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FACULTAD DE INGENIERÍA
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ACCIÓN BACTERICIDA DE LA
opasdfghjklzxcvbnmqwertyuio
LUZ ULTRAVIOLETA,
FOTORREACTIVACIÓN
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CURSO:
Laboratorio de Microbiología
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DOCENTE: Mblgo. Carlos Azañero Díaz
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GRUPO:
¨D¨
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ALUMNA: Aburto Rodríguez Ruddy
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Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

I.

INTRODUCCIÓN
Los efectos de la radiación con luz UV sobre los microorganismos pueden variar de
especie a especie y, entre cepas de la misma especie, del medio de cultivo, estado
del cultivo, densidad de microorganismos y otras características como el tipo y
composición del alimento. Los hongos y levaduras son más resistentes durante la
desinfección; sin embargo, los niveles altos de microorganismos deben tomarse en
cuenta cuando se usa UV-C para desinfectar.
La radiación absorbida por DNA puede detener el crecimiento celular y producir la
muerte celular. La luz UV-C que absorbe el DNA causa un cambio físico de
electrones que provoca la ruptura de los enlaces del DNA, retrasar la reproducción
o muerte celular. Esto significa que el efecto bactericida de la UV-C es básicamente
a nivel del ácido nucleico. Un enlace cruzado entre tiamina y citosina (Nucleótido
de bases Pirimídicas) en la misma cadena de DNA ocurre por la radiación de UV-C.
Los fotoproductos más comunes de DNA son dímeros ciclobutil pirimidina. El
efecto obtenido es que la transcripción y réplica del DNA se bloquean,
comprometiendo a las funciones celulares y eventualmente produciendo la muerte
celular. Los efectos en los enlaces cruzados del DNA son proporcionales a la
cantidad de exposición de luz UV-C.

II.

OBJETIVO
Estudiar el poder letal de la luz ultravioleta midiendo la supervivencia de una
cepa bacteriana sensible.
Estudiar el fenómeno d la Fotorreactivación.

Microbiología General

1
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

III. MATERIALES
Material biológico
Cultivos puros bacterianos:Cultivos de Escherichia coli.
Material de Laboratorio
4 placas de petri estériles.
8 placas de agar nutritivo (AN).
32 tubos de 20ml de capacidad con 9ml de SSF estéril.
Un matraz de 250ml con 45ml de MgSO4 0,1M estéril.
Un matraz de 250ml con 10ml de caldo nutritivo (CN) estéril
Baño térmico con agitación
Hielo
Lámpara de luz UV (longitud de onda 240-265nm).
4 focos de luz visible de 100w.

IV. Fundamento teórico:
RADIACIONES UV
Mecanismo de acción: el principal mecanismo del efecto letal de la luz UV
sobre las bacterias, se atribuye a su absorción por el ADN y el resultante
daño de este. Así provocan la formación de uniones covalentes entre los
residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo
que provoca la formación

de dímeros de

pirimidina

de tipo

ciclobutano.Esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en
el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibición de la

Microbiología General

2
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

síntesis de ADN y secundario a esto, inhibición del crecimiento y la
respiración.
Aplicaciones: estas radiaciones pueden producirse artificialmente con
lámparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para Gram (+) y
Gram (-). Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no
penetran en sólidos y lo hacen pobremente en líquidos

FOTORREACTIVACIÓN
Empieza por una
enzima llamda
fotorreactivante

Reconoce los
dímeros
formados por la
luz UV

Utiliza la luz
visible

Y finalmente una
ADNligasa sella
la molécula de
ADN

Actúa un
ADNpolimeras
colocandolas
nuevas bases

Rompe los
enlaces que unía
a las dos
pirimidinas

V.

procedimiento:
1. Efecto de la temperatura y tiempo de exposición sobre el crecimiento de
microorganismos.
Encender una lámpara de luz UV durante 30 minutos. Antes del ensayo
con el fin de que se estabilice la intensidad de la emisión.
Preparar un cultivo en fase de crecimiento exponencial E. coli. Para ello
añadir 0.1ml de un cultivo incubado durante toda la noche a un matraz
con 10ml de caldo nutritivo estéril. Incubarlo a 370 C con agitación

Microbiología General

3
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

constante (200rpm) durante 2-3 horas. De esta forma se obtendrá una
concentración celular de aproximadamente 108 UFC/ml.
Añadir al cultivo 45ml de MgSO4 0.1M.
Mantener la suspensión en hielo durante 5-10 minutos.

Dispensar 5ml de la suspensión en cada placa de Petri vacía estéril.
Rotar las placas en contra y a favor del sentido de las agujas del reloj.
Se ha de conseguir una distribución homogénea de la suspensión para
evitar el efecto de apantallamiento que las propias células pueden
crear entre sí.Radiar las muestras con luz UV durante distintos tiempos:
0, 20, 60, 120 seg.

NOTA: La lámpara UV se coloca a una altura de 50cm sobre una
superficie horizontal. La luz debe incidir verticalmente sobre las
muestras. La exposición se realizará en una habitación oscura para
evitar posible Fotorreactivación.
Realizar diluciones decimales seriadas de las muestras en SSF estéril.
Sembrar 0.1ml de las diluciones que se indican en la tabla sobre placas
de agra nutritivo.

Microbiología General

4
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

Incubar a 370 C toda la noche.
Para la fotorreactivación hay que iluminar las placas irradiadas con
cuatro focos de luz visible de 100W durante 40 min a una distancia de
10cm.

Realizar diluciones decimales seriadas de las muestras en SSF estéril.
Sembrar 0.1ml de las diluciones que se indican en la tabla sobre placas
de agar nutritivo.
Incubar a 37ºC toda la noche.

Diluciones Aconsejables para el Recuento de Supervivientes

Tiempo(seg) de
exposición a la luz UV

Diluciones antes de la
fotorreactivación

Diluciones después de la
fotorreactivación

0

10-6

10-6

20

10-6

10-6

60

10-5

10-5

120

10-1

10-1

Microbiología General

5
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

VI. RESULTADOS:
1. Fotorreactivación:se trabajó con cultivo bacterianoEscherichia coli.
Muestraa 0 segundos:

Cantidad de colonias: 134
Descripción: el crecimiento microbiano es
mayor si nos expone a calor.

Muestra a 20 segundos:

Cantidad de colonias: 42
Descripción: crecimiento del E. coli en menor
cantidad.

Muestra a 60 segundos:
Cantidad de colonias: 43
Descripción: mayor crecimiento que a 20
segundos.

Muestra a 120 segundos:
Cantidad de colonias: 165
Descripción: el crecimiento no se inhibe a
pesar que fue expuesto mayor tiempo que las
demás muestras, indicando que el E. coli tiene
un crecimiento favorable.

Microbiología General

6
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

2. Ultravioleta:se trabajó con cultivo bacterianoEscherichia coli.
Muestra a 0 segundos:

Cantidad de colonias: 84
Descripción: colonias dispersas por todo la placa.

Muestra a 20 segundos:
Cantidad de colonias: 123
Descripción: colonias dispersas por la placa
indicando que la radiación en UV no inhibe el
crecimiento microbiano.

Muestra a 60 segundos:
Cantidad de colonias: 151
Descripción: el crecimiento no E. coli no se
inhibe a 60 segundos e incluso crece mejor q el
que no está irradiado.

Muestra a 120 segundos:
Cantidad de colonias: 72
Descripción: el crecimiento es casi de la misma
proporción que cuando no se irradia.

Microbiología General

7
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

VII. DISCUSIÓN:
En

condiciones

apropiadas,

la

radiación

electromagnética

controla

eficazmente el crecimiento microbiano. La radiación ultravioleta es útil para
descontaminar superficies y materiales que no absorban luz, como el aire y el
agua. Las microondas, la radiación ultravioleta (UV), los rayos X son tipos de
radiación electromagnética. Sin embargo

cada radiación actúa con un

mecanismo específico. La radiación UV, considerada entre 220 y 30nm de
longitud de onda, actúa como un mecanismo diferente. Las ondas UV tienen
suficiente energía para causar roturas en el ADN, produciendo la muerte del
organismo expuesto. Las cabinas de los laboratorios vienen equipadas con una
lámpara microbicida de la luz UV para la descontaminación de una superficie
después de su uso. La radiación UV no penetra las superficies sólidas, opacas,
absorbentes de luz, y su utilidad se limita a la desinfección de las superficies
expuestas. Brook, Bioquímica de los Microorganismos Pág. 692

Para todos los microorganismos existe una temperatura máxima de
crecimiento por encima de la cual mueren. La aplicación de calor es el
método de esterilización más utilizado. Latemperatura para la esterilización
por calor se selecciona con el fin de eliminar la mayoría de los

Microbiología General

8
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

microorganismos resistentes al calor en el material, habitualmente
endosporas bacterianas.Brook, Bioquímica de los Microorganismos Pág. 689
La luz ultravioleta no posee un gran poder de penetración lo que limita su uso
como desinfectante o germicida.Los efectos de la radiación UV son mutaciones
y alteraciones letales en los ácidos nucleídos. Los productos más importantes
de la acción de la luz UV son dímeros:
Timina – Timina
Timina – Citosina
Citosina – Citosina

Que se formas entre dímeros. Los dímeros producidos durante la radiación
impiden la replicación y la transcripción. Estas alteraciones del DNA resultan
letales a menos de que sean reparadas por:
Fotorreactivación
Reparación por Escisión
Mecanismo SOS

En las células, la radiación afecta en primer lugar a los ácidos nucleicos y las
proteínas, sin que se produzca un calentamiento apreciable. Algunas de las
alteraciones que una radiación ionizante puede producir en un ácido nucleico
son reparables por el microorganismo, por ejemplo la hidratación de la
citosina. Otras alteraciones son más perjudiciales, como la formación de
puentes entre ambas cadenas del ADN impidiendo la duplicación del mismo y
por tanto de la bacteria.Las bacterias Gram-negativas son generalmente más
sensibles a la irradiación que las Gram-positivas y las esporas aún más
resistentes.
Existen varios métodos para la conservación de cepas interesantes de
microorganismos. Entre los más frecuentes figuran la congelaciónde muestras
de cultivos creciendo exponencialmente a los que se ha añadido un agente

Microbiología General

9
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

estabilizante (glicerol al 30%) y se mantienen a -80ºC; la liofilizacióny la
conservación en medios sólidos herméticos. La liofilización y la congelación son
los métodos de conservación más efectivos a largo plazo; pero ambos causan
una gran mortandad entre las bacterias (es decir, probablemente en torno al
80-90% de las CFU que se congelan o liofilizan mueren en el proceso). Estos
métodos son muy aplicados para conservar bacterias; sin embargo, presentan
más problemas en el caso de eucariontes ya que muchos de ellos no se
recuperan después del tratamiento.
Es de común conocimiento que las bacterias y otros microorganismos pueden
reparar su ADN tras haber sido dañados por la radiación ultravioleta (UV).
Conocida como “reactivación”, algunos microorganismos necesitan luz visible
para emprender la reparación (“fotorreactivación”), mientras que otros
pueden reparar su ADN sinluz (“reparación a oscuras”).
Muchas bacterias poseen un eficiente mecanismo de fotorreactivación para
reparar el daño causado por la radiación UV cuando se exponen
inmediatamente después a la luz visible.
Las bacterias contienen complejos sistemas de enzimático de reparación del
ADN dañado por la luz UV, llamados sistemas reguladores SOS, que se activan
como consecuencia de los mismos daños en el ADN. Uno de estos es la
fotorreactivación.
Las cepas más comunes del E. coli contienen alrededor de 20 enzimas de
fotoliasa, capaces de reparar hasta cinco dímeros de timina por minuto cada
una—esto significa que, en una sola célula, pueden reparase hasta 100
dímeros por minuto. 1mJ/cm2 de UV produce, aproximadamente, 3,000-4,000
dímeros (Oguma, 2002), por lo tanto, en teoría, el daño provocado por
1mJ/cm2 de UV puede repararseen sólo 30 minutos.

Microbiología General

10
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

VIII. CONCLUSIÓN:
La luz ultravioleta tiene un destacado papel sobre ladesaparición bacteriana,
ya que tiene efecto bactericida en la Escherichia coli.El crecimiento depende
del tiempo de irradiación porque en algunos casos la irradiación UV no inhibe
el crecimiento, esto se observa en las muestras que estuvieron20 y 60
segundos; puede que tenga que ver que la bacteria E. coli es mesófila.
El mecanismo de fotorreactivación de la Escherichia coli es unsistema de
reparación directa de los daños producidos por la luz UV. La luz UV produce
dímeros de pirimidinas, fundamentalmente dímeros de Timinas. El enzima
Fotoliasa codificada por el gen PHR reconoce en la oscuridad los dímeros de
Timina y se une a ellos, y cuando se expone a la luz (mediante un fotón)
deshace el dímero de Timinas.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
MIDIGAN/ PARKERA/ MARTINKO, Broock – Biología de los Microorganismos,
Editorial Mc Graw Hill,10ma Edición, Impreso en España 1998. Capítulo 20,
pág.: 689-691,692.
Carlos Gamazo, Ignacio López-Goñi, Ramón Díaz/”Manual Práctico de
Microbiología”/ 3a Edición- Masson S.A. Barcelona España
http://depa.pquim.unam.mx/genetica/Practica8.htm
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/23_micro.htm

Microbiología General

11
Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación

X.

CUESTIONARIO:
1. ¿Se puede utilizar la luz UV para mutagenizar cultivos bacterianos?
Las mutaciones ¿Son siempre letales?
Si, ya que la radiación ultravioleta origina dímeros de pirimidina
(generalmente de timina), y la radiación gamma y la alfa que son
ionizantes.
No, ya que las mutaciones pueden provocar cambios morfológicos y
fisiológicos muy grandes y en ocasiones solo puede ser detectada por
medio de técnicas moleculares. De acuerdo a los efectos que causan las
mutaciones se han clasificado en:
Morfológicas.-afectan las propiedades visibles exteriormente del
organismo, como el color, la talla, la forma.
Letales.- afectan la viabilidad de los organismos y pueden ser
dominantes, recesivas o semiletales.
Condicionales.- solo se expresan en condiciones restrictivas.
Bioquímicas.- producen deficiencias metabólicas que pueden
corregirse cambiando las condiciones del medio.
De resistencia.- confieren la capacidad de desarrollarse en presencia
de agentes patógenos o de compuestos inhibidores como los
antibióticos.

Microbiología General

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acción bactericida de la luz ultravioleta fotorreactivación

  • 1. qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq wertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA ertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwe E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL rtyuiopasdfghjklzxcvbnmqwert yuiopasdfghjklzxcvbnmqwerty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyui ACCIÓN BACTERICIDA DE LA opasdfghjklzxcvbnmqwertyuio LUZ ULTRAVIOLETA, FOTORREACTIVACIÓN pasdfghjklzxcvbnmqwertyuiop asdfghjklzxcvbnmqwertyuiopa CURSO: Laboratorio de Microbiología sdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasg DOCENTE: Mblgo. Carlos Azañero Díaz dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasd GRUPO: ¨D¨ fghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg ALUMNA: Aburto Rodríguez Ruddy hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghj klzxcvbnmqwertyuiopasdlfghjk lzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklz
  • 2. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación I. INTRODUCCIÓN Los efectos de la radiación con luz UV sobre los microorganismos pueden variar de especie a especie y, entre cepas de la misma especie, del medio de cultivo, estado del cultivo, densidad de microorganismos y otras características como el tipo y composición del alimento. Los hongos y levaduras son más resistentes durante la desinfección; sin embargo, los niveles altos de microorganismos deben tomarse en cuenta cuando se usa UV-C para desinfectar. La radiación absorbida por DNA puede detener el crecimiento celular y producir la muerte celular. La luz UV-C que absorbe el DNA causa un cambio físico de electrones que provoca la ruptura de los enlaces del DNA, retrasar la reproducción o muerte celular. Esto significa que el efecto bactericida de la UV-C es básicamente a nivel del ácido nucleico. Un enlace cruzado entre tiamina y citosina (Nucleótido de bases Pirimídicas) en la misma cadena de DNA ocurre por la radiación de UV-C. Los fotoproductos más comunes de DNA son dímeros ciclobutil pirimidina. El efecto obtenido es que la transcripción y réplica del DNA se bloquean, comprometiendo a las funciones celulares y eventualmente produciendo la muerte celular. Los efectos en los enlaces cruzados del DNA son proporcionales a la cantidad de exposición de luz UV-C. II. OBJETIVO Estudiar el poder letal de la luz ultravioleta midiendo la supervivencia de una cepa bacteriana sensible. Estudiar el fenómeno d la Fotorreactivación. Microbiología General 1
  • 3. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación III. MATERIALES Material biológico Cultivos puros bacterianos:Cultivos de Escherichia coli. Material de Laboratorio 4 placas de petri estériles. 8 placas de agar nutritivo (AN). 32 tubos de 20ml de capacidad con 9ml de SSF estéril. Un matraz de 250ml con 45ml de MgSO4 0,1M estéril. Un matraz de 250ml con 10ml de caldo nutritivo (CN) estéril Baño térmico con agitación Hielo Lámpara de luz UV (longitud de onda 240-265nm). 4 focos de luz visible de 100w. IV. Fundamento teórico: RADIACIONES UV Mecanismo de acción: el principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorción por el ADN y el resultante daño de este. Así provocan la formación de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formación de dímeros de pirimidina de tipo ciclobutano.Esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibición de la Microbiología General 2
  • 4. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación síntesis de ADN y secundario a esto, inhibición del crecimiento y la respiración. Aplicaciones: estas radiaciones pueden producirse artificialmente con lámparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para Gram (+) y Gram (-). Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no penetran en sólidos y lo hacen pobremente en líquidos FOTORREACTIVACIÓN Empieza por una enzima llamda fotorreactivante Reconoce los dímeros formados por la luz UV Utiliza la luz visible Y finalmente una ADNligasa sella la molécula de ADN Actúa un ADNpolimeras colocandolas nuevas bases Rompe los enlaces que unía a las dos pirimidinas V. procedimiento: 1. Efecto de la temperatura y tiempo de exposición sobre el crecimiento de microorganismos. Encender una lámpara de luz UV durante 30 minutos. Antes del ensayo con el fin de que se estabilice la intensidad de la emisión. Preparar un cultivo en fase de crecimiento exponencial E. coli. Para ello añadir 0.1ml de un cultivo incubado durante toda la noche a un matraz con 10ml de caldo nutritivo estéril. Incubarlo a 370 C con agitación Microbiología General 3
  • 5. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación constante (200rpm) durante 2-3 horas. De esta forma se obtendrá una concentración celular de aproximadamente 108 UFC/ml. Añadir al cultivo 45ml de MgSO4 0.1M. Mantener la suspensión en hielo durante 5-10 minutos. Dispensar 5ml de la suspensión en cada placa de Petri vacía estéril. Rotar las placas en contra y a favor del sentido de las agujas del reloj. Se ha de conseguir una distribución homogénea de la suspensión para evitar el efecto de apantallamiento que las propias células pueden crear entre sí.Radiar las muestras con luz UV durante distintos tiempos: 0, 20, 60, 120 seg. NOTA: La lámpara UV se coloca a una altura de 50cm sobre una superficie horizontal. La luz debe incidir verticalmente sobre las muestras. La exposición se realizará en una habitación oscura para evitar posible Fotorreactivación. Realizar diluciones decimales seriadas de las muestras en SSF estéril. Sembrar 0.1ml de las diluciones que se indican en la tabla sobre placas de agra nutritivo. Microbiología General 4
  • 6. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación Incubar a 370 C toda la noche. Para la fotorreactivación hay que iluminar las placas irradiadas con cuatro focos de luz visible de 100W durante 40 min a una distancia de 10cm. Realizar diluciones decimales seriadas de las muestras en SSF estéril. Sembrar 0.1ml de las diluciones que se indican en la tabla sobre placas de agar nutritivo. Incubar a 37ºC toda la noche. Diluciones Aconsejables para el Recuento de Supervivientes Tiempo(seg) de exposición a la luz UV Diluciones antes de la fotorreactivación Diluciones después de la fotorreactivación 0 10-6 10-6 20 10-6 10-6 60 10-5 10-5 120 10-1 10-1 Microbiología General 5
  • 7. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación VI. RESULTADOS: 1. Fotorreactivación:se trabajó con cultivo bacterianoEscherichia coli. Muestraa 0 segundos: Cantidad de colonias: 134 Descripción: el crecimiento microbiano es mayor si nos expone a calor. Muestra a 20 segundos: Cantidad de colonias: 42 Descripción: crecimiento del E. coli en menor cantidad. Muestra a 60 segundos: Cantidad de colonias: 43 Descripción: mayor crecimiento que a 20 segundos. Muestra a 120 segundos: Cantidad de colonias: 165 Descripción: el crecimiento no se inhibe a pesar que fue expuesto mayor tiempo que las demás muestras, indicando que el E. coli tiene un crecimiento favorable. Microbiología General 6
  • 8. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación 2. Ultravioleta:se trabajó con cultivo bacterianoEscherichia coli. Muestra a 0 segundos: Cantidad de colonias: 84 Descripción: colonias dispersas por todo la placa. Muestra a 20 segundos: Cantidad de colonias: 123 Descripción: colonias dispersas por la placa indicando que la radiación en UV no inhibe el crecimiento microbiano. Muestra a 60 segundos: Cantidad de colonias: 151 Descripción: el crecimiento no E. coli no se inhibe a 60 segundos e incluso crece mejor q el que no está irradiado. Muestra a 120 segundos: Cantidad de colonias: 72 Descripción: el crecimiento es casi de la misma proporción que cuando no se irradia. Microbiología General 7
  • 9. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación VII. DISCUSIÓN: En condiciones apropiadas, la radiación electromagnética controla eficazmente el crecimiento microbiano. La radiación ultravioleta es útil para descontaminar superficies y materiales que no absorban luz, como el aire y el agua. Las microondas, la radiación ultravioleta (UV), los rayos X son tipos de radiación electromagnética. Sin embargo cada radiación actúa con un mecanismo específico. La radiación UV, considerada entre 220 y 30nm de longitud de onda, actúa como un mecanismo diferente. Las ondas UV tienen suficiente energía para causar roturas en el ADN, produciendo la muerte del organismo expuesto. Las cabinas de los laboratorios vienen equipadas con una lámpara microbicida de la luz UV para la descontaminación de una superficie después de su uso. La radiación UV no penetra las superficies sólidas, opacas, absorbentes de luz, y su utilidad se limita a la desinfección de las superficies expuestas. Brook, Bioquímica de los Microorganismos Pág. 692 Para todos los microorganismos existe una temperatura máxima de crecimiento por encima de la cual mueren. La aplicación de calor es el método de esterilización más utilizado. Latemperatura para la esterilización por calor se selecciona con el fin de eliminar la mayoría de los Microbiología General 8
  • 10. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación microorganismos resistentes al calor en el material, habitualmente endosporas bacterianas.Brook, Bioquímica de los Microorganismos Pág. 689 La luz ultravioleta no posee un gran poder de penetración lo que limita su uso como desinfectante o germicida.Los efectos de la radiación UV son mutaciones y alteraciones letales en los ácidos nucleídos. Los productos más importantes de la acción de la luz UV son dímeros: Timina – Timina Timina – Citosina Citosina – Citosina Que se formas entre dímeros. Los dímeros producidos durante la radiación impiden la replicación y la transcripción. Estas alteraciones del DNA resultan letales a menos de que sean reparadas por: Fotorreactivación Reparación por Escisión Mecanismo SOS En las células, la radiación afecta en primer lugar a los ácidos nucleicos y las proteínas, sin que se produzca un calentamiento apreciable. Algunas de las alteraciones que una radiación ionizante puede producir en un ácido nucleico son reparables por el microorganismo, por ejemplo la hidratación de la citosina. Otras alteraciones son más perjudiciales, como la formación de puentes entre ambas cadenas del ADN impidiendo la duplicación del mismo y por tanto de la bacteria.Las bacterias Gram-negativas son generalmente más sensibles a la irradiación que las Gram-positivas y las esporas aún más resistentes. Existen varios métodos para la conservación de cepas interesantes de microorganismos. Entre los más frecuentes figuran la congelaciónde muestras de cultivos creciendo exponencialmente a los que se ha añadido un agente Microbiología General 9
  • 11. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación estabilizante (glicerol al 30%) y se mantienen a -80ºC; la liofilizacióny la conservación en medios sólidos herméticos. La liofilización y la congelación son los métodos de conservación más efectivos a largo plazo; pero ambos causan una gran mortandad entre las bacterias (es decir, probablemente en torno al 80-90% de las CFU que se congelan o liofilizan mueren en el proceso). Estos métodos son muy aplicados para conservar bacterias; sin embargo, presentan más problemas en el caso de eucariontes ya que muchos de ellos no se recuperan después del tratamiento. Es de común conocimiento que las bacterias y otros microorganismos pueden reparar su ADN tras haber sido dañados por la radiación ultravioleta (UV). Conocida como “reactivación”, algunos microorganismos necesitan luz visible para emprender la reparación (“fotorreactivación”), mientras que otros pueden reparar su ADN sinluz (“reparación a oscuras”). Muchas bacterias poseen un eficiente mecanismo de fotorreactivación para reparar el daño causado por la radiación UV cuando se exponen inmediatamente después a la luz visible. Las bacterias contienen complejos sistemas de enzimático de reparación del ADN dañado por la luz UV, llamados sistemas reguladores SOS, que se activan como consecuencia de los mismos daños en el ADN. Uno de estos es la fotorreactivación. Las cepas más comunes del E. coli contienen alrededor de 20 enzimas de fotoliasa, capaces de reparar hasta cinco dímeros de timina por minuto cada una—esto significa que, en una sola célula, pueden reparase hasta 100 dímeros por minuto. 1mJ/cm2 de UV produce, aproximadamente, 3,000-4,000 dímeros (Oguma, 2002), por lo tanto, en teoría, el daño provocado por 1mJ/cm2 de UV puede repararseen sólo 30 minutos. Microbiología General 10
  • 12. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación VIII. CONCLUSIÓN: La luz ultravioleta tiene un destacado papel sobre ladesaparición bacteriana, ya que tiene efecto bactericida en la Escherichia coli.El crecimiento depende del tiempo de irradiación porque en algunos casos la irradiación UV no inhibe el crecimiento, esto se observa en las muestras que estuvieron20 y 60 segundos; puede que tenga que ver que la bacteria E. coli es mesófila. El mecanismo de fotorreactivación de la Escherichia coli es unsistema de reparación directa de los daños producidos por la luz UV. La luz UV produce dímeros de pirimidinas, fundamentalmente dímeros de Timinas. El enzima Fotoliasa codificada por el gen PHR reconoce en la oscuridad los dímeros de Timina y se une a ellos, y cuando se expone a la luz (mediante un fotón) deshace el dímero de Timinas. IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: MIDIGAN/ PARKERA/ MARTINKO, Broock – Biología de los Microorganismos, Editorial Mc Graw Hill,10ma Edición, Impreso en España 1998. Capítulo 20, pág.: 689-691,692. Carlos Gamazo, Ignacio López-Goñi, Ramón Díaz/”Manual Práctico de Microbiología”/ 3a Edición- Masson S.A. Barcelona España http://depa.pquim.unam.mx/genetica/Practica8.htm http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/23_micro.htm Microbiología General 11
  • 13. Acción Bactericida de la Luz Ultravioleta, Fotorreactivación X. CUESTIONARIO: 1. ¿Se puede utilizar la luz UV para mutagenizar cultivos bacterianos? Las mutaciones ¿Son siempre letales? Si, ya que la radiación ultravioleta origina dímeros de pirimidina (generalmente de timina), y la radiación gamma y la alfa que son ionizantes. No, ya que las mutaciones pueden provocar cambios morfológicos y fisiológicos muy grandes y en ocasiones solo puede ser detectada por medio de técnicas moleculares. De acuerdo a los efectos que causan las mutaciones se han clasificado en: Morfológicas.-afectan las propiedades visibles exteriormente del organismo, como el color, la talla, la forma. Letales.- afectan la viabilidad de los organismos y pueden ser dominantes, recesivas o semiletales. Condicionales.- solo se expresan en condiciones restrictivas. Bioquímicas.- producen deficiencias metabólicas que pueden corregirse cambiando las condiciones del medio. De resistencia.- confieren la capacidad de desarrollarse en presencia de agentes patógenos o de compuestos inhibidores como los antibióticos. Microbiología General 12