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“Inactivación microbiana por
nuevas tecnologías”
        Stella Maris Alzamora
           UBA - CONICET




            V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
                   AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES
                 La Plata, Pcia. de Buenos Aires, 9-11de octubre de 2012
                              Carrera de Microbiología Clínica e Industrial
                                       Facultad de Ciencias Veterinarias
                                UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA
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                                                       AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES




Nuevos agentes o factores de conservación de alimentos
Fuerzas impulsoras



  Inocuidad
  (en países desarrollados, 1/4 ó 1/3 de la población es afectada por
  ETA’s cada año) (Scalla et al., Em. Inf. Dis. 17, 17, 2011; Gkogka et al., Em. Inf. Dis.
  17, 1581, 2011).


  (el costo económico asociado a ETA’s en USA es mayor a 50
  billones de dólares/año, involucrando a más de 48 millones de
  personas) (Scharf, J. Food Prot. 75, 123, 2012)

  Calidad sensorial, nutricional o funcional de productos de
  consumo directo o de materias primas y productos intermedios
  antes de su industrialización
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Algunos factores emergentes “no térmicos” de
preservación
Factor                                          Aplicaciones potenciales para
                                                conservar alimentos/productos
                                                en el mercado
 Efecto volumétrico
• altas presiones hidrostáticas
 Aplicación de 100-800 Mpa debajo de            Dulces, jaleas, jugos y purés de frutas,
 0ºC hasta 100ºC, desde seg. hasta 20’,         yogur, salsas, guacamole, carnes cocidas y
 instantánea y uniformemente a través           curadas, ostras, comidas preparadas, etc.
 de todo el alimento                            (1990 - ). Pasteurización y esterilización
                                                asistidos por alta presión.
• ultrasonido
  Energía generada por ondas de sonido          Sugerido para pasteurización de
  de baja frecuencia (20-100 kHz) y alta        jugos, leche, etc.
  intensidad (10-1000 W/cm2)
 • pulsos eléctricos
  Aplicación de pulsos de alta intensidad       Sugerido para pasteurización de
 de campo eléctrico (10-80 kv/cm) de            leche, yogurt, jugos, huevo líquido,
 duración de micro a milisegundos               sopas, aderezos y otras bebidas
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 Efecto superficial

• luz UV-C
                                                 Pasteurización de alimentos líquidos
  Aplicación de radiación de la región del
                                                 (2000 - ). Descontaminación de
  espectro electromagnético entre 200 –
                                                 superficies de alimentos
  280 nm

• pulsos de luz
  Aplicación de pulsos intensos y de corta       Sugerido para la descontaminación de
 duración (1 µs á 0,1 s; 1-20 flashes            superficies de alimentos y de
 /seg) de luz blanca de amplio espectro,         alimentos líquidos
 desde el UV al IR (≅ 200 – 1100 nm)


 • sanitizantes                                  Descontaminación de superficies en
                                                 general, granos, algunas carnes,
   (O3, H2O2)
                                                 productos marinos, etc.
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Factores de inactivación “emergentes”

       Mecanismos de acción no totalmente elucidados.
       Efectivos contra células vegetativas pero esporas de bacterias y
       hongos y algunas enzimas son refractarias.
       A altas dosis, deterioro en la calidad y/o limitaciones técnicas
       equipos/tecnologías

                El concepto de preservación multifactorial
                (“hurdle effect”) constituye la base del
                procesamiento de alimentos mediante las
                nuevas tecnologías.
   Los microorganismos que no son inactivados durante el proceso o que son
   inhibidos en su crecimiento consumen energía para oponerse al medio hostil, sufren
   agotamiento metabólico y posteriormente mueren.
   La eficiencia de la inactivación puede ser incrementada por el uso de factores
   coadyuvantes.
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Factores de inactivación emergentes

¿Adopción industrial?
Mayor conocimiento en:
  Eficiencia en la inactivación de microorganismos
  Mecanismos de acción de los factores de inactivación, sólos y en
  combinación, y la respuesta microbiana
  Cinética de inactivación microbiana en función de la dosis y cuantificación
  de la conducta microbiana
  Evolución de los microorganismos tratados durante el almacenamiento
  Posibilidades de combinación

  Impacto de la dosis en la calidad, estructura y funcionalidad del
  alimento

  Uniformidad de los procesos

  Educación y comunicación
                                                                      (Heldman et al., 2008)
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Agenda

Cinética de inactivación microbiana por algunos factores
emergentes


 Modo de acción de los factores de inactivación en función
 de la dosis y el tipo de microorganismo


   Conducta microbiana durante el almacenamiento de
   alimentos tratados
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Agenda

Cinética de inactivación microbiana por algunos factores
emergentes


 Modo de acción de los factores de inactivación en función
 de la dosis y el tipo de microorganismo


   Conducta microbiana durante el almacenamiento de
   alimentos tratados
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Cinética de inactivación microbiana por algunos
factores emergentes

Patrones de inactivación

    Influenciados por:

     Tipo de microorganismo y estado fisiológico

     Agente de inactivación y niveles de aplicación; factores críticos
    del proceso

     Distribución y estado del microorganismo en el alimento (biofilm o
    cultivo planctónico)

     Dominio ambiental (composición del medio ambiente, aw, pH,
    medio líquido o sólido, temperatura, etc.)

     Presencia de coadyuvantes de la inactivación.
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Cinética de inactivación microbiana por algunos
factores emergentes

Tipo de microorganismo
                                                                 0

                                                                 -1

                                                                 -2




                                                     Log(N/No)
                                                                 -3

                                                                 -4

                                                                 -5

                                                                 -6
                                                                      0   5          10         15       20
                                                                                                 Time (min)

  Patrones de inactivación durante la aplicación        Patrones de inactivación durante la
  de altas presiones:                                   aplicación de UV-C en jugo de naranja:
  -- 375 MPa, L. monocytogenes en leche                -о- S. cerevisiae KE 162
  -+- 600 MPa, S. aureus en pollo                       -●- cocktail of yeasts
  -- 600 MPa, S. aureus en leche                        -∆- E. coli ATCC 35218
  -- 600 MPa, E. coli en solución de fosfato           -▲- cocktail of E. coli


         (Patterson et al., 1995)                                         (Char et al., 2009)
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Cinética de inactivación microbiana por algunos
factores emergentes

Tipo de agente/combinaciones
              0

             -1                                    Curvas de supervivencia de E. coli
                                                   ATCC35218 sujeto a US o a UV-C:
             -2
Log (N/No)




                                                   - o - agua peptona
             -3                                    -▲- jugo de manzana
             -4                                    -■- jugo de naranja
                                US
             -5

             -6
                  0   5   10     15           20
                                     Time (min)


             0

             -1

             -2                                                   Excepto en el caso de jugo de naranja,
Log (N/No)




             -3
                               UV-C                               el efecto letal de la luz UV-C fue 3-4
             -4
                                                                  veces mayor que el del US.
             -5

             -6
                  0   5   10    15            20
                                      Time (min)


                                                                                                     Char et al., 2009
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Cinética de inactivación microbiana por algunos
factores emergentes
Tipo de matriz



                                                                                 S. aureus
                    E. coli



                                                                E. coli
                       S. aureus




         300 MPa, agua peptona
                                                        300 MPa, jugo de zanahoria
  El jugo tuvo un efecto protector en S. aureus y un
  efecto ligeramente sensibilizante en E coli :
  modificación de las resistencias relativas.                             (Pilavtepe-Celik et al., 2009)
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Cinética de inactivación microbiana por algunos
factores emergentes

Tipo de matriz
                                                 Interacción de la radiación con el medio
                                                       de propagación y la muestra

                                                               Absorción
                                                               (decaimiento exponencial
                                                               de la intensidad con la
                                                               distancia, ley de Lambert-
                                                               Beer)


                                                                 Reflexión


               agua peptona pH 3,1                              Dispersión


 Esporas de Alyciclobacillus acidoterrestris
                                                                Refracción
    Pulsos de luz, 10 cm de la lámpara,
    3 pulsos/s, fluencia a 60 s: 95,5 J/cm2


                                                           (Ferrario et al., resultados no publicados, 2012)
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Cinética de inactivación microbiana por algunos factores
emergentes

Cultivos planctónicos vs biofilms
        Curvas de supervivencia de E. coli ATCC 35218 en biofilm y en solución
        buffer tratada con distintas concentraciones de peróxido de hidrógeno
                                  (%p/v) (25ºC; pH 3,3)
                             tiempo (min)                                                            tiempo(min)
                                                                               0   1     2     3     4     5     6   7     8     9    10
                 0     5      10           15   20   25
                                                                          0

          -0,5                                                                                           control
                                                                          -1
          -1,5

                                                                          -2
                                                                                                               pH 3,3
    )




          -2,5




                                                             Log (N/No)
                                                                          -3
          -3,5
    N
    g
    o
    (
    /
    l




                                   1,00%                                  -4
                                                                                                                0,50%
          -4,5                     1,00%
                                                                          -5
          -5,5                                                                               1,00%
                                                                               2,50%
                                                                                                    0,75%
                                     1,50%                                -6                   0,75%
          -6,5
                     2,00%                                                             1,50%                       0,50%
                                                                                   1,50%
             2,00%                 1,50%
                                                                          -7
                                                                                      1,00%
     Biofilm maduro en acero inoxidable                                            Desarrollo planctónico

                                                                                                                     (Raffellini et al.,2008)
Los biofilms representan sistemas biológicos con un alto nivel de
organización, donde los microorganismos forman comunidades
funcionales, estructuradas y coordinadas.
Células en el biofilm  protegidas de situaciones ambientales adversas
(estrés osmótico, calor, ácidos, radiaciones, biocidas, antibióticos, u otros
agentes biológicos).
Mayor resistencia comparadas con cultivos planctónicos.

Mecanismos múltiples de resistencia:
 Resistencia física a la penetración de los agentes biocidas por la matriz extracelular.
 Activación de la respuesta al estrés de la fase estacionaria por la alta densidad
celular.
 Subpoblación de fenotipos altamente protegidos para crecer en superficies.
 Producción de enzimas que degradan los antimicrobianos.
 Menor velocidad de crecimiento, menor metabolismo y por tanto más difíciles de
inactivar.


Consecuencias:
 Serios problemas higiénicos (contaminación microbiana del
producto, persistencia de patógenos en superficies, pérdidas
económicas por deterioro).
Diseño subdimensionado de procesos si estos se basan en
cinéticas en medios planctónicos.
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
                                                            AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES


Cinética de inactivación microbiana por algunos
factores emergentes
Modelado matemático de las curvas de supervivencia

                                Enfoque mecanístico vs enfoque vitalístico
                                                                              Una subpoblación altamente
La intensidad del factor
                                                                              resistente permanece viable
debe exceder un valor
                                                                              durante un tiempo largo de
umbral antes de que         L                        L
                                                                              tratamiento y/o se adapta al estrés
ocurra inactivación         o                        o                        (heterogeneidad en la respuesta
(heterogeneidad en la       g                        g
                                  con “hombro                                 de la población al factor de
respuesta de la
                                                                              estrés)
población al factor de      N                        N           con “cola”
estrés)

                                        tiempo                   tiempo
Cada miembro de la
población tiene la
misma sensibilidad al
                            L
factor, pero sólo una                                 L
                            o
fracción se afecta por                                o
el tratamiento letal a un   g
                                                      g           sigmoidea
dado tiempo
(homogeneidad en la         N       lineal
                                                      N
respuesta de la
población al factor de
estrés)                                 tiempo                  tiempo
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Cinética de inactivación microbiana por algunos
factores emergentes
Modelado matemático de las curvas de supervivencia
Modelo de distribución de resistencias tipo Weibull

 loge N(t)/No = -btn                                  b: parámetro de escala o de veloc. no lineal
                                                      n: parámetro de forma
                                    tiempo(min)                                                        tiempo(min)
                    0   1   2   3   4    5    6   7    8   9   10                      0   1   2   3   4   5         6   7   8   9   10
               0
                                        pH 3,3                                     0

               -1

                                                                                                                         pH 7,2
                                                                               -1

               -2                                                              -2
  Log (N/No)




               -3                                                              -3

                                  0,50%                               log (N/No)
               -4
                 2,50% 1,00% 0,75%                                             -4


               -5  1,50%                                                       -5


               -6                                                              -6


               -7                                                              -7


Efecto de la concentración de peróxido de hidrógeno (%p/v) y el pH en la inactivación de E. coli
ATCC 35218 (25ºC; soluciones buffer de ácido cítrico – Na2HPO4)
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- Frecuencia de distribución de resistencias de E. coli a peróxido de
hidrógeno

                                                                                      La magnitud de los parámetros
                                                                                      b, n, moda, promedio, varianza y
                             1
                                                                                      coeficiente de asimetría de la
                                                     0,75 % H2O2
                                                                                      distribución varían con el medio y
                            0,8
                                                                                      con la dosis del agente letal.
       Frecuencia (1/min)




                            0,6

                                                                                      Conforme se incrementa la dosis
                                                        Reducción de pH
                            0,4
                                                                                      del agente letal o los parámetros
                            0,2
                                                                                      del medio se hacen más
                                                                                      desfavorables, la distribución se
                             0
                                  0    1   2   3    4    5   6    7   8   9    10
                                                                                      corre a tiempos menores, y
                                                   Tiempo (min)                       disminuye la varianza, indicando
                                                                                      una población más homogénea
                                                                                      en su respuesta.
                                      diferentes pHs (25ºC)
                              3,3 -  4,4 -  5,8 -  7,2

                                                                                                       (Raffellini et al. 2004)
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Agenda

Cinética de inactivación microbiana por algunos factores
emergentes


 Modo de acción de los factores de inactivación en función
 de la dosis y el tipo de microorganismo


   Conducta microbiana durante el almacenamiento de
   alimentos tratados
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Modo de acción de los factores de inactivación en
función de la dosis y el tipo de microorganismo


Células            Aquellas células capaces de realizar todas las
viables            funciones celulares necesarias para la
                   supervivencia en circunstancias determinadas




Criterio y método usual para evaluar viabilidad
 Habilidad de las células para reproducirse.
 (Recuento en placa).

   No se cuentan microorganismos que no forman colonias:
    muertos
    dañados subletalmente
    viables pero no cultivables
                                                                (Breeuwer & Abee, 2000)
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                   Citometría de flujo



            Detectores de                      Luz desviada a ángulos
Detector    luz roja y                        altos y bajos: tamaño y
de luz      naranja
                                              granularidad (complejidad
reflejada
a 90º                       Detector de       interna) de las células.
                            luz verde          Emisión de
                                              fluorescencia: estado
                                              fisiológico de las células a
Detector
                                              nivel individual.
de luz                                         500-5000 cél./seg
incidente             Espejos reflectores      Digitalización de la
                      de luz de
                      determinadas
                                              información y presentación
                      longitudes de onda      de resultados como
                                              histogramas o gráficos de
                                              puntos.
            Fuente de luz
            láser
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  1            2




                       Gráfico de densidad de fluorescencia (IP vs FDA)
  3
                4




Cuadrante         Propiedades de         Explicación posible de los mecanismos
               fluorescencia de las              celulares involucrados
            células de cada cuadrante
      1              F– PI+              Actividad de esterasa negativa,
                                         membranas comprometidas

      2              F+ PI+              Esterasa activa, membranas
                                         mínimamente dañadas

      3               F– PI-             Actividad de esterasa no detectable (o
                                         expulsión de F de las células),
                                         membranas intactas
      4               F+ PI-             Esterasa activa, membranas intactas
S. cerevisiae
                                                                                                  0 min            1 min                     2 min
Gráficos de densidad de fluorescencia de células                                         1                2        1           2        1            2


 teñidas con FDA y PI y sometidas a diferentes
   tiempos de exposición a UV-C (0-5 kJ/m2)

                     2
                                                                                                                                        3            4
                                                  Recuento
                                                                                         3                4    3               4


                     0
                                                  de viables
                     -2                                                                                        1               2        1            2
       Log (N/No)




                     -4                    L. innocua

                     -6            E. coli
                     -8       S. cerevisiae                                                                                                          4
                                                                                                               3               4        3


                    -10
                          0        2         4      6       8           10                       3 min                 5 min                10 min
                                                            Time (min)
                                                                                                              L. innocua
                                                                                                  0 min          1 min                 2 min
                                                  E. coli
                      0 min                       1 min                      2 min           1            2                        1             2


              1                        2      1              2      1                2




                                                                                             3            4                        3             4
              3                        4      3                 4   3                4




               1                       2      1              2      1                2




              3                        4      3              4      3                4




                      3 min                       5 min                      7 min               3 min                 5 min           8 min
0 min                 5 min
  Gráficos de densidad de fluorescencia de                              a                         b
                                                                    1                     2   1                    2
células de S. cerevisiae teñidas con FDA y PI
     y sometidas a diferentes tiempos de
exposición a ultrasonido (20 kHz, 600 W, 45ºC,
         95,2 μm de amplitud de onda)
                                                                    3                         3
                                                                                          4                        4

                              0,5
                 Log (N/No)




                                0                                           c    10 min       d       15 min
                                                                        1                 2   1                2
                              -0,5



                               -1



                              -1,5



                               -2
                                     0   5   10   15   20     25

                                                       Time (min)
                                                                    3                     4   3                4

      Curva de supervivencia de S.
      cerevisiae durante el tratamiento                                                       e
                                                                                                      20 min
                                                                                              1                2
      ultrasónico en caldo Sabouraud.

  A los 20 min de tratamiento, el recuento de viables indicó más de 1 ciclo
  log de reducción pero el estudio de citometría de flujo reveló sólo 37% de
  células con daño en membrana (cuadrantes 1+ 2)             la pérdida de
                                                                                              3                4
  viabilidad de la levadura no ocurre sólo por daño a membranas

  (Alzamora et al., 2010)
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
                                               AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES


c
o
                                        La acción disruptiva del ultrasonido se
n
                                        refleja en varios blancos en la célula de
tr
                                        la levadura: pared celular, membrana
ol
                   C            C       citoplasmática, estructura interna.


                                        Pérdida de material interno
s                                       Restos de pared celular y membrana
o                                       plasmática
n                                       Disrupción contenido interno
i                 S              S      Hinchamiento de pared celular con
                   C
c                  B                    encogimiento material interno y
a                  A
                                        completa disrupción de organelas.
d
a
s
                   S                S

     Imágenes de TEM de células de
     S. cerevisiae sonicadas 20 min.
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Agenda

Cinética de inactivación microbiana por algunos factores
emergentes


 Modo de acción de los factores de inactivación en función
 de la dosis y el tipo de microorganismo


   Conducta microbiana durante el almacenamiento de
   alimentos tratados
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
                                                     AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES


Conducta microbiana durante el almacenamiento de
alimentos tratados
Estudios focalizados en
 microorganismos patógenos más que en microorganismos deteriorantes,
 el efecto del tratamiento per se más que en la conducta durante el almacenamiento.

Muchas de estas tecnologías combinadas pueden:
extender la vida útil
incrementar la inocuidad
aumentar la vida útil y la inocuidad

Problemas potenciales?
 La prolongación de la vida útil por reducción de la microflora incrementa la probabilidad
de crecimiento de los patógenos resistentes a la inactivación durante el almacenamiento,
agravado por la destrucción de la flora competitiva.
 Si el daño a la estructura del alimento por el tratamiento de inactivación es alto se
puede incrementar el crecimiento de patógenos remanentes durante el almacenamiento
(pérdida de fluidos con nutrientes).

       Estudio integrado de flora nativa y de patógenos después del
          tratamiento y a lo largo del almacenamiento pretendido
                                                           Gómez-López et al., 2008; Alzamora et al., 2012
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
                                                                                   AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES

    Ejemplo:                    Manzanas cortadas
    Irradiadas con pulsos de luz a 10 cm o 5 cm de la lámpara.
    Supervivencia de m.o. inoculados y evolución de la flora nativa a 5ºC

                            Tratamiento per se                                                                       Almacenamiento
                                          E. coli                                                            Flora nativa: bacterias totales
                                                                                                       250

                                                                                                       200          control
                                                             10 cm
                                                                                                                    10 s, 10 cm




                                                                                           N (UFC/g)
                                                                                                       150           60 s, 10 cm
                                                                                                       100

                                                                                                        50
                                                              5 cm
                                                                                                         0
                                                                                                             0           2             4            6     8
                                                                                                                                 Storage time (day)

                                                                                                                 Flora nativa: hongos y levaduras
                                          L. innocua
                       0                                                                               400
                     -0.5                                                                              350          control
                      -1
                                                           10 cm                                       300          10 s, 10 cm




                                                                                   N (UFC/g)
       Log (N/N0 )




                                                                                                       250           60 s, 10 cm
                     -1.5
                                                                                                       200
                      -2                                      5 cm                                     150
                     -2.5                                                                              100
                      -3                                                                               50
                            0   20   40      60       80   100     120                                  0
                                      Exposure time (s)                                                      0               2            4           6       8
                                                                                                                                   Storage time (day)

                                                                                                                    Almacenamiento:después de 10s
                                                    Incremento de inocuidad y vida útil                             ó 60s de radiación:
(Gómez et al., 2011)
                                                    aún a la menor dosis (10s- 10 cm)                               No existió crecimiento de E. coli
                                                                                                                    Reducción de L. innocua
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
                                                                                                                   AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES
    Ejemplo:              Jugo de naranja
    Adicionado con antimicrobianos naturales, irradiado con luz UV-C 30 min y almacenado en refrigeración
        UV-C        UV-C/100 ppm citral/1000 ppm vanillina          UV-C/50 ppm citral/1500 ppm vanillina


                          S. cerevisiae                                                                     E. coli                                                                   L. innocua
                                                                            A                                                                        C                                                                            D
                                                                                                                                                                      0       5       10       15         20       25    30
                  0       5       10          15       20        25    30                0        5        10          15        20        25    30
                                                                                                                                                             0
P           0                                                                       0
                                                                                                                                                             -1
R                                                                                   -1
O           -1                                                                                                                                               -2
C                                                                                   -2
                                                                                                                                                             -3
E           -2




                                                                                N




                                                                                                                                                         N
                                                                                    -3




                                                                                g
                                                                                o
                                                                                L




                                                                                                                                                         g
                                                                                                                                                         o
                                                                                                                                                         L
       N




                                                                                /
       g
       o
       L




                                                                                                                                                         /
S
       /




                                                                                                                                                             -4
                                                                                    -4
O           -3
                                                                                                                                                             -5
                                                                                    -5
            -4                                                                                                                                               -6
                                       Time (min)                                   -6                              Time (min)                                                             Time (min)
A
L                                                                           A
M            -1       1       3   5       7        9        11   13   15
                                                                                         -1   1       3         5      7    9         11    13
                                                                                                                                                 C
                                                                                                                                                                 -1       1       3        5        7          9    11
                                                                                                                                                                                                                              D

A            0
                                                                                         0
                                                                                                                                                             -0,5
C          -0,5                                                                      -0,5
                                                                                                                                                             -1,5
E           -1                                                                           -1
                                                                                     -1,5
N          -1,5
                                                                                         -2
                                                                                                                                                             -2,5

A           -2
                                                                                     -2,5
                                                                                                                                                             -3,5
      N




                                                                                                                                                         N
M
                                                                                N
      g
      o
      L




           -2,5                                                                                                                                              -4,5




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E          -3,5
                                                                                     -4,5
                                                                                                                                                             -6,5

N           -4
                                                                                         -5                                                                  -7,5
                                         Time (day)                                                       Time (day)                                                                  Time (day)
T
O

        Los antimicrobianos no mejoraron la inactivación por irradiación con luz UV-C pero en
        determinadas concentraciones se minimizó el desarrollo de las levaduras que resistieron el
        tratamiento con luz UV-C o que se recuperaron después del mismo                UV-C como único
        factor contribuiría a la inocuidad sin modificar la vida útil pero ésta se incrementaría por el
        agregado de 100 ppm de citral y 1000 ppm de vainillina.
                                                                                                                                                                                                        Ferrario et al., 2011
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
                                            AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES




Conclusiones

 Cinética de inactivación

 Específica para un dado microorganismo, dominio ambiental y factor
 de inactivación (en combinación o no con otros factores de estrés).

  Evaluación en microorganismos adheridos en biofilms.

  Cuantificación de la cinética de inactivación microbiana por modelos
 de distribución de resistencias de acuerdo al enfoque vitalístico


 Estudios simultáneos de la respuesta microbiana de la flora
 nativa y de los microorganismos inoculados, tanto en el
 tratamiento per se como durante el almacenamiento
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y
              AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES




Muchas gracias!

                   Grupo de investigación
                   Dra Sandra Guerrero
                   Dra Cielo Char
                   Dra Silvia Raffellini
                   Dra Marcela Schenk
                   Lic. Mariana Ferrario

                    smalzamora@gmail.com
Factors affecting inactivation and explaining the
great variance values of the mean inactivation time

   The presence of colored compounds and pulp particles which
caused poor UV-C light transmission (UV-C light absorption by
dissolved solids; UV-C scattering and reflection, and a site
for the aggregation of bacteria to particles surfaces by solids
in suspension).

   The complex flow pattern in the system and the great
distribution of residence times.


  The difference in the response per se between the members
of E. coli population (different sensibility to the treatment).
Gráficos de densidad de fluorescencia de
                          Agua peptonada pH 5,6
                                                         células de S. cerevisiae teñidas con cFDA
                                                          y PI y sometidas a diferentes tiempos de
                        Jugo de manzana comercial         exposición a pulsos de luz (0-71,6 J/cm2)
Agua peptonada pH 3,5




     0s                   1s                        5s         10 s         20 s              60 s

                                                                                        Agua peptonada pH 3,5




                                                                                        Agua peptonada pH 5,6




                                                                                     Jugo de manzana comercial

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  • 1. “Inactivación microbiana por nuevas tecnologías” Stella Maris Alzamora UBA - CONICET V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES La Plata, Pcia. de Buenos Aires, 9-11de octubre de 2012 Carrera de Microbiología Clínica e Industrial Facultad de Ciencias Veterinarias UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA
  • 2. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Nuevos agentes o factores de conservación de alimentos Fuerzas impulsoras Inocuidad (en países desarrollados, 1/4 ó 1/3 de la población es afectada por ETA’s cada año) (Scalla et al., Em. Inf. Dis. 17, 17, 2011; Gkogka et al., Em. Inf. Dis. 17, 1581, 2011). (el costo económico asociado a ETA’s en USA es mayor a 50 billones de dólares/año, involucrando a más de 48 millones de personas) (Scharf, J. Food Prot. 75, 123, 2012) Calidad sensorial, nutricional o funcional de productos de consumo directo o de materias primas y productos intermedios antes de su industrialización
  • 3. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Algunos factores emergentes “no térmicos” de preservación Factor Aplicaciones potenciales para conservar alimentos/productos en el mercado Efecto volumétrico • altas presiones hidrostáticas Aplicación de 100-800 Mpa debajo de Dulces, jaleas, jugos y purés de frutas, 0ºC hasta 100ºC, desde seg. hasta 20’, yogur, salsas, guacamole, carnes cocidas y instantánea y uniformemente a través curadas, ostras, comidas preparadas, etc. de todo el alimento (1990 - ). Pasteurización y esterilización asistidos por alta presión. • ultrasonido Energía generada por ondas de sonido Sugerido para pasteurización de de baja frecuencia (20-100 kHz) y alta jugos, leche, etc. intensidad (10-1000 W/cm2) • pulsos eléctricos Aplicación de pulsos de alta intensidad Sugerido para pasteurización de de campo eléctrico (10-80 kv/cm) de leche, yogurt, jugos, huevo líquido, duración de micro a milisegundos sopas, aderezos y otras bebidas
  • 4. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Efecto superficial • luz UV-C Pasteurización de alimentos líquidos Aplicación de radiación de la región del (2000 - ). Descontaminación de espectro electromagnético entre 200 – superficies de alimentos 280 nm • pulsos de luz Aplicación de pulsos intensos y de corta Sugerido para la descontaminación de duración (1 µs á 0,1 s; 1-20 flashes superficies de alimentos y de /seg) de luz blanca de amplio espectro, alimentos líquidos desde el UV al IR (≅ 200 – 1100 nm) • sanitizantes Descontaminación de superficies en general, granos, algunas carnes, (O3, H2O2) productos marinos, etc.
  • 5. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Factores de inactivación “emergentes” Mecanismos de acción no totalmente elucidados. Efectivos contra células vegetativas pero esporas de bacterias y hongos y algunas enzimas son refractarias. A altas dosis, deterioro en la calidad y/o limitaciones técnicas equipos/tecnologías El concepto de preservación multifactorial (“hurdle effect”) constituye la base del procesamiento de alimentos mediante las nuevas tecnologías. Los microorganismos que no son inactivados durante el proceso o que son inhibidos en su crecimiento consumen energía para oponerse al medio hostil, sufren agotamiento metabólico y posteriormente mueren. La eficiencia de la inactivación puede ser incrementada por el uso de factores coadyuvantes.
  • 6. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Factores de inactivación emergentes ¿Adopción industrial? Mayor conocimiento en: Eficiencia en la inactivación de microorganismos Mecanismos de acción de los factores de inactivación, sólos y en combinación, y la respuesta microbiana Cinética de inactivación microbiana en función de la dosis y cuantificación de la conducta microbiana Evolución de los microorganismos tratados durante el almacenamiento Posibilidades de combinación Impacto de la dosis en la calidad, estructura y funcionalidad del alimento Uniformidad de los procesos Educación y comunicación (Heldman et al., 2008)
  • 7. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Agenda Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Modo de acción de los factores de inactivación en función de la dosis y el tipo de microorganismo Conducta microbiana durante el almacenamiento de alimentos tratados
  • 8. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Agenda Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Modo de acción de los factores de inactivación en función de la dosis y el tipo de microorganismo Conducta microbiana durante el almacenamiento de alimentos tratados
  • 9. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Patrones de inactivación Influenciados por:  Tipo de microorganismo y estado fisiológico  Agente de inactivación y niveles de aplicación; factores críticos del proceso  Distribución y estado del microorganismo en el alimento (biofilm o cultivo planctónico)  Dominio ambiental (composición del medio ambiente, aw, pH, medio líquido o sólido, temperatura, etc.)  Presencia de coadyuvantes de la inactivación.
  • 10. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Tipo de microorganismo 0 -1 -2 Log(N/No) -3 -4 -5 -6 0 5 10 15 20 Time (min) Patrones de inactivación durante la aplicación Patrones de inactivación durante la de altas presiones: aplicación de UV-C en jugo de naranja: -- 375 MPa, L. monocytogenes en leche -о- S. cerevisiae KE 162 -+- 600 MPa, S. aureus en pollo -●- cocktail of yeasts -- 600 MPa, S. aureus en leche -∆- E. coli ATCC 35218 -- 600 MPa, E. coli en solución de fosfato -▲- cocktail of E. coli (Patterson et al., 1995) (Char et al., 2009)
  • 11. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Tipo de agente/combinaciones 0 -1 Curvas de supervivencia de E. coli ATCC35218 sujeto a US o a UV-C: -2 Log (N/No) - o - agua peptona -3 -▲- jugo de manzana -4 -■- jugo de naranja US -5 -6 0 5 10 15 20 Time (min) 0 -1 -2 Excepto en el caso de jugo de naranja, Log (N/No) -3 UV-C el efecto letal de la luz UV-C fue 3-4 -4 veces mayor que el del US. -5 -6 0 5 10 15 20 Time (min) Char et al., 2009
  • 12. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Tipo de matriz S. aureus E. coli E. coli S. aureus 300 MPa, agua peptona 300 MPa, jugo de zanahoria El jugo tuvo un efecto protector en S. aureus y un efecto ligeramente sensibilizante en E coli : modificación de las resistencias relativas. (Pilavtepe-Celik et al., 2009)
  • 13. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Tipo de matriz Interacción de la radiación con el medio de propagación y la muestra Absorción (decaimiento exponencial de la intensidad con la distancia, ley de Lambert- Beer) Reflexión agua peptona pH 3,1 Dispersión Esporas de Alyciclobacillus acidoterrestris Refracción Pulsos de luz, 10 cm de la lámpara, 3 pulsos/s, fluencia a 60 s: 95,5 J/cm2 (Ferrario et al., resultados no publicados, 2012)
  • 14. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Cultivos planctónicos vs biofilms Curvas de supervivencia de E. coli ATCC 35218 en biofilm y en solución buffer tratada con distintas concentraciones de peróxido de hidrógeno (%p/v) (25ºC; pH 3,3) tiempo (min) tiempo(min) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 5 10 15 20 25 0 -0,5 control -1 -1,5 -2 pH 3,3 ) -2,5 Log (N/No) -3 -3,5 N g o ( / l 1,00% -4 0,50% -4,5 1,00% -5 -5,5 1,00% 2,50% 0,75% 1,50% -6 0,75% -6,5 2,00% 1,50% 0,50% 1,50% 2,00% 1,50% -7 1,00% Biofilm maduro en acero inoxidable Desarrollo planctónico (Raffellini et al.,2008)
  • 15. Los biofilms representan sistemas biológicos con un alto nivel de organización, donde los microorganismos forman comunidades funcionales, estructuradas y coordinadas. Células en el biofilm  protegidas de situaciones ambientales adversas (estrés osmótico, calor, ácidos, radiaciones, biocidas, antibióticos, u otros agentes biológicos). Mayor resistencia comparadas con cultivos planctónicos. Mecanismos múltiples de resistencia:  Resistencia física a la penetración de los agentes biocidas por la matriz extracelular.  Activación de la respuesta al estrés de la fase estacionaria por la alta densidad celular.  Subpoblación de fenotipos altamente protegidos para crecer en superficies.  Producción de enzimas que degradan los antimicrobianos.  Menor velocidad de crecimiento, menor metabolismo y por tanto más difíciles de inactivar. Consecuencias:  Serios problemas higiénicos (contaminación microbiana del producto, persistencia de patógenos en superficies, pérdidas económicas por deterioro). Diseño subdimensionado de procesos si estos se basan en cinéticas en medios planctónicos.
  • 16. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Modelado matemático de las curvas de supervivencia Enfoque mecanístico vs enfoque vitalístico Una subpoblación altamente La intensidad del factor resistente permanece viable debe exceder un valor durante un tiempo largo de umbral antes de que L L tratamiento y/o se adapta al estrés ocurra inactivación o o (heterogeneidad en la respuesta (heterogeneidad en la g g con “hombro de la población al factor de respuesta de la estrés) población al factor de N N con “cola” estrés) tiempo tiempo Cada miembro de la población tiene la misma sensibilidad al L factor, pero sólo una L o fracción se afecta por o el tratamiento letal a un g g sigmoidea dado tiempo (homogeneidad en la N lineal N respuesta de la población al factor de estrés) tiempo tiempo
  • 17. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Modelado matemático de las curvas de supervivencia Modelo de distribución de resistencias tipo Weibull loge N(t)/No = -btn b: parámetro de escala o de veloc. no lineal n: parámetro de forma tiempo(min) tiempo(min) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 pH 3,3 0 -1 pH 7,2 -1 -2 -2 Log (N/No) -3 -3 0,50% log (N/No) -4 2,50% 1,00% 0,75% -4 -5 1,50% -5 -6 -6 -7 -7 Efecto de la concentración de peróxido de hidrógeno (%p/v) y el pH en la inactivación de E. coli ATCC 35218 (25ºC; soluciones buffer de ácido cítrico – Na2HPO4)
  • 18. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES - Frecuencia de distribución de resistencias de E. coli a peróxido de hidrógeno La magnitud de los parámetros b, n, moda, promedio, varianza y 1 coeficiente de asimetría de la 0,75 % H2O2 distribución varían con el medio y 0,8 con la dosis del agente letal. Frecuencia (1/min) 0,6 Conforme se incrementa la dosis Reducción de pH 0,4 del agente letal o los parámetros 0,2 del medio se hacen más desfavorables, la distribución se 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 corre a tiempos menores, y Tiempo (min) disminuye la varianza, indicando una población más homogénea en su respuesta. diferentes pHs (25ºC)  3,3 -  4,4 -  5,8 -  7,2 (Raffellini et al. 2004)
  • 19. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Agenda Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Modo de acción de los factores de inactivación en función de la dosis y el tipo de microorganismo Conducta microbiana durante el almacenamiento de alimentos tratados
  • 20. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Modo de acción de los factores de inactivación en función de la dosis y el tipo de microorganismo Células Aquellas células capaces de realizar todas las viables funciones celulares necesarias para la supervivencia en circunstancias determinadas Criterio y método usual para evaluar viabilidad  Habilidad de las células para reproducirse. (Recuento en placa). No se cuentan microorganismos que no forman colonias:  muertos  dañados subletalmente  viables pero no cultivables (Breeuwer & Abee, 2000)
  • 21. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Citometría de flujo Detectores de  Luz desviada a ángulos Detector luz roja y altos y bajos: tamaño y de luz naranja granularidad (complejidad reflejada a 90º Detector de interna) de las células. luz verde  Emisión de fluorescencia: estado fisiológico de las células a Detector nivel individual. de luz  500-5000 cél./seg incidente Espejos reflectores  Digitalización de la de luz de determinadas información y presentación longitudes de onda de resultados como histogramas o gráficos de puntos. Fuente de luz láser
  • 22. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES 1 2 Gráfico de densidad de fluorescencia (IP vs FDA) 3 4 Cuadrante Propiedades de Explicación posible de los mecanismos fluorescencia de las celulares involucrados células de cada cuadrante 1 F– PI+ Actividad de esterasa negativa, membranas comprometidas 2 F+ PI+ Esterasa activa, membranas mínimamente dañadas 3 F– PI- Actividad de esterasa no detectable (o expulsión de F de las células), membranas intactas 4 F+ PI- Esterasa activa, membranas intactas
  • 23. S. cerevisiae 0 min 1 min 2 min Gráficos de densidad de fluorescencia de células 1 2 1 2 1 2 teñidas con FDA y PI y sometidas a diferentes tiempos de exposición a UV-C (0-5 kJ/m2) 2 3 4 Recuento 3 4 3 4 0 de viables -2 1 2 1 2 Log (N/No) -4 L. innocua -6 E. coli -8 S. cerevisiae 4 3 4 3 -10 0 2 4 6 8 10 3 min 5 min 10 min Time (min) L. innocua 0 min 1 min 2 min E. coli 0 min 1 min 2 min 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 3 4 3 4 3 4 3 4 3 4 1 2 1 2 1 2 3 4 3 4 3 4 3 min 5 min 7 min 3 min 5 min 8 min
  • 24. 0 min 5 min Gráficos de densidad de fluorescencia de a b 1 2 1 2 células de S. cerevisiae teñidas con FDA y PI y sometidas a diferentes tiempos de exposición a ultrasonido (20 kHz, 600 W, 45ºC, 95,2 μm de amplitud de onda) 3 3 4 4 0,5 Log (N/No) 0 c 10 min d 15 min 1 2 1 2 -0,5 -1 -1,5 -2 0 5 10 15 20 25 Time (min) 3 4 3 4 Curva de supervivencia de S. cerevisiae durante el tratamiento e 20 min 1 2 ultrasónico en caldo Sabouraud. A los 20 min de tratamiento, el recuento de viables indicó más de 1 ciclo log de reducción pero el estudio de citometría de flujo reveló sólo 37% de células con daño en membrana (cuadrantes 1+ 2) la pérdida de 3 4 viabilidad de la levadura no ocurre sólo por daño a membranas (Alzamora et al., 2010)
  • 25. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES c o La acción disruptiva del ultrasonido se n refleja en varios blancos en la célula de tr la levadura: pared celular, membrana ol C C citoplasmática, estructura interna. Pérdida de material interno s Restos de pared celular y membrana o plasmática n Disrupción contenido interno i S S Hinchamiento de pared celular con C c B encogimiento material interno y a A completa disrupción de organelas. d a s S S Imágenes de TEM de células de S. cerevisiae sonicadas 20 min.
  • 26. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Agenda Cinética de inactivación microbiana por algunos factores emergentes Modo de acción de los factores de inactivación en función de la dosis y el tipo de microorganismo Conducta microbiana durante el almacenamiento de alimentos tratados
  • 27. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Conducta microbiana durante el almacenamiento de alimentos tratados Estudios focalizados en  microorganismos patógenos más que en microorganismos deteriorantes,  el efecto del tratamiento per se más que en la conducta durante el almacenamiento. Muchas de estas tecnologías combinadas pueden: extender la vida útil incrementar la inocuidad aumentar la vida útil y la inocuidad Problemas potenciales?  La prolongación de la vida útil por reducción de la microflora incrementa la probabilidad de crecimiento de los patógenos resistentes a la inactivación durante el almacenamiento, agravado por la destrucción de la flora competitiva.  Si el daño a la estructura del alimento por el tratamiento de inactivación es alto se puede incrementar el crecimiento de patógenos remanentes durante el almacenamiento (pérdida de fluidos con nutrientes). Estudio integrado de flora nativa y de patógenos después del tratamiento y a lo largo del almacenamiento pretendido Gómez-López et al., 2008; Alzamora et al., 2012
  • 28. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Ejemplo: Manzanas cortadas Irradiadas con pulsos de luz a 10 cm o 5 cm de la lámpara. Supervivencia de m.o. inoculados y evolución de la flora nativa a 5ºC Tratamiento per se Almacenamiento E. coli Flora nativa: bacterias totales 250 200  control 10 cm  10 s, 10 cm N (UFC/g) 150  60 s, 10 cm 100 50 5 cm 0 0 2 4 6 8 Storage time (day) Flora nativa: hongos y levaduras L. innocua 0 400 -0.5 350  control -1 10 cm 300  10 s, 10 cm N (UFC/g) Log (N/N0 ) 250  60 s, 10 cm -1.5 200 -2 5 cm 150 -2.5 100 -3 50 0 20 40 60 80 100 120 0 Exposure time (s) 0 2 4 6 8 Storage time (day) Almacenamiento:después de 10s Incremento de inocuidad y vida útil ó 60s de radiación: (Gómez et al., 2011) aún a la menor dosis (10s- 10 cm) No existió crecimiento de E. coli Reducción de L. innocua
  • 29. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Ejemplo: Jugo de naranja Adicionado con antimicrobianos naturales, irradiado con luz UV-C 30 min y almacenado en refrigeración UV-C UV-C/100 ppm citral/1000 ppm vanillina UV-C/50 ppm citral/1500 ppm vanillina S. cerevisiae E. coli L. innocua A C D 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 0 P 0 0 -1 R -1 O -1 -2 C -2 -3 E -2 N N -3 g o L g o L N / g o L / S / -4 -4 O -3 -5 -5 -4 -6 Time (min) -6 Time (min) Time (min) A L A M -1 1 3 5 7 9 11 13 15 -1 1 3 5 7 9 11 13 C -1 1 3 5 7 9 11 D A 0 0 -0,5 C -0,5 -0,5 -1,5 E -1 -1 -1,5 N -1,5 -2 -2,5 A -2 -2,5 -3,5 N N M N g o L -2,5 -4,5 g o L g o L -3 / / / I -3 -3,5 -5,5 -4 E -3,5 -4,5 -6,5 N -4 -5 -7,5 Time (day) Time (day) Time (day) T O Los antimicrobianos no mejoraron la inactivación por irradiación con luz UV-C pero en determinadas concentraciones se minimizó el desarrollo de las levaduras que resistieron el tratamiento con luz UV-C o que se recuperaron después del mismo UV-C como único factor contribuiría a la inocuidad sin modificar la vida útil pero ésta se incrementaría por el agregado de 100 ppm de citral y 1000 ppm de vainillina. Ferrario et al., 2011
  • 30. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Conclusiones Cinética de inactivación Específica para un dado microorganismo, dominio ambiental y factor de inactivación (en combinación o no con otros factores de estrés).  Evaluación en microorganismos adheridos en biofilms.  Cuantificación de la cinética de inactivación microbiana por modelos de distribución de resistencias de acuerdo al enfoque vitalístico Estudios simultáneos de la respuesta microbiana de la flora nativa y de los microorganismos inoculados, tanto en el tratamiento per se como durante el almacenamiento
  • 31. V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES Muchas gracias! Grupo de investigación Dra Sandra Guerrero Dra Cielo Char Dra Silvia Raffellini Dra Marcela Schenk Lic. Mariana Ferrario smalzamora@gmail.com
  • 32.
  • 33. Factors affecting inactivation and explaining the great variance values of the mean inactivation time The presence of colored compounds and pulp particles which caused poor UV-C light transmission (UV-C light absorption by dissolved solids; UV-C scattering and reflection, and a site for the aggregation of bacteria to particles surfaces by solids in suspension). The complex flow pattern in the system and the great distribution of residence times. The difference in the response per se between the members of E. coli population (different sensibility to the treatment).
  • 34. Gráficos de densidad de fluorescencia de Agua peptonada pH 5,6 células de S. cerevisiae teñidas con cFDA y PI y sometidas a diferentes tiempos de Jugo de manzana comercial exposición a pulsos de luz (0-71,6 J/cm2) Agua peptonada pH 3,5 0s 1s 5s 10 s 20 s 60 s Agua peptonada pH 3,5 Agua peptonada pH 5,6 Jugo de manzana comercial

Notas del editor

  1. Problemática asociada a los factores de inactivación no térmicos: A las dosis que pueden usarse en alimentos para no deteriorar calidad ….. Factores de estrés adicionales aplicados a niveles subletales que actúen simultáneamente durante la aplicación del factor “no térmico” incrementando la inactivación, o que actúen en forma sucesiva a la aplicación de éste inhibiendo el crecimiento de los microorganismos resistentes
  2. El jugo tuvo un efecto protector en E coli y un efecto ligeramente sensibilizante en E coli.