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Espectrometría de masasEspectrometría de masas
¿Para qué sirve?¿Para qué sirve?
Identificación de compuestos
Determinación de la composición cuali-
cuantitativa de una muestra
Determinación de estructuras
Determinación de relaciones isotópicas
Determinación de estructura y composición de
superficies sólidas
Componentes de un espectrómetro de masasComponentes de un espectrómetro de masas
Introducción
de Muestra
Fuente de
iones
gaseosos
Analizador
de masas
Transductor
de iones
Ionización
Selección
de iones
Detección
de iones
Procesador
de la señal
Bomba de
vacío
Espectro de masas
10-5
a 10-8
Torr
Ionización Selección de iones
(Analizador)
Detección
de iones
CO2H
CO2 -
*
CO2H *+
*+
*+
*+
CO2H
CO2H
CO2H
CO2H
CO2H
CO2H
CO2H
AR
(%)
m/z1641197643
CO2H *+
*+
*+
*+
m/z AR
12 1
13 3,9
14 9,2
15 85
16 100
17 1,1
10 12 14 16 18 20
0
20
40
60
80
100
m/z
AbundanciaRelativa
Abundancia isotópica natural absoluta 98,93 1,07
Abundancia isotópica natural relativa 100 1,08
12
CH4
+· 13
CH4
+·
Componentes Espectro de masasComponentes Espectro de masas
¿Por qué es necesario el vacío?¿Por qué es necesario el vacío?
Presión Densidad de gas Camino libre promedio
(Torr) (moleculas/cm3
) (m)
760 2,7x 1019
1x10-6
1 3,5x 1016
5x10-5
0,1 3,5x 1015
5x10-4
0,01 3,5x 1014
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3,5x 1013
5x10-2
1x10-4
3,5x 1012
0,5
1x10-5
3,5x 1011
50
1x10-6
3,5x 1010
5x103
Sistemas de introducción de muestraSistemas de introducción de muestra
• DirectosDirectos
– Sistema discreto
– Por sonda directa
• CromatográficosCromatográficos
– GC
– HPLC
– EC
– Etc
Fuentes de ionizaciónFuentes de ionización
Se obtienenSe obtienen
Moléculas enteras cargadas (IÓN MOLECULAR)
positiva o negativamente
Fragmentos cargados (positivos, negativos)
Radicales libres (neutros o cargados)
Pueden serPueden ser
En fase gaseosa
Desorción/ionización (fase condensada)
Nebulización (fase líquida)
Ionización de moléculasIonización de moléculas
• Las fragmentaciones dependen sólo de
– Energía del método de ionización
– La energía interna del ión generado
– La estructura del ión generado
Ionización en fase gaseosaIonización en fase gaseosa
Técnica Agente ionizante
EI Impacto electrónico Electrones
CI Ionización química Iones de gas reactivo
FI Ionización por campo Campos eléctricos altos
• CaracterísticasCaracterísticas
– Los analitos son volatilizados en el punto de inyección o
por acople a GC
– No es útil para analitos termolábiles
Impacto electrónicoImpacto electrónico
M MS
Vacío
Entrada e-
e-
e-
e-
e-
Filamento
e-
M+.
M
e-
Colector
Enfoque y
Aceleración
Salida
M+·
Catión Radical
Algunos procesos inducidos por el impacto electrónico
Excitación Ionización Disociación
Ionización
CaracterísticasCaracterísticas
• Fuente de ionización dura
• Utilidad
– Proporciona información estructural
– Sólo para moléculas volátiles o
derivatizables de bajo PM
– Permite acoplamiento a GC
– Apta para compuestos de PM < a 1kDa
• Ventajas
– Alta sensibilidad
– Identificación inequívoca por el patrón
de fragmentación (único reproducible)
• Desventajas
– Puede no detectarse el M+·
por excesiva
fragmentación
– Descomposición térmica de los analitos
previa a la ionización
Tipos de iones formados por impactoTipos de iones formados por impacto
electrónicoelectrónico
Ión molecular (M+·
): molécula que pierde un e-
quedando con carga + (Radical catión).
Fragmentos: Se forman por ruptura de enlaces.
Pico Base: Ión más abundante (AR 100%).
Reordenamientos: Ocurren por ruptura de enlaces y
migración de átomos.
Ión doblemente cargado: Ión con 2 cargas + por
pérdida de 2 e-
. Aparecen a la mitad de su masa en el
espectro.
Iones + :
Odd electron: Poseen 1 e-
desapareado (ej: ión molecular).
Even electron: Poseen todos los e-
apareados.
CaracterísticasCaracterísticas
• Fuente de ionización
Dura (blanda entre las duras)
• Utilidad
– Menor tendencia a la
fragmentación
– Determinación de PM
– Sólo para moléculas volátiles o
derivatizables de bajo PM (< a
1kDa)
– Permite acoplamiento a GC
– El ión molecular puede aparecer
a [M+H]+.
Ionización en fase condensadaIonización en fase condensada
• Por ejemplo: MALDI (Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization)
• Transferencia de energía de la fuente a la muestra
(que está depositada en un soporte “mezclada” con la
matriz) en estado sólido o líquido.
• La energía entregada provoca la desorción (pasaje al
estado gaseoso) y posterior ionización de la muestra.
• Es un método suave.
• Útil frente a analitos termolábiles
MALDIMALDI
• Fuente láser: proporciona fotones de alta energía que
se transfieren a la matriz, y de ésta a la muestra.
• Ocurre una conversión en energía cinética y
vaporización, con la posterior ionización si la energía
interna es suficiente (M+·
).
• La muestra se disuelve en una matriz capaz de
absorber la λ de los fotones láser. La matriz transfiere
energía a la muestra, que se desorbe e ioniza.
• Menor tendencia a la fragmentación.
•Por lo general la matriz cede un H+
, generando [M+H]+.
CaracterísticasCaracterísticas
• Utilidad: Determinación
de PM.
• Elucidación estructural
si se acopla a EI o a un
segundo pulso láser.
• Análisis de moléculas
biológicas (hasta
300kDa) y termolábiles.
Ionización por nebulizaciónIonización por nebulización
La gota se encoge
debido a la
evaporación del
solvente
La gota se divide en
gotas más pequeñas
por repulsión de
cargas internas
Formación de iones
gaseosos
Electrospray (ESI,Electrospray (ESI, EElectrolectroSSpraypray
IIonizationonization
CaracterísticasCaracterísticas
• Se forma el ión
molecular.
• Facilidad de
acoplamiento con
técnicas de separación
(micro LC-MS/MSMS,
nano LCMS/ MSMS).
• Producción de iones
multicargados.
AnalizadoresAnalizadores
• Permiten la llegada de cada ión por separado o
selectivamente al detector en función de su m/z
• Pueden serPueden ser
– Sector magnético (B)
– Doble enfoque (B/E)
– Cuadrupolo (Q)
– Trampa iónica (IT)
– Resonancia ión ciclotrón con transformada de Fourier (FT-
ICR)
– Tiempo de vuelo (TOF)
Sector magnéticoSector magnético
A > m/z, > radio de giro (sus trayectorias se curvan menos)
El enfoque hacia el detector se produce por variación del campo
magnético aplicado
Los iones que son muy pesados
poseen mayor radio de curvatura.
Los iones que son muy
livianos poseen menor
radio de curvaturaFuente de
iones
Rendijas de
aceleración
Muestra
Haz de
electrones
Haz de
iones
Sólo los iones con la relación
m/z correcta pueden llegar al
detector
CaracterísticasCaracterísticas
• Posee baja resolución
• Rango de trabajo: 0-20kDa
Doble enfoqueDoble enfoque
Arreglo de los sectores electrostático y magnético en el modelo de Nier de doble enfoque.
El haz de iones
enfocados por el sector
eléctrico son
reenfocados en el
sector magnético,
donde iones de masas
idénticas son separados
en base a diferencias de
energía.
El sector electrostático
enfoca en base a energía
cinética por carga (Ec/z)
SectorSector
electrostáticoelectrostático
R es
independiente
de m/z en E:
HAY
ENFOQUE!!!
El sector magnético enfoca en
base al momentum por carga
(m.v)/z
El análisis final se realiza en
función de la relación m/z
DetectorDetector
Sector magnéticoSector magnético
(el campo apunta(el campo apunta
hacia dentro delhacia dentro del
plano)plano)
CaracterísticasCaracterísticas
• Combina un analizador
electrostático (barrido de campo
eléctrico) con un analizador
magnético (barrido de campo
magnético)
• Se minimizan las aberraciones
direccionales y de energía de
una población de iones
• Incrementa la resolución: se
logran resolver diferencias de
masa de hasta 4 decimales
– N2: m/z=28,0061
– CO2: m/z=27,9949
Rango de trabajo de hasta 4kDa
• Al llegar menor cantidad de
iones al detector disminuye la
sensibilidad
•Fotografía de un equipo JEOL JMS-700 de
doble enfoque con sector magnético donde se
muestra la geometría BE.
CuadrupoloCuadrupolo
•4 barras cilíndricas paralelas de metal
•Iones con trayectoria sinusoidal debido a la aplicación simultánea de potenciales de corriente
continua (un par de barras polo +, el otro par polo -) y potenciales de corriente alterna
(radiofrecuencias)
•El barrido de potenciales permite seleccionar el pasaje de cada ión de acuerdo a su m/z
+
+
--
CaracterísticasCaracterísticas
• Bajo costo y
mantenimiento
• Rápido análisis
• Baja resolución
• Rango de trabajo: hasta
4kDa
Trampa iónicaTrampa iónica
CaracterísticasCaracterísticas
• La física es muy similar a la
del analizador cuadrupolo.
• Las trampas iónicas tienen
usos y utilizaciones
similares a los cuadrupolos.
• Rango de trabajo hasta
6kDa
• Baja resolución
• Permite hacer Ms-Ms
1,0 mm
0,45 mm
0,9 mm
FT-ICRFT-ICR
Los iones se estabilizan por la
aplicación simultánea de campos
eléctrico y magnético. De esta manera
describen una trayectoria circular
dependiente de la m/z.
CaracterísticasCaracterísticas
• NO se utiliza para hacer
escaneo de masas.
• Poseen la más alta
resolución.
• La detección de iones no
es destructiva, por lo que
pueden volver a medirse.
• Requiere ultra-alto vacío.
• Deben optimizarse
muchos parámetros para
obtener un buen espectro
de masas.
• Rango: hasta 10 kDa
• Permite hacer Msn
•A pesar de que la celda para FT-ICR es
pequeña (aproximadamente 5 cm de lado),
se encuentra dentro de un campo magnético
muy alto (generalmente un magneto
superconductor), por lo que el tamaño final
del equipo es grande.
TOFTOF
CaracterísticasCaracterísticas
• Se basa en la medida del tiempo
que tardan los iones generados y
acelerados con igual energía en
la fuente de iones en alcanzar un
electrodo colector situado a una
distancia prefijada. Como los
iones poseen la misma energía
pero diferentes masas alcanzarán
el colector a diferentes tiempos,
dependiendo de su masa, carga y
energía cinética.
• Rango de trabajo teóricamente
infinito
• Alta resolución si se lo acopla a
un Reflectron (“Espejo” de
iones: potencial electrico con
unas celdas que frenan y desvían
nuevamente al los iones)
• Alta sensibilidad.
DetectoresDetectores
• Son electrodos colectores de iones a la salida
del analizador.
• Son multiplicadores de electrones
Discrete dynode electron multiplier. Photograph of an
old-fashioned 16-stage Venetian blind-type SEM. It
clearly shows the resistors and ceramics insulators
between the stacking dynodes at its side.
• Photograph of a channeltron multiplier.
RegistradorRegistrador
• Las corrientes de iones para cada m/z se normalizan respecto al pico más abundante
(pico base), al que se le asigna un valor de 100
• Ejemplo:
CH3OH + e-
CH3OH+.
(m/z=32) + 2 e-
(ión molecular)
CH3OH+.
CH2OH+
(m/z=31) + H
.
CH3OH+.
CH3
+
(m/z=15) + OH
.
CH2OH+
CHO+
(m/z=29) + H2
m/z AR
12 0.3
13 0.7
14 2.4
15 12
15.5 0.2
16 0.2
17 1.0
28 6.3
29 64
30 3.8
31 100
32 66
33 1.0
0 10 20 30
0
20
40
60
80
100
m/z
AbundanciaRelativa
¿Cómo se interpreta un espectro de¿Cómo se interpreta un espectro de
masas?masas?
Peso molecular
Fórmula
Grupos funcionales
Identidad
Identifico el M+·
Relaciones Isotópicas
Modelos de fragmentación
Anillos y C=C
Bibliotecas
• Requisitos del Ión molecularRequisitos del Ión molecular
– Mayor masa en el espectro teniendo en cuenta los
isótopos más abundantes
– m/z=16 12
CH4
+·
Ión molecularIón molecular
– m/z=17 13
CH4
+·
– Debe ser Odd electron
– Las diferencias de masa entre el M+·
y el resto de los
fragmentos deben ser lógicas desde el punto de
vista químico.
m/z AR
12 1
13 3,9
14 9,2
15 85
16 100
17 1,1
10 12 14 16 18 20
0
20
40
60
80
100
m/z
AbundanciaRelativa
Abundancia isotópica natural absoluta 98,93 1,07
Abundancia isotópica natural relativa 100 1,08
12
CH4
+· 13
CH4
+·
En espectrometría de masas no se utiliza el pesoEn espectrometría de masas no se utiliza el peso
atómico promedio (promedio ponderado por lasatómico promedio (promedio ponderado por las
abundancias absolutas de cada varianteabundancias absolutas de cada variante
isotópica) ya que el espectrómetro discriminaisotópica) ya que el espectrómetro discrimina
entre los isótopos del mismo elementoentre los isótopos del mismo elemento
Clasificación de los elementosClasificación de los elementos
A A+1 A+2 Tipo de elemento
Elemento Masa % Masa % Masa %
HH 1 100 2 0,015 AA
CC 12 100 13 1,1 A+1A+1
NN 14 100 15 0,37 A+1A+1
OO 16 100 17 0,04 18 0,20 A+2A+2
FF 19 100 AA
SiSi 28 100 29 5,1 30 3,4 A+2A+2
PP 31 100 AA
SS 32 100 33 0,80 34 4,4 A+2A+2
ClCl 35 100 37 32,5 A+2A+2
BrBr 79 100 81 98,0 A+2A+2
II 127 100 AA
A: isótopos con un solo elemento natural (el H se considerará como elemento A)
A+1: Elementos con dos isótopos naturales que difieren en 1 uma
A+2: Elementos con dos isótopos naturales que difieren en 2 uma
Cluster isotópicoCluster isotópico
• Grupo de iones con igual fórmula química y distinta composición isotópica
• Ej: Metano, CO, N2
m/z
(↑resolución)
m/z
(↓resolución)
AR
(%)
12
CH4
+·
16.0312 16 100
13
CH4
+·
17.0347 17 1,08
Información
brindada por
M+·
Peso molecular
Fórmula molecular
Peso molecular
Precisión 4 decimales Número entero
12
CO+·
27.9949 28
14
N2
+·
28.0062 28
COCO
Pico m/z AR
M+·
28 100
M+·
+1 29 1,14
M+·
+2 30 0,2
NN22
M+·
28 100
M+·
+1 29 0,74
¿Qué ocurre cuando tengo más de¿Qué ocurre cuando tengo más de
un elemento A+1 o A+2?un elemento A+1 o A+2?
(A+1) (A+2) (A+1) (A+2) (A+3)
C1 1,1 0,00 C16 18 1,5 0,1
C2 2,2 0,01 C17 19 1,7 0,1
C3 3,3 0,04 C18 20 1,9 0,1
C4 4,4 0,07 C19 21 2,1 0,1
C5 5,5 0,12 C20 22 2,3 0,2
C6 6,6 0,18 C22 24 2,8 0,2
C7 7,7 0,25 C24 26 3,3 0,3
C8 8,8 0,34 C26 29 3,9 0,3
C9 9,9 0,44 C28 31 4,5 0,4
C10 11,0 0,54 C30 33 5,2 0,5
C11 12,1 0,67 C35 39 7,2 0,9
C12 13,2 0,80 C40 44 9,4 1,3
C13 14,3 0,94 C50 55 15 1,3
C14 15,4 1,1 C60 66 21 4,6
C15 16,5 1,3 C100 110 60 22
Nº Át
Cl Masa
Número átomos de bromo
0 1 2 3 4
0
A 100 51 34 17,4
A+2 98 100 100 68
A+4 49 98 100
A+6 32 65,3
A+8 16
1
A 100 76,6 43,8 26,1 14,2
A+2 32,5 100 100 85,1 60,3
A+4 24,4 69,9 100 100
A+6 13,7 48,9 80,1
A+8 8 30,5
A+10 4,3
2
A 100 61,4 38,3 20,4 11,9
A+2 65 100 100 73,3 54,3
A+4 10,6 45,6 98,7 100 100
A+6 6,6 31,9 63,8 94,2
A+8 3,9 18,7 47,3
A+10 2 11,8
A+12 1,2
Nº Át
Cl Masa
Número átomos de bromo
0 1 2 3 4
3
A 100 51,2 31,3 16,4
A+2 97,5 100 92 64,5
A+4 31,7 65 100 100
A+6 3,4 17,6 49,9 77,7
A+8 1,7 11,6 31,8
A+10 1,0 6,5
4
A 76,9 43,8 24,1 13,6
A+2 100 100 78,7 57,7
A+4 48,7 83,6 100 100
A+6 10,5 33,2 63,4 91,1
A+8 0,9 6,3 21,4 47,2
A+10 0,5 3,7 13,9
A+12 0,3 2,2
A+14 0,1
5
A 61,5 37,7 19,2
A+2 100 98,3 68,9
A+4 65 100 100
A+6 21,1 52 76,4
A+8 3,4 14,8 33,5
A+10 0,2 2,2 8,5
A+12 0,1 1,1
ProblemasProblemas
• 3) a-
m/z AR
94 100
95 1,1
96 98
97 1,08
Pico Base – Puede coincidir o no con el ión molecular
AR correspondiente a un 13
C (A+1) (por tabla)
AR correspondiente a la presencia de un 81
Br (A+2) (por tabla)
AR correspondiente a la presencia de un 13
C yy de un 81
Br
H3CBr
PM=94
ProblemasProblemas
• 5)
m/z AR
197 30
198 20
199 12
200 5,46
Cl
CH3CH3
CH2OH
CH2
CH2
AR correspondiente al [M-H]+·
Ión molecular y (A+1) pico 197.
(A+2) pico 197 + (A+1) pico 198
●
(A+2) pico 198 y (A+3) pico 197
Cálculo AR del ión
molecular
Debido a 1x13
C
100 AR 1,1 x 11
30 AR X = 3,63
Debido a 1x17
O
100 AR 0,04
30 AR X = 0,012
20 AR Ión Molecular + (A+1) 197
-3,64 AR (A+1) 197
16,36 AR Ión molecular
Cálculo AR del pico m/z 200
Debido a (A+2) de 198 2x 13
C Debido al (A+2) de 198 37
Cl Debido al (A+2) de 198 18
O
100 AR 0,67 100 AR 32,5 100 AR 0,2
16,36 AR X= 0,11 16,36 AR X = 5,32 16,36 AR X = 0,03
Debido a (A+3) de 197 13
C+37
Cl Debido al (A+3) de 197 17
O+37
Cl
100 AR 32,5 100 AR 32,5
3,63 AR X= 1,18 0,012 AR X = 3,9 x 10-3
SE DESPRECIA
Cálculo AR del pico m/z 199
Debido a (A+1) de 198 13
C Debido al (A+2) de 197 37
Cl Debido al (A+2) de 197 2x13
C
100 AR 11 x 1,1 100 AR 32,5 100 AR 0,67
16,36 AR X = 1,98 30 AR X = 9,75 30 AR X = 0,2
Debido a (A+1) de 198 17
O Debido al (A+2) de 197 18
O
100 AR 0,04 100 AR 0,2
16,36 AR X= 6,5 x 10-3
30 AR X = 0,06
SE DESPRECIA
1,98+9,75+0,2+0,06 = 12
oo oo
oo
oo oo
0,11+5,32+0,03+1,18 = 6,64
oo

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  • 2. ¿Para qué sirve?¿Para qué sirve? Identificación de compuestos Determinación de la composición cuali- cuantitativa de una muestra Determinación de estructuras Determinación de relaciones isotópicas Determinación de estructura y composición de superficies sólidas
  • 3. Componentes de un espectrómetro de masasComponentes de un espectrómetro de masas Introducción de Muestra Fuente de iones gaseosos Analizador de masas Transductor de iones Ionización Selección de iones Detección de iones Procesador de la señal Bomba de vacío Espectro de masas 10-5 a 10-8 Torr
  • 4. Ionización Selección de iones (Analizador) Detección de iones CO2H CO2 - * CO2H *+ *+ *+ *+ CO2H CO2H CO2H CO2H CO2H CO2H CO2H AR (%) m/z1641197643 CO2H *+ *+ *+ *+
  • 5. m/z AR 12 1 13 3,9 14 9,2 15 85 16 100 17 1,1 10 12 14 16 18 20 0 20 40 60 80 100 m/z AbundanciaRelativa Abundancia isotópica natural absoluta 98,93 1,07 Abundancia isotópica natural relativa 100 1,08 12 CH4 +· 13 CH4 +· Componentes Espectro de masasComponentes Espectro de masas
  • 6. ¿Por qué es necesario el vacío?¿Por qué es necesario el vacío? Presión Densidad de gas Camino libre promedio (Torr) (moleculas/cm3 ) (m) 760 2,7x 1019 1x10-6 1 3,5x 1016 5x10-5 0,1 3,5x 1015 5x10-4 0,01 3,5x 1014 5x10-3 1x10-3 3,5x 1013 5x10-2 1x10-4 3,5x 1012 0,5 1x10-5 3,5x 1011 50 1x10-6 3,5x 1010 5x103
  • 7. Sistemas de introducción de muestraSistemas de introducción de muestra • DirectosDirectos – Sistema discreto – Por sonda directa • CromatográficosCromatográficos – GC – HPLC – EC – Etc
  • 8. Fuentes de ionizaciónFuentes de ionización Se obtienenSe obtienen Moléculas enteras cargadas (IÓN MOLECULAR) positiva o negativamente Fragmentos cargados (positivos, negativos) Radicales libres (neutros o cargados) Pueden serPueden ser En fase gaseosa Desorción/ionización (fase condensada) Nebulización (fase líquida)
  • 9. Ionización de moléculasIonización de moléculas • Las fragmentaciones dependen sólo de – Energía del método de ionización – La energía interna del ión generado – La estructura del ión generado
  • 10. Ionización en fase gaseosaIonización en fase gaseosa Técnica Agente ionizante EI Impacto electrónico Electrones CI Ionización química Iones de gas reactivo FI Ionización por campo Campos eléctricos altos • CaracterísticasCaracterísticas – Los analitos son volatilizados en el punto de inyección o por acople a GC – No es útil para analitos termolábiles
  • 11. Impacto electrónicoImpacto electrónico M MS Vacío Entrada e- e- e- e- e- Filamento e- M+. M e- Colector Enfoque y Aceleración Salida
  • 12. M+· Catión Radical Algunos procesos inducidos por el impacto electrónico Excitación Ionización Disociación Ionización
  • 13. CaracterísticasCaracterísticas • Fuente de ionización dura • Utilidad – Proporciona información estructural – Sólo para moléculas volátiles o derivatizables de bajo PM – Permite acoplamiento a GC – Apta para compuestos de PM < a 1kDa • Ventajas – Alta sensibilidad – Identificación inequívoca por el patrón de fragmentación (único reproducible) • Desventajas – Puede no detectarse el M+· por excesiva fragmentación – Descomposición térmica de los analitos previa a la ionización
  • 14. Tipos de iones formados por impactoTipos de iones formados por impacto electrónicoelectrónico Ión molecular (M+· ): molécula que pierde un e- quedando con carga + (Radical catión). Fragmentos: Se forman por ruptura de enlaces. Pico Base: Ión más abundante (AR 100%). Reordenamientos: Ocurren por ruptura de enlaces y migración de átomos. Ión doblemente cargado: Ión con 2 cargas + por pérdida de 2 e- . Aparecen a la mitad de su masa en el espectro. Iones + : Odd electron: Poseen 1 e- desapareado (ej: ión molecular). Even electron: Poseen todos los e- apareados.
  • 15.
  • 16. CaracterísticasCaracterísticas • Fuente de ionización Dura (blanda entre las duras) • Utilidad – Menor tendencia a la fragmentación – Determinación de PM – Sólo para moléculas volátiles o derivatizables de bajo PM (< a 1kDa) – Permite acoplamiento a GC – El ión molecular puede aparecer a [M+H]+.
  • 17. Ionización en fase condensadaIonización en fase condensada • Por ejemplo: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) • Transferencia de energía de la fuente a la muestra (que está depositada en un soporte “mezclada” con la matriz) en estado sólido o líquido. • La energía entregada provoca la desorción (pasaje al estado gaseoso) y posterior ionización de la muestra. • Es un método suave. • Útil frente a analitos termolábiles
  • 18. MALDIMALDI • Fuente láser: proporciona fotones de alta energía que se transfieren a la matriz, y de ésta a la muestra. • Ocurre una conversión en energía cinética y vaporización, con la posterior ionización si la energía interna es suficiente (M+· ). • La muestra se disuelve en una matriz capaz de absorber la λ de los fotones láser. La matriz transfiere energía a la muestra, que se desorbe e ioniza. • Menor tendencia a la fragmentación.
  • 19. •Por lo general la matriz cede un H+ , generando [M+H]+.
  • 20. CaracterísticasCaracterísticas • Utilidad: Determinación de PM. • Elucidación estructural si se acopla a EI o a un segundo pulso láser. • Análisis de moléculas biológicas (hasta 300kDa) y termolábiles.
  • 21. Ionización por nebulizaciónIonización por nebulización La gota se encoge debido a la evaporación del solvente La gota se divide en gotas más pequeñas por repulsión de cargas internas Formación de iones gaseosos
  • 22. Electrospray (ESI,Electrospray (ESI, EElectrolectroSSpraypray IIonizationonization
  • 23. CaracterísticasCaracterísticas • Se forma el ión molecular. • Facilidad de acoplamiento con técnicas de separación (micro LC-MS/MSMS, nano LCMS/ MSMS). • Producción de iones multicargados.
  • 24. AnalizadoresAnalizadores • Permiten la llegada de cada ión por separado o selectivamente al detector en función de su m/z • Pueden serPueden ser – Sector magnético (B) – Doble enfoque (B/E) – Cuadrupolo (Q) – Trampa iónica (IT) – Resonancia ión ciclotrón con transformada de Fourier (FT- ICR) – Tiempo de vuelo (TOF)
  • 25. Sector magnéticoSector magnético A > m/z, > radio de giro (sus trayectorias se curvan menos) El enfoque hacia el detector se produce por variación del campo magnético aplicado Los iones que son muy pesados poseen mayor radio de curvatura. Los iones que son muy livianos poseen menor radio de curvaturaFuente de iones Rendijas de aceleración Muestra Haz de electrones Haz de iones Sólo los iones con la relación m/z correcta pueden llegar al detector
  • 26. CaracterísticasCaracterísticas • Posee baja resolución • Rango de trabajo: 0-20kDa
  • 27. Doble enfoqueDoble enfoque Arreglo de los sectores electrostático y magnético en el modelo de Nier de doble enfoque. El haz de iones enfocados por el sector eléctrico son reenfocados en el sector magnético, donde iones de masas idénticas son separados en base a diferencias de energía. El sector electrostático enfoca en base a energía cinética por carga (Ec/z) SectorSector electrostáticoelectrostático R es independiente de m/z en E: HAY ENFOQUE!!! El sector magnético enfoca en base al momentum por carga (m.v)/z El análisis final se realiza en función de la relación m/z DetectorDetector Sector magnéticoSector magnético (el campo apunta(el campo apunta hacia dentro delhacia dentro del plano)plano)
  • 28. CaracterísticasCaracterísticas • Combina un analizador electrostático (barrido de campo eléctrico) con un analizador magnético (barrido de campo magnético) • Se minimizan las aberraciones direccionales y de energía de una población de iones • Incrementa la resolución: se logran resolver diferencias de masa de hasta 4 decimales – N2: m/z=28,0061 – CO2: m/z=27,9949 Rango de trabajo de hasta 4kDa • Al llegar menor cantidad de iones al detector disminuye la sensibilidad •Fotografía de un equipo JEOL JMS-700 de doble enfoque con sector magnético donde se muestra la geometría BE.
  • 29. CuadrupoloCuadrupolo •4 barras cilíndricas paralelas de metal •Iones con trayectoria sinusoidal debido a la aplicación simultánea de potenciales de corriente continua (un par de barras polo +, el otro par polo -) y potenciales de corriente alterna (radiofrecuencias) •El barrido de potenciales permite seleccionar el pasaje de cada ión de acuerdo a su m/z + + --
  • 30. CaracterísticasCaracterísticas • Bajo costo y mantenimiento • Rápido análisis • Baja resolución • Rango de trabajo: hasta 4kDa
  • 32. CaracterísticasCaracterísticas • La física es muy similar a la del analizador cuadrupolo. • Las trampas iónicas tienen usos y utilizaciones similares a los cuadrupolos. • Rango de trabajo hasta 6kDa • Baja resolución • Permite hacer Ms-Ms 1,0 mm 0,45 mm 0,9 mm
  • 33. FT-ICRFT-ICR Los iones se estabilizan por la aplicación simultánea de campos eléctrico y magnético. De esta manera describen una trayectoria circular dependiente de la m/z.
  • 34. CaracterísticasCaracterísticas • NO se utiliza para hacer escaneo de masas. • Poseen la más alta resolución. • La detección de iones no es destructiva, por lo que pueden volver a medirse. • Requiere ultra-alto vacío. • Deben optimizarse muchos parámetros para obtener un buen espectro de masas. • Rango: hasta 10 kDa • Permite hacer Msn •A pesar de que la celda para FT-ICR es pequeña (aproximadamente 5 cm de lado), se encuentra dentro de un campo magnético muy alto (generalmente un magneto superconductor), por lo que el tamaño final del equipo es grande.
  • 36. CaracterísticasCaracterísticas • Se basa en la medida del tiempo que tardan los iones generados y acelerados con igual energía en la fuente de iones en alcanzar un electrodo colector situado a una distancia prefijada. Como los iones poseen la misma energía pero diferentes masas alcanzarán el colector a diferentes tiempos, dependiendo de su masa, carga y energía cinética. • Rango de trabajo teóricamente infinito • Alta resolución si se lo acopla a un Reflectron (“Espejo” de iones: potencial electrico con unas celdas que frenan y desvían nuevamente al los iones) • Alta sensibilidad.
  • 37. DetectoresDetectores • Son electrodos colectores de iones a la salida del analizador. • Son multiplicadores de electrones Discrete dynode electron multiplier. Photograph of an old-fashioned 16-stage Venetian blind-type SEM. It clearly shows the resistors and ceramics insulators between the stacking dynodes at its side.
  • 38. • Photograph of a channeltron multiplier.
  • 39. RegistradorRegistrador • Las corrientes de iones para cada m/z se normalizan respecto al pico más abundante (pico base), al que se le asigna un valor de 100 • Ejemplo: CH3OH + e- CH3OH+. (m/z=32) + 2 e- (ión molecular) CH3OH+. CH2OH+ (m/z=31) + H . CH3OH+. CH3 + (m/z=15) + OH . CH2OH+ CHO+ (m/z=29) + H2 m/z AR 12 0.3 13 0.7 14 2.4 15 12 15.5 0.2 16 0.2 17 1.0 28 6.3 29 64 30 3.8 31 100 32 66 33 1.0 0 10 20 30 0 20 40 60 80 100 m/z AbundanciaRelativa
  • 40. ¿Cómo se interpreta un espectro de¿Cómo se interpreta un espectro de masas?masas? Peso molecular Fórmula Grupos funcionales Identidad Identifico el M+· Relaciones Isotópicas Modelos de fragmentación Anillos y C=C Bibliotecas
  • 41. • Requisitos del Ión molecularRequisitos del Ión molecular – Mayor masa en el espectro teniendo en cuenta los isótopos más abundantes – m/z=16 12 CH4 +· Ión molecularIón molecular – m/z=17 13 CH4 +· – Debe ser Odd electron – Las diferencias de masa entre el M+· y el resto de los fragmentos deben ser lógicas desde el punto de vista químico.
  • 42. m/z AR 12 1 13 3,9 14 9,2 15 85 16 100 17 1,1 10 12 14 16 18 20 0 20 40 60 80 100 m/z AbundanciaRelativa Abundancia isotópica natural absoluta 98,93 1,07 Abundancia isotópica natural relativa 100 1,08 12 CH4 +· 13 CH4 +· En espectrometría de masas no se utiliza el pesoEn espectrometría de masas no se utiliza el peso atómico promedio (promedio ponderado por lasatómico promedio (promedio ponderado por las abundancias absolutas de cada varianteabundancias absolutas de cada variante isotópica) ya que el espectrómetro discriminaisotópica) ya que el espectrómetro discrimina entre los isótopos del mismo elementoentre los isótopos del mismo elemento
  • 43. Clasificación de los elementosClasificación de los elementos A A+1 A+2 Tipo de elemento Elemento Masa % Masa % Masa % HH 1 100 2 0,015 AA CC 12 100 13 1,1 A+1A+1 NN 14 100 15 0,37 A+1A+1 OO 16 100 17 0,04 18 0,20 A+2A+2 FF 19 100 AA SiSi 28 100 29 5,1 30 3,4 A+2A+2 PP 31 100 AA SS 32 100 33 0,80 34 4,4 A+2A+2 ClCl 35 100 37 32,5 A+2A+2 BrBr 79 100 81 98,0 A+2A+2 II 127 100 AA A: isótopos con un solo elemento natural (el H se considerará como elemento A) A+1: Elementos con dos isótopos naturales que difieren en 1 uma A+2: Elementos con dos isótopos naturales que difieren en 2 uma
  • 44. Cluster isotópicoCluster isotópico • Grupo de iones con igual fórmula química y distinta composición isotópica • Ej: Metano, CO, N2 m/z (↑resolución) m/z (↓resolución) AR (%) 12 CH4 +· 16.0312 16 100 13 CH4 +· 17.0347 17 1,08 Información brindada por M+· Peso molecular Fórmula molecular Peso molecular Precisión 4 decimales Número entero 12 CO+· 27.9949 28 14 N2 +· 28.0062 28 COCO Pico m/z AR M+· 28 100 M+· +1 29 1,14 M+· +2 30 0,2 NN22 M+· 28 100 M+· +1 29 0,74
  • 45. ¿Qué ocurre cuando tengo más de¿Qué ocurre cuando tengo más de un elemento A+1 o A+2?un elemento A+1 o A+2? (A+1) (A+2) (A+1) (A+2) (A+3) C1 1,1 0,00 C16 18 1,5 0,1 C2 2,2 0,01 C17 19 1,7 0,1 C3 3,3 0,04 C18 20 1,9 0,1 C4 4,4 0,07 C19 21 2,1 0,1 C5 5,5 0,12 C20 22 2,3 0,2 C6 6,6 0,18 C22 24 2,8 0,2 C7 7,7 0,25 C24 26 3,3 0,3 C8 8,8 0,34 C26 29 3,9 0,3 C9 9,9 0,44 C28 31 4,5 0,4 C10 11,0 0,54 C30 33 5,2 0,5 C11 12,1 0,67 C35 39 7,2 0,9 C12 13,2 0,80 C40 44 9,4 1,3 C13 14,3 0,94 C50 55 15 1,3 C14 15,4 1,1 C60 66 21 4,6 C15 16,5 1,3 C100 110 60 22
  • 46. Nº Át Cl Masa Número átomos de bromo 0 1 2 3 4 0 A 100 51 34 17,4 A+2 98 100 100 68 A+4 49 98 100 A+6 32 65,3 A+8 16 1 A 100 76,6 43,8 26,1 14,2 A+2 32,5 100 100 85,1 60,3 A+4 24,4 69,9 100 100 A+6 13,7 48,9 80,1 A+8 8 30,5 A+10 4,3 2 A 100 61,4 38,3 20,4 11,9 A+2 65 100 100 73,3 54,3 A+4 10,6 45,6 98,7 100 100 A+6 6,6 31,9 63,8 94,2 A+8 3,9 18,7 47,3 A+10 2 11,8 A+12 1,2 Nº Át Cl Masa Número átomos de bromo 0 1 2 3 4 3 A 100 51,2 31,3 16,4 A+2 97,5 100 92 64,5 A+4 31,7 65 100 100 A+6 3,4 17,6 49,9 77,7 A+8 1,7 11,6 31,8 A+10 1,0 6,5 4 A 76,9 43,8 24,1 13,6 A+2 100 100 78,7 57,7 A+4 48,7 83,6 100 100 A+6 10,5 33,2 63,4 91,1 A+8 0,9 6,3 21,4 47,2 A+10 0,5 3,7 13,9 A+12 0,3 2,2 A+14 0,1 5 A 61,5 37,7 19,2 A+2 100 98,3 68,9 A+4 65 100 100 A+6 21,1 52 76,4 A+8 3,4 14,8 33,5 A+10 0,2 2,2 8,5 A+12 0,1 1,1
  • 47. ProblemasProblemas • 3) a- m/z AR 94 100 95 1,1 96 98 97 1,08 Pico Base – Puede coincidir o no con el ión molecular AR correspondiente a un 13 C (A+1) (por tabla) AR correspondiente a la presencia de un 81 Br (A+2) (por tabla) AR correspondiente a la presencia de un 13 C yy de un 81 Br H3CBr PM=94
  • 48. ProblemasProblemas • 5) m/z AR 197 30 198 20 199 12 200 5,46 Cl CH3CH3 CH2OH CH2 CH2 AR correspondiente al [M-H]+· Ión molecular y (A+1) pico 197. (A+2) pico 197 + (A+1) pico 198 ● (A+2) pico 198 y (A+3) pico 197 Cálculo AR del ión molecular Debido a 1x13 C 100 AR 1,1 x 11 30 AR X = 3,63 Debido a 1x17 O 100 AR 0,04 30 AR X = 0,012 20 AR Ión Molecular + (A+1) 197 -3,64 AR (A+1) 197 16,36 AR Ión molecular
  • 49. Cálculo AR del pico m/z 200 Debido a (A+2) de 198 2x 13 C Debido al (A+2) de 198 37 Cl Debido al (A+2) de 198 18 O 100 AR 0,67 100 AR 32,5 100 AR 0,2 16,36 AR X= 0,11 16,36 AR X = 5,32 16,36 AR X = 0,03 Debido a (A+3) de 197 13 C+37 Cl Debido al (A+3) de 197 17 O+37 Cl 100 AR 32,5 100 AR 32,5 3,63 AR X= 1,18 0,012 AR X = 3,9 x 10-3 SE DESPRECIA Cálculo AR del pico m/z 199 Debido a (A+1) de 198 13 C Debido al (A+2) de 197 37 Cl Debido al (A+2) de 197 2x13 C 100 AR 11 x 1,1 100 AR 32,5 100 AR 0,67 16,36 AR X = 1,98 30 AR X = 9,75 30 AR X = 0,2 Debido a (A+1) de 198 17 O Debido al (A+2) de 197 18 O 100 AR 0,04 100 AR 0,2 16,36 AR X= 6,5 x 10-3 30 AR X = 0,06 SE DESPRECIA 1,98+9,75+0,2+0,06 = 12 oo oo oo oo oo 0,11+5,32+0,03+1,18 = 6,64 oo