biochimie des proteines seriques s'articulent sur les protéines de la coagulation copie pdf disponible (avec d'autres cours et d'autres eBooks) sur www.medweb.eb2a.com

1. 1) LES PROTEINES SERIQUES
• A) Les protéines de la coagulation et de la
fibrinolyse
• B) Dosage des protéines totales dans le
sérum.
• C) Propriétés générales des protéines du
sérum.
• D) Méthodes d’analyse des protéines du
sérum.
• E) Classification des protéines du sérum.
• F) Etude de quelques protéines
importantes du sérum 1

2. A) Les protéines de la
coagulation et de la fibrinolyse
• - Différence plasma- sérum: fibrinogène
• - La coagulation du sang in vivo et in vitro
• - Voie extrinsèque et intrinsèque
2

3. L’hémostase est l’arrêt de l’écoulement du
sang.
-L’hémostase spontanée est un phénomène
physiologique due à la coagulation du sang
- L’hémostase provoquée est obtenue
artificiellement pour arrêter les hémorragies
d’origine traumatique ou chirurgicale:
compression, pince, électrocoagulation,
ligature du vaisseau. 3

4. • Le sang qu’il soit artériel ou veineux comprend des
éléments figurés(globules rouges et blancs, plaquettes)
et un milieu liquide aqueux qui contient de nombreuses
molécules en solution qui s’appelle le plasma.
• A l’état normal le sang circule librement dans les
vaisseaux.
• Dans certaines circonstances pathologiques
(thromboses) le sang peut se coaguler cad qu’il y a
formation d’un thrombus (gr.thrombos:caillot) solide qui
résulte de la transformation d’un liquide, le plasma en un
gel. Cette gélification est due à la transformation d’une
protéine plasmatique soluble, le fibrinogène, en une
protéine insoluble, la fibrine.
• Si cette coagulation est réalisée dans un tube, in vitro,
le liquide résultant s’appelle le sérum. Le plasma et le
sérum possèdent une composition identique à
l’exception du fibrinogène.
• L’hémostase nécessite aussi une rapide constriction du
vaisseau lésé et l’agrégation des plaquettes sur la paroi
des cellules endothéliales;pour former un caillot à la 4
surface traumatisée du vaisseau sanguin.

5. La coagulation in vivo et in vitro, voie
extrinsèque et voie intrinsèque
•
En 1863 Joseph Lister montra que le sang reste
fluide dans la veine jugulaire excisé d’un bœuf
mais qu’il coagule rapidement s’il transvasé dans
un récipient en verre(voie intrinsèque). La
coagulation peut être déclenchée par des
substances normalement absentes du sang
comme des extraits tissulaires(voie extrinsèque)
5

6. Les 3 étapes de la coagulation
• - Initiation
• - Activation
• - Fibrinoformation
6

7. Voie intrinsèque pour l’activation du facteur X
en Xa. HMK est le Kininogène de HMM.La
surface activante est le collagène in vivo et le
verre ou le kaolin in vitro
7

8. A.1 Les protéines de la coagulation
A.1.1 Classification d’après leur ordre de
découverte
• FI- Fibrinogène
• FII - Prothrombine
• FIII - facteur tissulaire.
• FIV - (Calcium).
• FV - Proaccélérine.
• FVII - Proconvertine.
• FVIII - Facteur anti hémophilique A.
• FIX - Facteur anti hémophilique B.
• FX - Facteur de Stuart-Prower.
• FXI – Précurseur du facteur antihemophilique B (PTA, Plasma
Thromboplastine Antecedent)
• FXII- Facteur de Hageman.
• FXIII – Facteur stabilisant de la fibrine: transglutaminase.
8

9. F:Facteur inactif Fa facteur actif
• F.II Prothrombine F.IIa Thrombine
• F.X F.Stuart F.Xa
9

10. A.1.2 Classification d’après leur rôles
• A) Fibrinogène, protéine de structure.
• B) Enzymes inactifs ou zymogènes ou
proenzymes qui après activation vont être des
enzymes actifs:
• 1- Enzymes du groupe des protéase à sérine
car le site actif de ces enzymes contient un
résidu de sérine
• 2 - Transglutaminase
• 3 – cofacteurs V et VII
• 4 – Protéines modulant la coagulation: protéine
C,S 10

11. A.1.3 Exemple d’activation d’un proenzyme inactif, la
prothrombine en enzyme actif, la thrombine.
Rôle important de la vitamine K et du calcium
• Structure: protéine formée d’une chaîne polypeptidique de 582 acides
aminés, 66kDa.
• Biosynthèse: hépatocytes. Nécessite la présence de Vitamine K (allemand,
Koagulation) pour pouvoir subir une modification post traductionnelle(
carboxylation de certains résidus de GLU, Glutamate en GLA,
Gammacarboxyglutamate) et être activé par le calcium. Ces résidus GLA
sont concentrés dans la région N-terminale:10 résidus GLA de l’AA 1 à 33.
• Transformation de prothrombine en thrombine nécessite la présence des
résidus GLA pour fixer le Ca2+ et induit un changement de conformation
pour subir la protéolyse limitée sous l’action du facteur X.a cad coupure de
la molécule au niveau de 2 liaisons Arg-Thr 274-275 et Arg-Ile 323-324.
• Le clivage Arg-Thr libère un fragment inactif formé par l’extrémité N-
terminale(AA 1-274) qui contient tous les résidus de gamma
carboxyglutamate.
• Le clivage Arg-Ile donne la thrombine active formée de 2 chaînes A et B
(308 AA, 32kDa)unies par un pont disulfure. Le changement de
conformation de la molécule libère le site actif sérine de l’enzyme.
11

12. L’activation de la prothrombine s’effectue sur les plaquettes et requiert:
- Un phospholipide anionique de la membrane plaquettaire qui lie le Ca2+ et la
prothrombine
- le récepteur du facteur Va qui se lie au facteur Xa, lequel se fixe à la
prothrombine. ( La thrombine est libérée de la membrane plaquettaire et va
pouvoir agir sur le fibrinogène).
Le facteur X est aussi une sérine
protéase qui contient des résidus
Gla responsables via le Ca2+ de sa
fixation aux P.lipides anioniques de
la membrane plaquettaire
12

13. A) Asymétrie normale des Plipides, PC,SM à l’extérieur,
PS,PE à l’intérieur
B) Surface procoagulante due à une asymétrie anormale de
la paroi des plaquettes, PS,PE à l’extérieur qui permet la
fixation des facteurs Va,Xa et II qui s’active en IIa
13

14. 14

15. A.1.4 Le fibrinogène et la fibrinoformation.
• Structure: hexamère formée par l’association de 2 fois 3 chaînes
polypeptidiques α,β, et γ soit α2,β2,γ2 de masse moléculaire
340kDa. Les 3 chaînes sont réunies par de nombreux ponts
disulfures (28) intra-chaînes ou inter-chaînes. Elles forment une
triple hélice à la manière du collagène. On note le fibrinogène par la
formule (Aα,Bβ,γ)2 car lors de sa transformation en fibrine il perdra
2 fibrinopeptides A et B et la fibrine sera (α,β,γ)2 . C’est une protéine
fibrillaire, d’où son nom, de forme aplatie elliptique qui mesure 45
nm et dont la structure au microscope électronique est linéaire avec
2 nodules terminaux D et un nodule central E.
• Biosynthèse: hépatocytes. Les chaînes α,β, et γ sont synthétisées
individuellement mais de façon concertée puis elles sont
assemblées en trimères Aα,Bβ,γ puis en hexamères (Aα,Bβ,γ)2 .
Les chaînes α,β, et γ comme la molécule de collagène, subissent
des modifications post traductionnelles: Hydroxylation de certains
résidus de proline en hydroxyproline qui rendent la molécule plus
hydrophile et phosphorylation de résidus de sérine qui génèrent des
charges négatives.
• Génétique: le gène est localisé sur le chr. 4 en q31. Les gènes
codant pour les 3 chaînes α,β, et γ (A,B et G) sont contigus er
s’expriment conjointement.
15

16. Fibrinogène
Schéma d’une molécule de fibrinogène en M.E avec un nodule central
E correspondant aux 2 extrémités N-terminales de la super hélice αβγ
et 2 nodules latéraux D correspondant aux 2 extrémités C-terminales
de forme globulaire réunis par 2 bâtonnets (analogie avec le collagène)
D
E
D
16

17. 17

18. • Propriétés: c’est une protéine soluble dans l’eau. C’est le plus abondant des
facteurs de la coagulation. Sa concentration normale dans le plasma est de
l’ordre de 2,5g/l (1,50-3,50g/l). Sa teneur augment au cours des états
inflammatoires.
• La fibrinoformation: elle résulte de l’action de la thrombine et s’effectue en 3
étapes
• A) Protéolyse limitée(hydrolyse spécifique par la thrombine des liaisons Gly-
Arg qui se trouvent au niveau des extrémités N-terminales des 2 chaînes
Aα et Bβ) qui va libérer 4 fibrinopeptides (2A et 2B) de 18 et 20 acides
aminés et une molécule légèrement plus courte de 3%, la fibrine.
• B) Cette coupure modifie la charge de la molécule qui va spontanément se
polymériser sous forme de filaments disposés en réticule et devenir
insoluble dans l’eau et former un gel qui enserre les éléments figurés. Ces
polymères, liées seulement par des liaisons non covalentes de type pont
hydrogène sont instables.
• C) la formation de liaisons covalentes solides entre les polymères de
fibrine se produit sous l’action d’une enzyme dite facteur stabilisant de la
fibrine ou facteur XIIIa ou transglutaminase. Cette enzyme, F.XIII est
activée en FXIIIa comme la prothrombine, par la thrombine et le Ca2+. Elle
est due à la formation de liaisons pseudopeptidiques entre la fonction γ-CO-
NH2 de certains résidus de Gln d’une chaîne avec la fonction ε-aminé de
certains résidus de Lys appartenant à une autre chaîne. Elle correspond au
phénomène de la rétraction du caillot qui laisse sourdre un liquide citrin, le
sérum.
• Contrôle de la fibrinoformation in vivo: inhibiteur de la thrombine ou anti-
thrombine (ATIII)et maintien de la thrombine à l’état inactif de prothrombine.
18

19. Disposition proposée pour les monomères de fibrine; disposition semi-
alternée donnant la période observée de 230 Angstroms ou 23nm soit
la moitié de la molécule de fibrinogène de 46nm.
19

20. Représentation schématique du fibrinogène, de sa
structure, de ses extrémités chargées et des sites de
clivage par la thrombine des 4 liaisons peptidiques Arg-Gly
20

21. Pontage des monomères de fibrine par la
transglutaminase, F.XIIIa
21

22. A.2 Les protéines de la fibrinolyse
• C’est la transformation de la fibrine insoluble dans l’eau
en petits fragments solubles dans l’eau ou PDF, Produits
de la Dégradation de la Fibrine, sous l’action d’une
protéase à sérine, la plasmine. A l’état normal elle existe
sous une forme inactive, le plasminogène de masse
90kDa. Elle est activée en plasmine sous l’action
d’activateurs cellulaires. L’activation se réalise par
protéolyse limitée et spécifique d’une liaison peptidique
Arg-Val et conduit à la plasmine formée de 2 chaînes A
et B réunies,par un pont S-S. Le contrôle de la
fibrinolyse est assurée par une α2-globuline
plasmatique, l’antiplasmine.
22

23. La formation de D.dimères peut être considéré comme un
marqueur de la fibrinolyse.
Mais seul des taux normaux de D.dimères sont utilisés
comme exclusion de thromboses pas leur diminution. Ils
sont augmentés dans la R.I car la fibrine et le fibrinogène
sont élevées.
23

24. Examens de
sang destinés à
étudier la
Fibrinolyse au
labo d’Hémato,
Hôpital de la
Timone à
Marseille
24

25. A.3 Les Kallikréines, KLK
• Elles représentent un groupe d’enzymes
protéolytiques de spécificité « sérine protéases
»que l’on trouve dans les tissus et les liquides
biologiques. Ce terme a été introduit en 1930
par Werle et al. qui ont mis en évidence une
forte activité enzymatiques dans les extraits de
pancréas, en grec « kallikreas ».
• On les divise en 2 grandes catégories: Les KLK
tissulaires et plasmatiques qui diffèrent par leur
masse moléculaire, la spécificité du substrat et
la nature du produit libéré, la structure du gène
25

26. Kininogène Kinine, peptide bioactif
• A) la kallikrèine plasmatique (KLKB1)
• - agit sur un précurseur de haut poids moléculaire (HPM)
produit par le foie et libère un nonapeptide très actif, la
bradykinine
• - est sécrétée exclusivement par le foie
• - participe au processus de coagulation du sang(voie
intrinsèque) et à la fibrinolyse et par la libération de
bradykinine elle participe à la régulation du tonus
vasculaire et à la réaction inflammatoire.
• - sa synthèse est codée par 1 seul gène en 4q35
26

27. • B) les Kallikréines tissulaires appartiennent à
une large famille multigénique(15) localisée sur
la même région chromosomique en 19q13.4 et
de structure protéique voisine.
• - gène KLK1 human Kallicréine hK1, dans les
reins et le pancréas qui agit sur un kininogène
de bas poids moléculaire(BPM) pour donner un
décapeptide la Lys-bradykinine ou
kallidine(vasodilatateur, contraction des muscles
lisses et douleur produite par les autacoides).
• - gène KLK2 hK2 exprimé par la prostate et
les poumons agit sur prohK3 pour donner
hK3(237 AA) ou PSA, prostatic specific antigen.
hK3 clive les semenogélines et la fibronectine et
participe à la liquéfaction du liquide séminal qui
augmente la motilité des spermatozoïdes.
27

28. • - gène KLK3 hK3 exprimé par la
prostate(hK3>hK2) et les poumons.
• Intérêt de doser hK2 et hK3 dans le sérum
pour le diagnostic, le suivi(pronostic) et le
screening des populations pour le cancer
de la prostate et des poumons.
28

29. 29

30. A.4 - Nature et mode d’action des
anticoagulants utilisés in vitro et in vivo
• A.4.1- Les complexants du calcium
• - Citrates
• - EtylèneDiamineTétraAcétate: EDTA
• - Fluorures
• - Oxalates
• A.4.2 – Héparine
• A.4.3 - Hirudine
• A.4.4 - Argatroban
30

31. Calcium et coagulation
• Le Ca2+ libre est indispensable à la coagulation.
Dans le sang circulant la calcémie, voisine de
2,2mM, correspond au calcium total. La majorité
du calcium est lié à diverses molécules
minérales et organiques(ligands:L) telles que la
sérum albumine.
• Ca2+ + L Ca2+-L
Libre Lié
• Cet équilibre dépend de la nature du ligand et
de son affinité caractérisée par une constante
d’équilibre d’Affinité KA ou de Dissociation KD
31

32. A.4.1 Les complexants du Ca2+
• Ils ne sont utilisés qu’in vitro et permettent
de réaliser divers examens biologiques sur
le plasma et les éléments figurés:
• Dosage du fibrinogène dans le plasma.
• Détermination de la Vitesse de
Sédimentation des hématies, VS et de
l’Hématocrite,Ht.
• Isolement et étude du métabolisme des
globules rouges, des globules blancs et
des plaquettes.
32

33. • Ils possèdent tous des charges négatives
qui vont neutraliser les charges positives
du Ca2+, généralement des carboxyles
ionisés pour les molécules organiques:
• EDTA Ethylène Diamine Tétra Acétate
• Citrate
• Oxalate
• Simple charge négative pour le Fluorure
33

34. A.4.2 L’Héparine
• Découverte en 1916 par MacLean. Elle est utilisable à la fois in vitro
et in vivo à visée thérapeutique: elle est utilisée par voie sous-
cutanée et/ou IV.
• C’est un polysaccharide acide ou glycosaminoglycane (répétition de
15 à 100 unités monosaccharide de sucre aminé(D. glucosamine
avec SO3-) et d’acide L.iduronique( COO- et SO3-) extrait des
mastocytes de tissus animaux en contact avec l’environnement:
poumons, peau et intestin. Masse environ 20kDa. Actuellement
Héparine de Bas Poids Moléculaire, HBPM, environ 5kDa qui
possède une durée d’action plus longue.;
• L’activité est donnée en UI par comparaison avec une préparation
de référence
• , Il agit en inhibant la thrombine par union à l’AT (liaisons + -,
mole/mole) qui favorise la formation du complexe ternaire T-AT-H
inactif (KD 10-5 M KD 10-8M).
• Antidote de l’héparine: protamine, protéine basique, extraite de la
semence de saumon, l’équivalent des histones.
34

35. 1967 héparinate de Ca voie SC
1983 synthése du pentapeptide de liaison à l’AT
35

36. A.4.3 Hirudine: protéine extraite de la salive de la sangsue, hirudo
officinalis. Protéine de 65AA, 3 régions:N-ter, central et C-ter qui possède
de nombreuses charges négatives(AA53-65) qui se fixe à la thrombine et
l’inhibe:Ki 10-12. Actuellement fabriquée par recombinaison génétique
36

37. Inhibiteurs directs de la thrombine,
IIa
Exosite I
IIa
IIa
Site actif
Lépirudine Refludan ®
Désirudine Revasc ®
IIa
Site liaison
Héparine
Argatroban
37

38. Inhibition des facteurs activés IIa et
Xa par l’AT, l’AntiThrombine III au
niveau du site actif
•
ATIII IIa
ATIII Xa
38

39. Système International d’Unités (SIU)
• 10-15 femto f Numération des GR: 4
• 10-12 pico p millions/mm3 = 4.106/µl soit
• 10-9 nano n 4t/l.
• 10-6 micro µ Volume du GR: 90fl, normales
• 10-3 milli m 80-100
• 1 unité (g,l,mole) Contenu en Hb: 30pg,
• 103 kilo k normales 27-31
• 106 méga m Concentration corpusculaire
• 109 giga g moyenne en Hb: 30pg/90fl soit
• 1012 téra t 30.000g/90l soit 333g/l
normales: 300-350g/l
39

40. B) Dosage des Protéines totales du
sérum (voir TP)
• BA.1 – Technique: réaction du biuret.
• BA.2 – Valeurs normales: moyenne arithmétique
et 2 écarts types.
• BA.3 – Variations pathologiques: hypo- et hyper-
protidémies
40

41. • Hypoprotéinémies: portent principalement sur la
sérum albumine.
• Diminution de sa synthèse: apports nutritionnels
insuffisants(Kwashiorkor marasme) ou atteinte
des hépatocytes( insuffisance hépatique,
cirrhose, hépatites).
• Augmentation de sa fuite: lésions urinaires du
glomérules, lésions intestinales, brulures
étendues.
• Hyperprotidémies: portent essentiellement sur
les immunoglobulines(Maladie de Kahler,
Plasmocytomes).
41

42. C) Propriétés générales des
protéines
• C.1- Principales propriétés
physicochimiques:
• C.1.1- Effets des sels sur la solubilité des
protéines dans l’eau
• C.1.2- Effets du pH sur la solubilité des
protéines dans l’eau
• C.1.3- Fixation non spécifique des
colorants.
• C.1.4- Spectre d’absorption dans l’UV
42

43. C .1.1 Effets des sels sur la solubilité
des protéines dans l’eau
La solubilité des protéines, qu’elles
soient globulaires ou fibrillaires,
dans l’eau est due à la présence à
leur surface de résidus hydrophiles
d’acides aminés comme les
groupements –OH de la
sérine,thréonine tyrosine et
hydroyproline. La liaison OH est
polarisée avec un pôle négatif sur
l’O (δ-) et une charge positive sur
l’H (δ+). Elle permet de contracter
des liaisons hydrogène avec des
molécules d’OH2 également
polarisées qui entourent la protéine
d’une couronne d’eau.
43

44. • L’effet des sels sur la solubilité des protéines dans l’eau fait
intervenir les charges négatives ou positives portées par les résidus
d’acides aminés acides (Aspartate et glutamate –COO-) et basiques
(Lysine,NH3+, Arginine, Histidine) situés à la surface de la
molécule.
• Les sels comme le sulfate d’ammonium SO4- et NH4+ se lient
respectivement aux charges + et - des acides aminés en formant
une couronne de charges + et -. Les mol écules d’eau polarisées
vont à leur tour entrer en contact avec les charges des sels et
former une couronne d’eau, facilitant la solubilité à faible
concentration en sel. .
• Cette solubilité passe par un maximum puis diminue car l’eau est
entièrement utilisée pour dissoudre le sel et réalise une
déshydratation de la protéine d’où diminution de la solubilité. Pour
une valeur critique, propre à chaque protéine, on obtient la
précipitation de cette protéine.
• La protéine précipitée conserve son état natif et peut être
resolubilisée en diluant par l’eau la concentration en sels.
44

45. C.1.2 Effets du pH sur la solubilité
des protéines dans l’eau
• Il fait intervenir aussi l’ionisation des
fonction acides et basiques des résidus
d’acides aminés précédemment décrits.
• Rappel de la dissociation des acides
faibles selon Bronsted
• R.COOH R.COO- + H+ pK COOH 2-3
• R.NH3+ R.NH2 + H+ pK NH2 8-9
45

46. • En milieu acide cad riche en H+ la réaction évolue vers
la gauche cad que la forme protonée R.COOH ou
R.NH3+ est dominante.
• En milieu alcalin ou basique cad pauvre en H+, la
réaction évolue vers la droite cad vers la forme ionisée
R.C00- acide et R.NH2 neutre.
• A l’équilibre, cad 50% de chaque forme, le pH mesuré
correspond au pK cad à la constante d’équilibre de la
réaction K exprimée par pK= -log(K)
• Pour le –COOH le pK se situe aux environs de pH= 2-3
• Pour les acides aminés basiques le pK se situe à pH=
10 pour la,lysine, à pH=12 pour l’arginine et à pH= 6
pour l’histidine.
46

47. • Exemple d’une protéine avec 2 groupements
COOH et 2 groupements NH3+.
• 1) en milieu acide fort, pH=2 les 4 groupes vont
être protonés 2 COOH et 2 NH3+. La molécule
est sous forme d’un cation de charge nette 2+.
• 2) En augmentant le pH, les 2 carboxyles vont
s’ioniser en premier (pK=3) et conduire à 2COO-
et 2NH3+. Les charges se neutralisent et l’on a
affaire à un ion double de charge nette =0. Pour
cette valeur du pH, on calcule le point isoionique
ou pI qui est une caractéristique de chaque
protéine.
• 3) En augmentant encore le pH, on va ioniser
les fonctions basiques( R.NH3+ R.NH2, pK=
10). La protéine est alors sous forme d’anion de
charge nette -2
47

48. • La solubilité des protéines dépend du pH
cad de la forme cation, neutre ou anion.
• Les formes cations et anions sont solubles
dans l’eau car possédant une même
charge elles se repoussent:agitation
moléculaire.
• la forme neutre ne se repoussant pas
passe à la valeur du pI par une solubilité
minimum et on obtient la précipitation de
la protéine, également sous sa forme
native. Elle peut être redissoute dans un
milieu de pH adapté.
48

49. • On peut classer les protéines en 3 groupes
d’après leur pI:
• pI voisin de ph=2,3 protéines riches en acides
aminés acides
• pI voisin de ph= 6,7 protéines neutres car le
nombre d’acides aminés acides et basiques est
voisin
• pI de pH= 8-10 protéines basiques car riches en
acides aminés basiques.
• Notion fondamentale: pour chaque protéine la
valeur du pI est importante à connaître:
• En dessous du pI elle sera chargée +
• Au pI elle, sera neutre
• En dessus du pI elle sera chargée -
49

50. C .1.3 Fixation non spécifique des
colorants
• Les protéines sont en général incolores
mises à part certaines qui contiennent des
métaux qui leur confère une coloration
comme l’hémoglobine rouge(Fer), la
céruloplasmine bleue(Cu).
• Pour les mettre en évidence on utilise des
colorants non spécifique comme le rouge
ponceau, le noir amide, le bleu de
bromophénol.
50

51. C.1.4 Spectre d’absorption dans
l’UV
• En raison de la présence d’un ou de plusieurs résidus de
tryptophane dont la chaîne latérale est un noyau indol,
les protéines possèdent une spectre d’absorption dans
l’UV dont le maximum se situe à 280nm. Si la protéine
est pure l’absorption à 280nm permet de mesurer sa
concentration.
• Les protéines possèdent également un maximum
d’absorption très important à 190nm, mille fois supérieur
à celui de 280nm cad que l’on pourra à cette longueur
d’onde(200nm) détecter une concentration en protéines
mille fois plus faible. Cette propriété sera utilisée lors de
la détection des protéines après séparation par
électrophorèse capillaire.
51

52. 52

53. • C.2- Propriétés immunologiques
• - Définition des protéines antigènes
humaines, Ag et des anticorps, Ac,
Immunoglobulines; Ig, présents dans le
sérum d’un animal immunisé: spécificité et
sensibilité(10-11) de la détection des
protéines
• - Mise en évidence des complexes Ag-Ac:
• Précipitines
53

54. • Mise en évidence des précipitines:
• A - en milieu liquide dans un tube étroit: anneau
blanc à l’interface sérum humain ou protéine
(Ag) - sérum animal immunisé (Ac).
• B - en milieu solide hydrophile:agarose dans
une boîte ronde dite de Pétri. Deux puits ronds
contiennent l’Ag et l’Ac qui vont diffuser
radialement et le point de rencontre Ag-Ac se
manifeste par l’apparition d’un arc blanc unique.
Aspect qualitatif et semi-quantitatif car
l’épaisseur et la longueur de l’arc sont
sensiblement proportionnelles à la quantité d’Ag.
• C’est la technique d’Ouchterlony (Institut
Pasteur Paris).
54

55. Méthode qualitative
: Ouchterlony
C – En milieu liquide et
dans des conditions
opératoires bien
précises (viscosité
augmentée par le PEG)
on peut stabiliser le
précipité Ag-Ac et le
mesurer par
néphélémetrie. 55

56. D) Méthodes d’analyse des protéines
du sérum
• D.1- Solubilité des protéines en milieu salin
• D.2- Electrophorèse
• D.2.1- Electrophorèse en milieu liquide
• D.2.2- Electrophorèse en milieu solide:
papier(cellulose),cellogel( acétate de cellulose), amidon,
agarose, polyacrylamide. Exemple de l’électrophorèse
sur cellogel: principe, technique, résultats(profils
normaux et pathologiques)
D.2.3- Electrophorèse capillaire
.D.3 – Immunochimie: immunoélectrophorèse et
néphélémétrie.
DC.4 – Protéome et protéomique
56

57. D.1- Solubilité des protéines en
milieu salin
• Le sérum sanguin peut être fractionné en 2
grands groupes de protéines:
• - En ajoutant 1 volume de sulfate d’ammonium
(SO4Am2) saturé à 1 volume de sérum on
observe un précipité de globulines pour une
concentration finale de 50% de saturation.
• Le surnageant traitée à son tour par du SO4Am2
pour obtenir 75% de saturation. On observe un
précipité de sérum albumine.
57

58. D.2 Electrophorèse
D.2.1 Electrophorèse en veine
liquide
• Décrite par un chercheur suédois, Tiselius,
l’électrophorèse en phase liquide nécessitait un
appareillage compliqué et onéreux. En raison
des mouvements liquidiens qui s’opposaient à la
séparation des protéines d’après leur charge
électrique, il fallait opérer en milieu thermostaté.
Le déplacement des protéines était suivi par la
variation de la diffraction du milieu entre le
tampon et la protéine. Il était destiné à la
recherche et non à la routine.
58

59. D.2.2 Électrophorèse en milieu solide ou sur
support
A) cellogel: Principe, technique (voir TP)
59

60. Résultats: Profil électrophorétique
normal
60

61. • Seules les protéines dont la concentration est supérieure à 1g/l sont
visibles sur le profil. Il y en a 11:
• (la quantité de sérum déposée étant de 10µl, la quantité de
protéines visualisée est 700µg soit 70µg par protéine(protidémie de
70g/l soit 70µg/µl).
• 1) Sérum albumine 35-40 g/l
• α1-globulines: 2) α1-glycoprotéine acide ou orosomucoide 1,2 g/l.
• 3) α1-antitrypsine 3,0 g/l.
• α2 –globulines: 4) α2 macroglobuline 3 g/l
• 5) Haptoglobine 1,7 g/l
• β-globulines: 6) β-lipoprotéines 4 g/l.
• 7) Transferrine 2,5 g/l (1,8-3,3 g/l).
• 8) Fraction C3 du complément 1 g/l (0,8-1,6 g/l).
• 9) IgM 1 g/l ( 0,5-1,5 g/l).
• 10) IgA 2 g/l ( 1,1-3,4 g/l)
• 11) IgG 10 g/l (7-13 g/l).
61

62. Dynamique d’expression des protéines
sériques: la SA et les IG représentent 90%
des protéines sériques
62

63. Profils électrophorétiques en Pathologie
63

64. 64

65. 65

66. La bisalbuminémie de Kénitra
• La bisalbuminémie se définit comme la coexistence de 2
populations d’albumine sérique mise en évidence par
l’électrophorèse: 1 normal et 1 variant. .Le variant peut être plus
rapide ou plus lent par rapport à l’albumine normale. Cette anomalie
est acquise (fixation d’un médicament qui modifie la charge et donc
la,migration) ou héréditaire (mutation du gène qui produit une
protéine dont la charge est modifiée. La forme héréditaire est de
transmission autosomique dominante: 1 gène normal et un gène
muté donnant une protéine normale et une anormale.
• Le gène de la S-albumine est localisé sur le chr.4q11-13 et
comprends 15 exons et code pour 585 AA.(1755 nucléotides.
• La bisalbumine de Kénitra est due à l’insertion d’une Adénine au
nucléotide 1597entrainant un décalage du cadre de lecture et d’un
codon stop retardé donnant une protéine allongée de 603 AA.(
Mutation trouvée chez une marocaine née à Kénitra dans le service
de Médecine interne du Pr.Weiller au CHU timone à Marseille)
66

67. Autre exemple de bisalbuminémie
67

68. B) Gel d’agarose
Zone de dépôt
- +
Cathode Anode
• Gel d’agarose
• Migration des protéines en fonction de la charge électrique
• Coloration des protéines
• Examen visuel (bandes) ou intégration densitométrique (pics)
68

69. gels d’agarose en séries selon 2
fournisseurs: Sebia(34) et Midigel (10)
69

70. D.2.3 - Electrophorèse capillaire en
phase liquide
70

71. 71

72. 72

73. 73

74. 74

75. Présence de résidus de fibrinogène dans un
sérum en position β-globuline
75

76. • D.3- Immunochimie
• Spécificité importante: Ag-Ac
• Sensibilité importante: permet de détecter
les protéines à des concentrations très
faibles: µg/l(10-6g:l), ng/l(10-9g/l
• Néphélémetrie
• Principe, technique, résultats avec Ac
spécifiques des protéines du sérum
76

77. Néphélémétrie
77

78. Dosage des protéines sériques et
urinaires
78

79. Méthodes quantitatives, milieu
liquide Immunonéphélémétrie
et/ou turbimétrie
Si la lumière diffractée est caractérisée par une longueur d’onde identique à
celle du faisceau incident, lum. inc = lum. diff, il s’agit de la diffusion
RAYLEIGH de la lumière.
79

80. L’absorption du faisceau en lumière transmise, donc dans la direction du faisceau
incident s’appelle la turbidimétrie. L’observation de la lumière diffractée selon un
angle a par rapport à la direction incidente s’appelle la néphélométrie
Formule de Rayleigh : Lambda est la longueur d’onde de la lumière, n est le
nombre de particules par unité de volume, V le volume des particules, et K un
facteur de proportionalité. Lorsque l’angle d’observation est de 90° l’intensité
C,
diffractée est maximum (sin de alpha est égal à 1) 80

81. d < lambda
Dispersion
Rayleigh
d > lambda
Dispersion Mie
81

82. D.4 Protéome et protéomique
• Projet d’identification des protéines des tissus et en
particulier du sérum sanguin. Il est basé sur le fait notre
génome code pour environ 20 à 25.000 protéines bien
que chaque tissu n’en exprime qu’un certain nombre. Ce
travail de recherche a progressé en raison de la mise au
point de nouvelles techniques très performantes. Nous
donnerons 2 exemples pour le sérum sanguin:
• 1) 1980-90, Séparation des protéines par
électrophorèse dur gel de polyacrylamide à 7% en 2
dimensions: dans une dimension les protéines sont
séparées d’après la valeur de leur pI en milieu non
dénaturant, dans l’autre dimension perpendiculaire elles
sont séparées d’après leur masse moléculaire en milieu
dénaturant (présence de SDS,
82

83. • Après coloration par le bleu de Coomassie on peut
mettre en évidence une centaine de protéines. La limite
de détection est de 50ng comparée à celle sur cellogel
qui est de 70µg. La sérum albumine est bien visible
Rappel de
chimie sur la
fabrication du
gel de
polyacrylami
de à partir de
l’acrylamide
et sur les
tamis
moléculaires.
83

84. • 2) 2000-2005 Méthode SELDI-TOF (surface-enhaced laser
desorption and ionisation time-of-fligh)
• C’est une plateforme qui combine la chromatographie de
surface à la spectrométries de masse. Le mélange
protéique est fractionné dans un premier temps par
chromatographie de surface par adsorption en fonction de
ses propriétés physico-chimiques ( ionisation en cations
ou anions,caractère hydrophile ou hydrophobe) ou
biologiques(réaction Ag-Ac) puis les échantillons sont
désorbés par un laser et analysés par spectrométrie de
masse.
84

85. Principe du spectrophotomètre
de masse
Plateforme SELDI
85

86. E) Classification des Protéines du
sérum
• E.1- Lieu de synthèse: foie, lymphocytes
B, glandes endocrines
• E.2- Structure: holo- et hétéro-protéines
• E.3- Concentration
• E.4- Rôles: coagulation, enzymes,
immunoglobulines(Ig), antiprotéases,
protéines de la réaction inflammatoire
(PRI), transport ou liaison
86

87. E.2 Structure: Holo-et hétéro-protéines
• Holoprotéines: ne donnent à l’hydrolyse que des AA. Il y
en a 3: Sérum albumine, Préalbumine ou transthyrétine,
protéine C réactive, PCR ou CRP.
• Hétéroprotéines: donnent à l’hydrolyse des AA et des
molécules différentes ou groupement prosthétique.
• - Glycoprotéines: groupements polyosidiques ou
glycanes qui varient en nombre, en longueur, en
nature(oses neutre ou acides comme l’acide sialique).
Α1- glycoprotéine acide, α1-foetoprotéine, α2-
macroglobuline.( La majeure partie des protéines du
sérum sont des glycoprotéines)
• Lipoprotéines: α et β-lipoprotéines.
- Métalloprotéines: céruloplasmine(Cu), Transferrine et
ferritine(Fe).
87

88. E3. Concentration
• 1) > 1g/l 11 protéines de l’électrophorèse
• 2) 1-1000mg/l
• Hémopexine: 750
• Céruloplasmine: 500 (150-600)
• Antithrombine III: 250 (170-300)
• Transthyrétine: 250
• Plasminogène: 200 (100-300)
• Prothrombine: 75 (50-100)
• Β-2 microglobuline 50 88

89. • 3) 1-1000 µg/l
• Ferritine: 200
• α- foetoprotéine: 10
• PSA: 2,5 (Prostatic specific antigen)
• 4) 1-1000 ng/l
• HBC: 100 (Hormone béta chorionique)
• Calcitonine: 10
• 5) 1-1000 pg/l
89

90. E4 Rôles
• E.4.1- protéines de la coagulation et de la
fibrinolyse
• E.4.2- Enzymes: LDH, CK, PAL
(Phosphatases Alcalines), ASAT,ALAT,
GammaGT(Gamma
GlutamylTranspeptidase).
• E.4.3- Inhibiteurs d’enzymes: α-1 AT Anti
Trypsine, α-2 Macroglobuline.
• E.4.4- Protéines de transport ou de liaison:
90

91. F) Etude de quelques protéines
importantes du sérum
• F.1 Les inhibiteurs d’Enzymes:
• - AT, Anti-thrombine III
• - AM, Alpha-2-macroglobuline
• - AAT, Alpha-1-AntiTrypsine
91

92. F.2 Les protéines de transport et de
liaison
• F.2.1 Sérum albumine:
• 1) molécules normalement présentes dans le
sang(plasma)
• 1.A) hydrophobes: bilirubine libre, vitamines liposolubles
(Vit A, D, E),acides gras libres, hormones stéroides.
• 1.B) ions: Ca2+, Zn2+, Ni
• 2) molécules absentes à l’état normal: médicaments:
notion de médicaments libre(actif biologiquement) et
lié(réserve potentielle de médicaments libre). Notion de
pharmacocinétique
92

93. • F.2.2 - Haptoglobine
• F.2.3 - Hémopexine
• F.2.4 – Transferrine,Tf et ferritine
• F.2.5 – Céruloplasmine
• F.2.6 - RBP Retinol Binding Protein ou
transthyrétine ou préalbumine
• F.2.7 – Les globulines liant les hormones
• F.3 – Les marqueurs tumoraux:
• PSA, Prostatic Specific Antigene
• ACE, Antigène Carcino Embryonnaire
• AFP, AlphaFétoProteine
93

94. • F.4 - Les protéines de la réaction
inflammatoire, RI
• - CRP, C-reactive protein
• - fibrinogène
• F.5 - Les protéines du complément et les
immunoglobulines
• F.6 – Les Hormones: Erythropoiétine
94