2. Visualizar bandas de ADN
3. Tomar fotografía
4. Determinar el peso molecular de las bandas
Marcador de peso molecular
Reacción en Cadena de la Polimerasa

24. DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis
AMPLIFICACIÓN CON CEBADORES BIOTINILADOS
PCR
B
B
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa

25. DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis
HIBRIDACIÓN CON SONDA ESPECÍFICA
B
F
F
B
+
CAPTURA EN MICROPLACA DEL HÍBRIDO
Microplaca revestida con
Estreptavidina
F
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa

26. DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS
2- Enzimoinmunoanálisis (EIA)
DETECCIÓN COLORIMÉTRICA DEL HÍBRIDO
Microplaca revestida con
Estreptavidina
F
B
peroxidasa
Reactivo
cromóforo NEGATIVO
POSITIVO
F
B
Reacción en Cadena de la Polimerasa

27. EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos
Concentración y Purificación del ARN diana
• Centrifugado a alta velocidad
• Eliminación de componentes plasmáticos (por lavado)
Paso 1
Amplificación
• Retrotranscripción (RT)
• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Paso 2
Detección
• Hibridización
• Revelado colorimétrico
Paso 3
Reacción en Cadena de la Polimerasa

28. Centrifugar
1 hora
1000 µL
600 µL
GuSCN Lysis Buffer
+ CI
Mix,
Incubar 10 min
Centrifugar 15 min
Retirar SN
800 µL
Isopropanol
Lavar Pellet,
Centrifugar 5 min
Retirar SN
1 ml
70% Ethanol200 µLHCV
Resuspender
Pellet
50µL
100 µL
Plasma
Tubos con
Master Mix
HIV
HBV
Diluyente de
muestra
EIA-PCR - Amplificación NO isotérmica de ácidos nucleicos
Reacción en Cadena de la Polimerasa

29. FIN DE LA PARTE 1 – MÓDULO I