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  1. 1. SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENA- CGI TECNOLOGÍA EN QUÍMICA INDUSTRIAL Revisión: TÉCNICA DE FERMENTACIÓN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Fecha: FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA CON LA LEVADURA Saccharomyces Cerevisiae 1. OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL:  Mostrar la importancia de una tinción de Gram para la diferenciación de bacterias, basándose en las aplicaciones estructurales de la pared celular. 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:  Aplicar el mecanismo de la coloración de Gram con microorganismos conocidos y desconocidos.  Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram. 2. ALCANCE Por medio de la técnica (tinción de Gram) se identifican las levaduras adecuadas para la producción de alcohol carburante, la cual ayudara a elegir el mejor metabolito para la fermentación alcohólica.
  2. 2. 3. MATERIALES Y REACTIVOS  Porta objetos.  Mechero Bunsen.  Hisopo.  Asa de laboratorio.  Cristal violeta.  Aceite de inmersión.  Safranina o fucsina.  Azul de metileno.  Lugol (Solución yodo- yoduro).  Etanol.  Agua.  Cultivo de bacterias a identificar. 4. EQUIPOS  Microscopio. 5. PROCEDIMIENTO 5.1.TINCIÓN DE GRAM SIMPLE:  Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y proceder a su fijación.  Realizar la coloración cubriendo la preparación con abundante colorante y dejarlo actuar durante algún tiempo. Para la fucsina fenicada bastan de 15 a 30 segundos, para el cristal violeta es suficiente de 30 a 45 segundos y para el azul de metileno de 3 a 5 minutos.  Lavar con agua las preparaciones teñidas y continuar con la técnica tal y como se indica previamente.  Examinar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión. Observar la forma y disposición de los microorganismos teñidos con el colorante.
  3. 3. Figura 1. Procedimiento de tinción simple. 5.2.TINCIÓN DIFERENCIAL: Existen variaciones de esta técnica, pero en términos generales, la tinción de Gram involucra varios pasos:  Tinción inicial: Las células se tiñen con cristal violeta, el cual es un colorante primario. En este paso todas las células se tiñen de morado.  Mordente: se adiciona a yoduro (Lugol) que reacciona con el cristal violeta y forma un complejo cristal violeta-yoduro. En este paso todas las células continúan de color morado.  Decolorante: Se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando el complejo cristal violeta-yoduro de las células Gram negativas. De esta manera las bacterias Gram positivas continúan moradas y las Gram negativas quedan incoloras. Este es el paso crítico de esta tinción, pues si se exagera, decolora las Gram positivas y si se hace muy débil no decolora las Gram negativas.
  4. 4.  Contra tinción: Se vuelve a teñir con safranina o fucsina, de manera que las bacterias Gram negativas, que habían sido decoloradas, se tiñen de rosado a fucsia según el colorante empleado, en tanto, las bacterias Gram positivas no se afectan con la contra tinción y permanecen moradas debido a lo intenso de esta coloración. Figura 2. Procedimiento de tinción diferencial. 6. DATOS DE LABORATORIO: 6.1. MEJORES CONDICIONES PARA EL AISLAMIENTO DE LA LEVADURA: 6.1.1. Medios de cultivo utilizados en el laboratorio: o Preparación de medio de cultivo:  Revise la etiqueta de los medios de cultivo, anote el nombre, la composición y forma de preparación.  Realice los cálculos para preparar los siguientes volúmenes de medio de cultivo tanto líquido como sólido: 325, 356 ml, 1567 ml, 131 ml y 24 ml.  Prepare en un erlenmeyer 325 mililitros de agar. De acuerdo a las indicaciones de preparación se utilizan 20 gramos de medio deshidratado por litro de agua. Recuerde para el cálculo se realiza una regla de tres: 20 g....... 1000 ml X= (20 g x 325 mL)/1000 mL= 6.5 g. X g......... 325 ml
  5. 5.  Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua destilada con una probeta. De esos 325 mililitros de agua destilada coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con agua destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. El erlenmeyer debe ser de volumen superior a la cantidad que se va a preparar. Agregue los 6.5 gramos de agar deshidratado al agua contenida en el erlenmeyer y posteriormente adicione el resto del agua destilada. Mezcle con el agitador.  A continuación lleve la preparación a disolver en la plancha de calentamiento, agite constantemente con ayuda de la varilla de vidrio hasta que ebulla para lograr la disolución total del Agar. Mida el pH con ayuda de cinta indicadora de pH. El rango de pH en este medio es de 7.0 a 7.5. Si se hace necesario la corrección del pH, añada al medio de cultivo preparado la cantidad adecuada de solución de ácido clorhídrico o de hidróxido sódico según el caso.  Tape la boca del erlenmeyer con un tapón de papel kraft y selle con cinta de enmascarar. Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave, a 121 grados centígrados, durante 15 minutos.  Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45°C.  Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de Petri, previamente esterilizadas. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan “abanicando” brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique.  A continuación realice la prueba de esterilidad que consiste en llevar los medios a incubar a 37 grados centígrados durante 12 o 24 horas. Esta prueba se evalúa por la presencia o ausencia de crecimiento posterior a la incubación. Las placas con medio de cultivo y el caldo preparado son claras e incoloras hasta con una tonalidad amarillenta.  Prepare caldo nutritivo para tal fin solamente se emplean 8 gramos de Agar deshidratado por litro de agua. Realice la preparación de la misma manera. Dispense el caldo directamente en los tubos con tapa rosca. Posteriormente lleve los tubos con caldo a esterilizar en autoclave. No olvide que cuando se va a esterilizar medios directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada. Finalmente tenga en cuenta que para preparar Agar inclinado en tubo, solo cambia el momento en que se pone a solidificar ya que los tubos deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se forme el pico de agar inclinado.
  6. 6. o Siembra por estrías1 :  Marque la caja en 6 puntos.  Coloque la muestra en el punto número uno, realice estrías hasta el numero 2.  Esterilice el asa, tome las dos últimas estrías y extiéndalas hasta el numero 3, tome las dos últimas estrías y extiéndalas hasta el numero 4 y así sucesivamente hasta llegar al número 6. o Siembra de medio sólido a medio líquido:  Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha.  Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de él.  Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y déjela enfriar.  Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. 1 http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap309.htm
  7. 7.  Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tápelo y déjelo en una gradilla.  Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra, destápelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida.  Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo.  Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero después de usarla. Incube los tubos a 37ºC por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente. 6.2.CONDICIONES PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO:  Tolerancia de etanol y glucosa: 1. Glucosa al 10%  Cuadrante 1: 9 UFC  Cuadrante 2: 6 UFC  Cuadrante 3:15 UFC  Cuadrante 4:12 UFC 2. Glucosa al 4%  Cuadrante 1: 14 UFC  Cuadrante 2: 2 UFC  Cuadrante 3: 28 UFC  Cuadrante 4: 24 UFC
  8. 8. 3. Etanol al 4%  Cuadrante 1: 55 UFC  Cuadrante 2:54 UFC  Cuadrante 3: 21 UFC  Cuadrante 4: 23 UFC 4. Etanol 8%  Cuadrante 1: 38 UFC  Cuadrante 2:35 UFC  Cuadrante 3: 36 UFC  Cuadrante 4: 36 UFC 5. Etanol al 12 %  Cuadrante 1: 15 UFC  Cuadrante 2: 10 UFC  Cuadrante 3: 6 UFC  Cuadrante 4: 37 UFC o Representación de datos: MUESTRA ETANOL GLUCOSA 10 % UFC/ ml Tinción de Gram UFC/ ml Tinción de Gram 4% 8% 12% 4% 8% 12% Levadura de laboratorio 60 39 22 + + + Menor de 100 + Cáscara de jugo 16 10 50 – – – // // Jugo de mora 27 38 18 + + + // // Colada / 38 55 / – + 50 –  Convenciones: + Levaduras. – Muestra contaminada. // No existente.
  9. 9. o Promedios: Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se observa que las muestras de la levadura de laboratorio y del jugo de mora son las que se obtuvieron una mayor cantidad de levadura, para determinar cuál será la muestra que se utilizará para ser inoculada y utilizada en el proceso de fermentación se realiza un promedio, el cual concluirá con la muestra a utilizar, los resultados fueron:  Levadura de laboratorio: 60+39+22 = 40.3 UFC/mL 3  Jugo de mora: 27+38+18 = 27.6 UFC/mL 3 La muestra que será empleada para la inoculación y posteriormente la fermentación, será la levadura de laboratorio. 6.2.1. Análisis para las condiciones involucradas en el crecimiento microbiano: o Glucosa al 10%:  Presencia de moho, hifas y esporas en el cuadrante dos, unidad formadora de colonia 1. o Glucosa 4%  No se realizó la técnica debido a que se encontraba contaminada. o Etanol 8%  La muestra se encontró contaminada, la mayor parte contaba con una población de hifas.
  10. 10. o Etanol 12%  La muestra presentaba menor contaminación, de ésta se hizo el aislamiento de la levadura. 6.3.MUESTREO PARA EL FERMENTADO: Se realiza un muestreo constante durante la fermentación alcohólica, para ello se muestra a continuación las imágenes de la tinción de Gram de éstas muestras. 6.3.1. Tinción de Gram diluciones: Vista en el microscopio, objetivo 40X. Dilución 1x10 -1 Muestra 1.1 Presencia de Levaduras 35 UFC Muestra contaminada
  11. 11. Vista en el microscopio, objetivo 40X. Dilución 1x10 -2 Muestra 2.1 Presencia de Levaduras 16 UFC Vista en el microscopio, objetivo 40X. Dilución 1x10 -3 Muestra 3.1 Existe presencia de levaduras 2 UFC Muestra contaminada
  12. 12. Vista en el microscopio, objetivo 40X. Dilución 1x10 -3 Muestra 3.2 Presencia de Levaduras 1 UFC Vista en el microscopio, objetivo 40X. Dilución 1x10 -4 Muestra 4.2 Presencia de levaduras 1 UFC 7. ANÁLISIS DE RESULTADOS: Al encontrarse en la tinción de Gram que en algunas de las diluciones no sólo hubo presencia de levaduras, sino también de hongos, se comprueba que no se realizó un aislamiento completo de las mismas; esta contaminación pudo haber sido causa de una mala manipulación o una falla en el procedimiento del aislamiento de las levaduras. 8. CIBERGRAFÍA http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/3_4_2siem bra.htm

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