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Extraccion de adn de bacterias
- 1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL TEMA: EQUIPO Y TÉCNICA DE EXTRACCIÓN ADN DE BACTERIAS PRESENTADO POR: Saul, HUARAYA LARICO CURSO: BIOTECNOLOGIA DOCENTE: Dr. Hebert Hernán, SOTO GONZALES CICLO: VII ILO - 2020
- 2. RESUMEN: La extracción del ADN constituye el primer y fundamental paso para cualquier tipo de estudio o propósito científico en el campo de la Biología Molecular, por lo que es de vital importancia tener una muestra de ADN de buena calidad. Para obtener un ADN de buena calidad, frecuentemente se requiere tener conocimiento de un buen método de aislamiento. En este estudio se realizó el método fenol cloroformo Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol(25:24:1) de SIGMA Labs., basado en el método de fenol-cloroformo, que se fundamenta en el uso de solventes orgánicos que por diferencia de densidades y por su capacidad para degradar proteínas permite la purificación de aislamiento de ADN Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la cual se establece como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma. Todos los avances acaecidos en los últimos años desde el comienzo del Proyecto Genoma Humano (1990), han supuesto un gran salto en nuestro conocimiento de la genética humana y han abierto la puerta a un sinfín de aplicaciones para mejorar la vida de las personas. Uno de los procedimientos más básico en genómica y biología molecular, es la extracción y purificación de ácidos nucleicos. Por lo tanto, es necesario establecer métodos seguros y fiables para la separación de estos componentes celulares. Para lograr este objetivo, se utilizan diversos métodos de extracción dependiendo del tipo de tejido a emplear y del posterior uso de ese material genético.
- 3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN: El proceso de extracción de ADN es un paso importante para poder realizar estudios en el área de la biología molecular. Las bacterias son objetos de estudio elementales en los campos de la biología, la genética y la bioquímica moleculares debido a su capacidad para crecer rápidamente y a la facilidad relativa con la que pueden ser manipuladas. Realizando modificaciones en el ADN bacteriano de genes, enzimas y rutas metabólicas, pudiendo trasladar posteriormente estos conocimientos y examinando los fenotipos que resultan, los científicos pueden determinar la función a organismos más complejos a medida que la tecnología avanza también los descubrimientos, es así que, recordamos un poco de historia de cómo se obtuvo las primeras extracciones de ADN bacteria El ADN lo aisló por primera vez en 1869, el médico suizo Friedrich Miescher. Miescher realizaba experimentos acerca de la composición química del pus de vendas quirúrgicas desechadas, cuando notó un precipitado de una sustancia desconocida que caracterizó químicamente más tarde La llamó nucleína,debido a que lo había extraído a partir de núcleos celulares. Se necesitaron casi 70 años de investigación para poder identificar los componentes y la estructura de los ácidos nucleicos. En 1930 Levene y su maestro AlbrechtKossel probaron que la nucleína de Miescher es un ácido desoxirribonucleico (ADN) formado por cuatro bases nitrogenadas, el azúcar desoxirribosa y un grupo fosfato, y que, en su estructura básica, el nucleótido está compuesto por un azúcar unido a la base y al fosfato. Sin embargo, Levene pensaba que la cadena era corta y que las bases se repetían en un orden fijo. La función biológica del ADN comenzó a dilucidarse en 1928, con una serie básica de experimentos realizados por Frederick Griffith, quien estaba trabajando con cepas "lisas" (S) o "rugosas" (R) de la bacteria Pneumococcus (causante de la neumonía), según la presencia (S) o no (R) de una cápsula azucarada, que es la que confiere virulencia. Por tal razón vimos la importancia de realizar esta investigación porque es necesario conocer y utilizar un método adecuado en el laboratorio, ya que el objetivo dela extracción es el de obtener una muestra de buena calidad, es decir que tenga buen porcentaje de pureza como de rendimiento, es por tal razón que vimos la importancia de realizar un estudio de extracción de ADN.
- 4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: Hoy en día, existen muchos métodos de extracción de ADN que son utilizados de acuerdo a las características y objetivos de cada estudio, estos métodos muestran variabilidad en su rendimiento, sobre todo aquellos métodos simples y de bajo costo. Es necesario conocer la eficiencia cualitativa y cuantitativa de los diferentes métodos de extracción de ADN con el fin de su correcta aplicación, ya que el éxito de la aplicación de una técnica molecular dependerá de la calidad del ADN extraído. En este sentido se pretender dar respuesta a las siguientes preguntas de investigación: 1) Cuál será el método de extracción de ADN bacteriano de mejor calidad?, 2)Cuáles son las razones fundamentales para no utilizar el método casero más económico?, 3)Cuáles son las razones para utilizar el método de extracción más caro. OBJETIVO GENERAL Saber manejar los métodos de extracción de ADN de bacterias en el laboratorio MARCO TEORICO Bacterias: son células procariotas muy abundantes que pueden encontrarse en cualquier medio debido a la gran variedad de metabolismos que pueden presentar. Y adherirse a las distintas superficies, como a nuestras mucosas o a los catéteres. Pared bacteriana.. Las funciones de la pared bacteriana son: - Dar forma a la célula. - Proteger a la célula frente al choque osmótico, las bacterias sueles sobrevivir en ambientes hipoosmóticos, por lo que el agua de fuera tiende a entrar hacia el citoplasma. Si entra demasiada agua en la célula esta se hincharía y explotaría. La pared bacteriana evita que la célula se hinche demasiado.La pared bacteriana tendrá siempre un componente que es el peptidoglicano, una macromolécula formada por una parte peptídica y otra glucídica (N- acetilglucosamina y Ácido Nacetilmurámico). Los polisacáridos se unen entre si por enlaces beta-1-4: NAM- NAG-NAM-NAG NAM.... Esta cadena rodea totalmente a la bacteria, formando una especie de anillo a su alrededor. El NAM, tiene un grupo carboxilo libre que ejerce una gran atracción sobre los aminoácidos, que constituirán la parte peptídica que conforma el peptidoglicano. Al carecer las células humanas de pared este proceso es un buen lugar de actuación para los antibióticos. Las bacterias Gram+, está compuesta por múltiples capas a de peptidoglicano, pudiendo alcanzar unas 20-30 capas. Para aumentar la cohesión entre las capas, existen unas moléculas
- 5. especiales llamadas ácidos teitoicos, que se sitúan perpendicularmente a las distintas redes que cubren la bacteria. Por esta razón, la pared de estas bacterias es muy grande y porosa. Las bacterias Gram-, tiene una única capa de peptidoglicano rodeándola. Dicha capa se complementa con una capa más externa denominada membrana externa que no gobierna los intercambios pero que tiene una composición semejante a la membrana plasmática. Esta membrana dificulta la entrada y salida de sustancias de la célula. Para ello, existen una especie de poros perpediculares a la membrana, comunicando la parte de dentro con la de fuera. ADN bacteriano: el ADN está constituido por una sola molécula circular de tipo bicatenario, muy plegada, y que suele estar unida a los mesosomas. También puede haber una o más moléculas pequeñas de ADN extracromosómico, denominadas plásmidos. La región del ADN bacteriano que se encuentra condensada, asociada a proteínas parecidas a las histonas, se denomina nucleoide. La función del ADN es mantener y perpetuar la información genética y, mediante su expresión, dirigir el funcionamiento del metabolismo. Molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlace covalente. Dicha molécula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas bacterias poseen además ADN extracromosómico, también circular y cerrado, denominado ADN plasmídicopor estar contenido en los plásmidos. Éstos, portan información génica para muchas funciones que no son esenciales para la célula en condiciones normales de crecimiento. En términos bioquímicos la composición y estructura de los ácidos nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier célula. Conviene recordar brevemente, que los ácidos nucleicos son macromoléculas compuestas de nucleótidos unidos en forma covalente por medio de enlaces fosfodiester entre los carbonos de las posiciones 3´ y 5´ de dos residuos de azúcares adyacentes. Esta estructura forma un esqueleto de azúcares y fosfatos constante en toda la macromolécula. La variación entre los nucleótidos que constituyen la cadena de ácido nucleico, esta dada por sus bases nitrogenadas; para el ADN son: adenina (A), timina (T), citocina (C) y guanina (G) y para el ácido ribonucleico (ARN) son en lugar de timina, el uracilo (U). La A y G se denominan bases púricas o purinas, mientras que T, U, y C se denominan bases pirimidínicas o pirimidinas. Así, una cadena o hebra de ácido nucleico, tendrá una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen. El ADN como macromolécula, esta compuesto por dos cadenas nucleotídicas o hebras antiparalelas que se enlazan entre sí formando una doble hélice. Los enlaces entre ambas hebras de ADN están determinados por puentes de hidrógeno entre las purinas de una cadena,con las pirimidinas de la otra. Entonces, la A forma dos puentes de hidrógeno con la T, mientras que la C forma tres puentes de hidrógeno con la G. Dicho fenómeno se conoce como complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C lo separa la G Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hélice deADN,
- 6. en la cual se pueden distinguir pares de nucleótidos o pares de bases (pb). Estos pb. REACCIÓN DE LOS REACTIVOS Y MATERIALES. Fenol / cloroformo.Elimina las proteínas Isopropanol y etanol: precipitación del ADN Pepsina:disuelve el citoplasma sin atacar el núcleo Ebullición (combinado con congelación). Algunos fabricantesincorporan un paso de ebullición de la muestraprevio a la PCR como única acción para extraer el ADN dela muestra. Fenol: es, naturalmente, un poco soluble en agua, y da una interfaz difusa, que se afila por la presencia de cloroformo y alcohol isoamílico reduce la formación de espuma. La mayoría de las soluciones también tienen un antioxidante, como oxidado daños fenol los ácidos nucleicos.. Para la purificación del ADN, el pH es por lo general cerca de 7, momento en el que todos los ácidos nucleicos se encuentran en la fase acuosa. Alcohol isoamílico: alcohol isoamílico puede reducir la formación de espuma y garantizar la desactivación de RNasas. Gel de agarosa: El método se suele llevar a cabo sometiendo a las muestras de ADN extraído a un campo eléctrico para que las moléculas se muevan, a través de una matriz de agarosa que contiene bromuro de etidio, en función de su tamaño (la técnica de electroforesis la veremos con detenimiento en el apartado 8 de este trabajo). A la vez que las muestras problema, se procesanmuestras de ADN de cantidad conocida (patrones) ypor simple comparación de unas con las otras podremos estimara grosso modo la cantidad de ADN de cada muestra problema. Se trata de un sistema de cuantificación poco sensible pues es realmente difícil observar en el minigelcantidadesde ADN menoresque 5ηgr totales. Pero tiene la gran ventaja de que con este método se puede visualizar el grado de degradación de nuestras muestras problema; si el ADN está en buen estado aparecerá en el gel como una banda nítida que no ha recorrido mucha distancia desde el punto de aplicación de la muestra por tratarse de ADN de alto peso molecular, es decir, de gran tamaño. Si, por el contrario, muestro ADN está fragmentado, aparecerá en el gel una especie de “cola de degradación” (smear) a lo largo de la calle en la cual hemos aplicado la muestra debido a que existen fragmentos de diferentes tamaños que recorren diferentes distancias desde el punto de aplicación En este tipo de muestras degradadas, la cuantificación se hace aún más difícil por no poder realizarse una comparación adecuada con los patrones que son de alto peso molecular y aparecen como bandas nítidas.
- 7. MATERIALES Y METODOS METODOS DE EXTRACCION DE ADN BACTERIANO POR CLOROFORMO MATERIALES CULTIVO BACTERIANO E. COLI MICROPIPETA CENTRIFUGA VORTEX BUFFER – TE SDS FENOL CLOROFORMO ETANOL REFRIGERADOR METODO FENOL CLOROFORMO PRIMERO TOMAMOS 1.5ML de cultivo bacteriano E. coli, en un micro tuvo después se lleva a centrifugar a 10,000 revoluciones por minuto durante 2 minutos esto ayudara a concentrar el número de células, eliminando el sobrenadante por inmersión luego agregamos, 400microlitros de buffer te luego damos vortex por 30 segundos después agregamos 50 micro litros de SDS al 10%y mezclar por inmersión esto ayudara a romper la membrana, luego agregamos 400microlitros de fenol cloroformo el cual precipito proteínas y lípidos, llevamos a vortex durante 30 segundos. Volvemos a centrifugar a 12,000 revoluciones x minuto durante 5minutos esto ayudara a separar las faces luego de separar las fase acuosa y haberle trasladado a otro micro tubo agregar un volumen de etanol, llevamos a refrigerar a una temperatura de 0°centrigrados ha 10 minutos después centrifugar a 12.000 revoluciones por minuto durante 5 minutos luego descartar el sobre nadante por inmersión luego se deja secar a temperatura ambiente y finalmente agregar 50 micro litros de buffer te. Figura 1. Fuente propia
- 8. MAQUETA EQUIPO Y TECNICA DE EXTRACCION DE ADN DE BACTERIAS Figura 2. Fuente propia CONCLUSION Actualmente se cuenta con muchas firmas comerciales, que ofertan kits de extracción basados en diferentes principios. De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente estudio, será importante conocer la eficiencia de extracción de este método, con fin de optimizar el proceso de extracción en función al tipo de material biológico con el que se pretende trabajar. Este trabajo nos enseña que podamos realizar en casa la extracción de ADN no es difícil extraer el ADN el método de fenol cloroformo que se plazo en una maqueta son masque todo los pasos más simples que pude hacer ya que hay muchos métodos para extraer el ADN bacteriano como kits de extracción.