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INGENIERIA BIOQUIMICA
REPORTE DE PRÁCTICA
ANALISIS DE ALIMENTOS
SANIDAD ALIMENTARIA
CATEDRÁTICO
QBP. AURA FLORES
INTEGRANTES DE EQUIPO
Alvarez Gonzalez Obed
Cruz Cruz Jose Manuel
Cruz Enriques Maria Gpe.
Espinoza Maza Fatima Del C.
Nangusé Orantes Alejandra
Reyes Ovando Chrystel Gpe.
TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS
22 DE OCTUBRE DE 2012
OBJETIVO
Analizar las muestras alimenticias hechas en el restaurant “El Taconazo” e
identificar los microorganismos presentes bajo el régimen de las Normas
alimenticias (NOM).
MARCO TEÓRICO
.
 COLIFORMES FECALES.
Las bacterias coliformes fecales forman parte del
total del grupo coliforme. Son definidas como
bacilos Gram-negativos, no esporulados que
fermentan la lactosa con producción de ácido y gas
a 44.5 °C +/- 0.2 °C dentro de las 24 +/- 2 horas. La
mayor especie en el grupo de coliforme fecal es el
Escherichia coli.
Escherichia coli, forma parte importante de la microbiota intestinal del hombre y de
los animales de sangre caliente, sin embargo, algunas cepas han desarrollado
capacidad para provocar enfermedad en el hombre, como son las infecciones
gastrointestinales. Estas cepas patógenas representan la principal causa de
diarrea infantil en el mundo. La capacidad de E. coli patógena para producir
enfermedad está determinada por factores de virulencia que le permitan sobrevivir
en condiciones ambientales adversas. Actualmente se reconocen 6 grupos de E.
coli patógenas que dan lugar a diversos padecimientos, entre estos existen
diferencias clínicas y epidemiológicas, así como en la estructura antigénica y
mecanismos de patogenicidad de los diferentes grupos. Cepas patógenas de E.
Coli:
 Enteropatógena (ECEP).
 Enterotoxigénica (ECET).
 Enteroinvasiva (ECEI).
 Enterohemorrágica (ECEH).
 Enteroadherente (ECEA).
 Enteroagregativa (ECEG).
La presencia de coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el
suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de
desechos en descomposición. Generalmente, las bacterias coliformes se
encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los
sedimentos del fondo.
Los niveles recomendados de bacterias coliformes fecales son:
Agua potable: menos de 0 colonias por 100 ml de la muestra de agua.
Natación: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua
Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra de agua.
La E. coli se usa en el análisis de quesos frescos, quesillos, cereales, masas con
rellenos, pescado congelado, frutas y verduras frescas. Los límites varían entre 0
a 1.000 UFC/gr.
 COLIFORMES TOTALES:
Los coliformes son bacterias que tienen forma de bastoncillos, que no forman
esporas, y son Gram negativos aerobias y anaerobias facultativas, su
característica principal es que fermenta la lactosa con formación de gases al cabo
de 48 horas a una temperatura de 35° a 37°C, donde los Coliformes fecales se
diferencian de estar por ser termo tolerantes a temperaturas de 44°-46°C.
El grupo de microorganismos Coliformes es adecuado como indicador de
contaminacion bacteriana, ya que es el grupo de mas rápida y fácil deteccion. Los
microorganismos indicadores son aquellos que tienen un comportamiento similar a
los patógenos pero son más rápidos, económicos y fáciles de identificar. Una vez
se ha evidenciado la presencia de grupos indicadores, se puede inferir que los
patógenos se encuentran presentes en la misma concentracion y que su
comportamiento frente a diferentes factores como pH, temperatura, presencia de
nutrientes o sistemas de desinfeccion es similar a la del indicador. Los coliformes
para ser utilizados como indicadores deben poseer las siguientes propiedades:
1.- Especificidad: solo se deben encontrar en el medio intestinal
2.- Se hallaran en grandes cantidades de tal manera qued puedan ser detectadas
en altas dilusiones.
3.- Ser muy resistentes a las condiciones ambientales, extra intestinales.
El grupo coliformes, por ende agrupa a todas las especies bacterianas que son
bioquímicamente similares a E. coli, tales como Enterobacter, Klebsiella y
Citrobacter.
No todas estas bacterias se encuentran en el intestino por lo que se desarrolló el
concepto de coliformes fecales, a diferencia de coliformes totales.
Los coliformes totales se usan para evaluar leche pasteurizada y en polvo,
helados, pastas frescas, fideos, cereales y formulas para lactantes. El lÍmite varía
entre 10 a 100 UFC/gm.
 Salmonella.
Es una bacteria patógena para el hombre y
muchos animales, produce una enfermedad
de origen alimentario conocida como
salmonelosis, que se presenta en formas
esporádica y de brotes. Es la causa más
común de ETA en diversos países. Es uno
de los géneros más estudiados entre los
patógenos que pueden ser aislados de los
alimentos. Cuba es el primer agente causal
de brotes de origen alimentario. El primer
brote de salmonelosis se describió en Alemania en 1888, entre 50 personas que
habían ingerido carne cruda molida proveniente de una vaca moribunda.
Los integrantes de este género son bacilos gramnegativos no esporulados oxidasa
negativa, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. La mayoría no
fermentan la lactosa y son móviles, son aerobios o anaerobios facultativos,
contienen endotoxinas, generalmente son termolábiles, resisten la congelación y
algunos agentes químicos, poseen una rica composición antigénetica que se
emplea como base para la identificación de sus miembros en serotipos,
recientemente designados como serovares.
Es un agente zoonótico de distribución universal. Puede transmitirse por contacto
directo a través de fómites, pero la vía más frecuente contaminación cruzada
durante la manipulación, en el procesador de alimentos, o por aguas
contaminadas con aguas residuales.
Crece con facilidad en la sangre formando colonias de 2 a 3 milímetros. En
laboratorios de microbiología clínica puede aislarse en heces con medios
selectivos para inhibir el crecimiento de otras bacterias patógenas y de la flora
intestinal.
Clásicamente se distinguían tres únicas especies patógenas primarias: S.
typhy, S. cholerae-suis y S. enteritidis. A su vez, según la serotipificación de
Kauffman y White, eran clasificadas en más de 2000 serotipos con base en los
antígenos flagelares H (proteicos) y antígenos somáticos O (fracción polisacárida
del lipopolisacárido bacilar). S. typhi posee además un antígeno de virulencia.
El género Salmonella es de taxonomía difícil, modificada en estos últimos años por
el aporte de estudios moleculares de homología de ADN que han clarificado el
panorama taxonómico de las enterobacterias.
Para la bacteriología clínica, Salmonella es un bacilo patógeno primario
(como Shigella, Yersinia y ciertas cepas de E. Coli), anaerobio facultativo, algunos
móviles y no fermentan la lactosa. S. typhi es la única serovariedad que no
produce gas en la fermentación de los azúcares.
La salmonelosis, es una enfermedad infectocontagiosa producida por
enterobacterias del género Salmonella. Comprende un conjunto de cuadros
clínicos cuya principal manifestación es la gastroenteritis aguda, una de las
intoxicaciones alimentarias más comunes causadas por agua y alimentos
contaminados, especialmente carnes.
Se clasifica como enfermedad de origen alimentario, pues los alimentos
contaminados constituyen el modo predominante de transmisión. Se puede
transmitir durante toda la evolución de la infección, usualmente de unos días a
varias semanas. A veces el estado de portador temporal continúa durante meses,
especialmente en los lactantes. Cerca del 1% de los adultos infectados y del 5%
de los niños menores de 5 años excretan el microorganismo por más de un año.
La bacteria de la salmonella vive en los intestinos de las personas, animales y
aves. La mayoría de personas están infectadas con salmonella por comer
alimentos que han sido contaminados por las heces. Alimentos comúnmente
infectados son:
 La carne cruda, aves y mariscos. Las heces pueden obtener en carnes y
aves crudas durante el proceso de matanza. Mariscos pueden estar
contaminados si se cosecha a partir de agua contaminada.
 Los huevos crudos. Mientras que la cáscara del huevo puede parecer una
barrera perfecta a la contaminación, algunas gallinas infectadas producen
huevos que contienen Salmonella antes de la concha es aún formado. Los
huevos crudos se usan en las versiones caseras de la mayonesa y la salsa
holandesa.
 Las frutas y verduras. Algunos productos frescos, particularmente las
variedades importadas, puede ser hidratada en el campo o lavado durante el
procesamiento con agua contaminada con salmonela. La contaminación
también puede ocurrir en la cocina, cuando los jugos de carnes y aves
crudas entren en contacto con alimentos crudos, como ensaladas.
Muchos alimentos se contaminan cuando preparado por la gente que no se lavan
bien las manos después de ir al baño o cambiar un pañal. La infección también
puede ocurrir si una persona toca algo que está contaminado, incluyendo los
animales domésticos, especialmente las aves y los reptiles, a continuación, poner
los dedos en la boca.
Los manipuladores de alimentos que vuelven a trabajar antes de la infección
desaparece por completo se puede seguir propagando la enfermedad. Algunas
personas que contraen la infección por Salmonella se convierten en portadores
crónicos, lo que significa que continuará para excretar la bacteria en sus heces o,
en raras ocasiones, la orina durante un año o más después de que sus signos y
síntomas desaparecen. Algunos portadores pueden pasar la infección por
Salmonella, sin tener signos ni síntomas de la enfermedad.
 Staphyloccocus aureus:
El Staphylococcus aureus es un microorganismo que soporta condiciones
ambientales extremas pero se puede inactivar con la congelación y se puede
eliminar con la cocción adecuada.
El Staphylococcus aureus genera una intoxicación aguda, la cual se hace presente
después de pasadas de 2 a 12 horas de la ingesta del alimento contaminado. Los
síntomas son vómitos intensos imposibles de controlar, los que desaparecen
después de horas.
El malestar se genera porque el Staphylococcus aureus desprende una toxina
termoestable en los alimentos contaminados, por lo que en los que fueron
cocinados la toxina prevalece aun cuando no esté presente el agente patógeno.
El Staphylococcus aureus se encuentra en la piel de animales y humanos, así
como también en la garganta y fosas nasales; se estima que casi todas las
personas son portadoras del microorganismo; por lo que existe un alto riesgo de
contaminación de alimentos durante la manipulación de los mismos.
Afortunadamente, el frío impide que el Staphylococcus aureus desarrolle la toxina
que genera la infección, por tanto mientras no se rompa la cadena de frío el
alimento será seguro para el consumo humano.
La enfermedad estafilocócica trasmitida por alimentos, resulta de la Ingestión de
enterotoxinas termoestables preformadas por una cepa toxigénica de
Staphylococcus aureus que contaminó y desarrolló en el alimento. Generalmente
ocurre en brotes, predominantemente en verano, y el organismo responsable es
generalmente aislado de personas involucradas en la preparación del alimento.
La incidencia es desconocida pero es probablemente una de las causas de
enfermedad trasmitida por alimentos más frecuentes. Entre los alimentos
implicados contaminados más frecuentemente se encuentran: ensaladas de papas
y huevos, pastelería, jamón, pollo, helados.
Los integrantes del género Staphylococcus, son cocos gram positivos, de 0.5-1.5
µm de diámetro, catalasa positivos, que se encuentran microscópicamente
aislados, en pares, tétradas o formando racimos irregulares, Son inmóviles,
facultativamente anaerobios, no formadores de esporas, generalmente no
capsulados o con limitada formación de cápsula.
La contaminación de alimentos por S. aureus, está asociada con una forma de
gastroenteritis que se manifiesta clínicamente por un cuadro caracterizado por
vómitos (76% de casos) y diarrea (77% de casos). El corto período de incubación
de 1-6 horas orienta a la sospecha de enfermedad producida por ingestión de una
o mas enterotoxinas preformadas en el alimento que ha sido contaminado con
cepas de S. aureus productor de la misma. Son raramente observados signos de
toxicidad sistémica, tales como fiebre e hipotensión En general, es un cuadro
autolimitado que típicamente se resuelve en 24- 48 horas desde el inicio.
 MESOFILOS AEROBIOS
Un mesófilo es un organismo cuya temperatura de crecimiento óptima está entre
los 15 y los 35ºC. Son microorganismos que necesitan oxigeno para desarrollar
sus funciones vitales, adicionalmente no viven en temperaturas extremas, a eso se
refiere el término mesófilo.
En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de
desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se
estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.
Se denominan aerobios o aeróbicos a los organismos que pueden vivir o
desarrollarse en presencia de oxígeno diatómico, mientras que si lo necesitan se
denominan aerobios estrictos. El adjetivo "aerobio" se aplica no sólo
a organismos sino también a los procesos implicados ("metabolismo aerobio") y a
los ambientes donde se realizan. Un "ambiente aerobio" es aquel rico en oxígeno,
a diferencia de uno anaerobio, donde el oxígeno está ausente, o
uno microaerofílico, donde el oxígeno se encuentra a muy baja concentración
Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de
patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa
presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por
fermentación, no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar:
- Excesiva contaminación de la materia prima
- Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración
- La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos
- La inmediata alteración del producto
El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de
algunos alimentos.
El recuento refleja contenido microbiano de materiales crudos e ingredientes, la
eficiencia del procedimiento de elaboración / proceso, la condición de higiene del
equipo y utensilios y la relación tiempo- temperatura de almacenamiento y
distribución. En el uso o la interpretación del recuento de aerobios mesófilos hay
ciertos factores que deben ser tenidos en cuenta:
Este recuento es sólo de células bacterianas vivas. Los procedimientos que sufre
el alimento en su elaboración, por ejemplo proceso térmico, pueden enmascarar
productos con altos recuentos o condiciones deficientes de higiene. Además, el
almacenamiento prolongado en congelación o con pH bajo resulta en la
disminución del recuento, este recuento no diferencia tipos de bacterias.
 MOHOS Y LEVADURAS
Los mohos pertenecen al mundo de los hongos. Debido a su tamaño pequeño,
ellos pueden ser clasificados como micromycetes (hongos microscópicos) junto
con las levaduras distinguiéndose por su aspecto físico y desarrollo (fibroso para
los hongos, unicelular para las levaduras) aunque la distinción no siempre sea
exacta.
Los mohos se encuentran por todas partes (suelo, agua, plantas...) y son
transportados por el aire, materiales, envases, animales, seres humanos,. La
mayoría de las industrias alimenticias proporcionan las condiciones ambientales y
las materias orgánicas necesarias para su desarrollo.
Estos hongos microscópicos tienen gran capacidad de adaptación y síntesis
bioquímica como así también un potencial enzimático importante pudiendo ser
agentes de la transformación tanto útil como perjudicial.
Ellos son útiles como auxiliares en los procesos industriales:
 maduración de quesos, de algunos productos cárnicos
 producción biotecnológica de enzimas, componentes químicos o
aromáticos, antibióticos, etc.
 biodegradación de algunos residuos industriales o agrícolas o
subproductos.
Ellos son dañinos para los productos alimenticios, llevando a menudo a costosas
pérdidas económicas.
Los mohos pertenecen al mundo de los hongos, los cuales son como plantas sin
clorofila, determinando esto su forma de vida. También, contrariamente a las
plantas superiores que son autótrofas por medio de la fotosíntesis, los mohos se
alimentan absorbiendo directamente las materias orgánicas necesarias para su
crecimiento (heterótrofos). La mayoría de ellos son saprófitos.
La proliferación de los mohos depende de su interacción con las variables fisico-
químicas del medio ambiente (oxígeno, temperatura, humedad, actividad de agua,
pH...).
La mayoría de los mohos son aerobios, aunque algunas especies pueden
desarrollarse en ambientes con escaso contenido de oxígeno (ej. Penicillium
Roqueforti).
La temperatura óptima para su desarrollo va de 20 a 30 ºC. En temperaturas más
bajas, su crecimiento se inhibe, aunque no son destruidos por el frío. Algunas
cepas de Cladosporium o Penicillium pueden desarrollarse alrededor de 0 ºC, y
aún menos (Cladosporium Herbarum desarrolla en carnes a -6 ºC).
La presencia de agua también es un elemento importante para el desarrollo del
moho. El agua está presente en dos formas:
• En la atmósfera, donde la humedad debe estar encima de 70%. Sin embargo
algunas especies más exigentes que requieren 90-95% de humedad.
• En el producto alimenticio el agua disponible para el microorganismo es
designado por Aw, (actividad del agua).
Contrariamente a las bacterias, los mohos se adaptan a valores bajos de Aw
explicando por qué un número grande de productos comestibles no afectados por
bacterias puede contaminarse por mohos durante el almacenamiento (fruta seca,
leche de polvo, semillas...).
Los mohos generan varias clases de esporas asexuales, mono o pluricelulares.
Las esporas se desarrollan en los esporóforos, estructuras especializadas que se
extienden en el aire a partir del micelio vegetativo, y las esporas se acumulan en el
extremo superior de los mismos. Si las esporas están encerradas en un
esporangio (en forma de bolsa) se las llama esporangiosporas. Los conidios son
esporas externas o sea no están encerradas.
Al madurar, estas esporas son esparcidas por el viento.
Muchos mohos pueden reproducirse también a través de esporas sexuales,
generadas por meiosis, o división reductora, de un núcleo diploide (meiosporas).
En la meiosis, el número de cromosomas se divide por la mitad. Las esporas
sexuales contienen sólo un cromosoma de cada par homólogo. La condición
diploide se restablece cuando dos estructuras haploides se unen, completando el
ciclo vital. Los mohos a los que no se les conoce ciclo sexual, se consideran
hongos imperfectos.
Los mohos con estructuras reproductoras sexuales (teleomorfos) corresponden a
tres grupos: ascomicetos, basidiomicetos y zigomicetos. Los ascomicetos
producen sus esporas en ascos, que generalmente se forman dentro de un
complejo cuerpo fructífero, el ascoma. De forma similar, los basidiomicetos
desarrollan sus esporas sexuales externamente, en los basidios que se hallan en
un complejo cuerpo fructífero: el basidioma. Pero este grupo también comprende a
los carbones y las royas, organismos de interés agronómico por ser parásitos
vegetales. Los zigomicetos producen zigosporas a veces visibles a ojo desnudo.
En condiciones naturales, los mohos se reproducen en la mayoría de los casos
asexualmente, las estructuras reproductoras sexuales sólo aparecen
ocasionalmente en circunstancias favorables
LEVADURAS
La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, con una temperatura máxima de
crecimiento entre 24 y 48ºC. Solo unas pocas (2%) son psicrófilas con una
temperatura máxima de crecimiento por debajo de 24ºC, pero mayor es el número
de las levaduras que tienen la temperatura óptima de crecimiento por debajo de
20ºC. No hay levaduras que puedan crecer a 50ºC y solamente unas pocas
pueden desarrollar cerca de 0ºC, entre las que se encuentran Yarrowia lipolytica,
Debaryomyces hansenii y Pichia membranaefaciens. Por otra parte,
Kluyveromyces marxianus crece a 48ºC, mientras que otras de los molinos
azucareros son capaces de proliferar por sobre los 40ºC, entre ellas Pichia
polymorpha, Geotrichum capitatum, Saccharomyces cerevisiae y especies de
Candida y Debaryomyces. En general, la presencia de etanol o bicarbonato
aumenta la temperatura mínima de crecimiento.
La mayoría de las levaduras que causan deterioro de alimentos crece a una
actividad de agua mínima de 0,90-0,95. Sin embargo Zygosaccharomyces rouxii
puede crecer sobre substratos azucarados a una actividad de agua igual a 0,62,
pero son pocas las levaduras que desarrollan en presencia de altas
concentraciones de azúicar o sal. Alrededor de treinta especies se multiplican en
el rango de actividad de agua entre 0,912 y 0,876, correspondientes a los géneros
Zygosaccharomyces, Candida, Debaryomyces, Pichia, Schizosaccharomyces y
Torulaspora.
La mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren un
medio ligeramente ácido con un pH de 4,5 a 6,5. Sin embargo Issatchenkia
orientalis, P. membranaefaciens, Dekkera intermedia y Saccharomyces exiguus
pueden crecer a 1.3-1,7 si el acidulante es un ácido inorgánico.
Sin embargo, las levaduras basidiomicéticas Rhodotorula y Crytococcus son
especia lmente tolerantes a los medios alcalinos, mientras que Saccharomycodes,
Schizosaccharomyces y Dekkera no crecen a pH mayor que 8.
La mayoría de las numerosas especies de levaduras se han clasificado desde el
punto de vista de la reproducción, que puede ser sexual o asexual. En la
reproducción vegetativa, generalmente, una célula madre da lugar a diversas
células hijas por la formación repetida de yemas en la superficie celular; en unas
pocas levaduras la división asexual se hace por escisión celular luego de la
duplicación del núcleo. Tres grupos de hongos acogen a las levaduras: los
ascomicetos, los basidiomicetos y los hongos imperfectos. El primer grupo incluye
las levaduras cuyas estructuras reproductoras sexuales son los ascos sencillos
que contienen ascosporas. Una célula diploide de levadura sufre meiosis y forma
de cuatro a ocho ascosporas, encerradas en el asco. Una ascospora es una célula
haploide que al germinar genera una progenie de células haploides por mitosis
(reproducción asexual). Las células de diferente polaridad sexual se combinan
para formar un nuevo organismo diploide. Entre las levaduras que pertenecen a
los ascomicetos se encuentra Saccharomyces cerevisiae empleada para la
fabricación del pan y la fermentación alcohólica.
Las levaduras están ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se hallan sobre
hojas, flores, frutos, piel, cuero, plumas y tracto digestivo de animales herbívoros y
omnívoros. Algunas están asociadas con insectos pero el suelo es el mayor
reservorio. Algunos géneros son típicos del suelo, por ejemplo Schwanniomyces y
Lipomyces (Déak & Beuchat 1996).
Las levaduras constituyen la causa más probable de alteración de productos tales
como frutas y bebidas sin alcohol, las cuales contienen azúcares fermentables, y
de aquel los substratos donde la elevada acidez, la baja actividad del agua o la
presencia de etanol, reducen el desarrollo bacteriano. Las levaduras comúnmente
asociadas con el deterioro de las frutas secas incluyen Z. rouxii y especies de
Hanseniaspora, Candida, Debaryomyces y Pichia
DESARROLLO EXPERIMENTAL
A continuación se describe el procedimiento que se siguió para realizar las
determinaciones de microorganismos presentes en la muestra alimentaria.
Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994
Bienes y servicios. Preparación y dilución de Muestras de alimentos para su
análisis microbiológico.
Esta Norma Oficial Mexicana establece el procedimiento para la preparación de
diluciones para el análisis microbiológico de productos alimenticios.
PREPARACION DE REACTIVOS
Solución de
hidróxido
de sodio
1.0 N
Pesar
4 g. de
NaOH
Aforar a
100 ml
de agua
Solución de hidróxido de
sodio 1.0 N
A partir de la SC se
prepara la ST
Tomar 1,25 ml de la
solución
concentrada y
llevar a un litro con
agua (solucion de
trabajo)
Distribuir en
porciones 99,
90 y 9 ml según
se requiera
Esterilizar a
121° ± 1,0°C
durante 15
minutos.
Después de la
esterilización, el pH y
los volúmenes finales
de la solución de
trabajo deberán ser
iguales a los iniciales
Preparación de Solución Reguladora de Fosfatos (SC y ST)
Solución
reguladora de
fosfatos
(solución
concentrada)
Pesar 43.0
g de Fosfato
de sodio
monobásico
Disolverlo
en 500 ml
de agua
Ajustar a pH
7.2 con la
solución de
NaOH 1 N
Llevar a
1 L de
agua
Esterilizar
durante 15
minutos a 121°
± 1,0°C.
Conservar en
refrigeración
(solución
concentrada).
NOTA: se prepararon 14
frascos con 90 ml cada uno
de solución reguladora de
fosfatos y se esterilizaron,
para su posterior inoculación.
DILUCIÓN PRIMARIA
A partir de muestras sólidas o semisólidas.
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en
refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder
a su análisis.
DILUCIONES DECIMALES ADICIONALES
Pesar aprox.
10 gr de
muestra en
recipientes
esteriles
Adicionar a un
volumen de 90
a 99 ml del
diluyente, a
temp. similares
Homogenizar en
licuadora de 1 a
2 min(si le
mezcla es muy
viscosa,adicionar
diluyente)
Permitir que las
partículas
grandes se
sedimenten, y
transferir la
cantidad
deseada
Transferir 10ml
de muestra a un
tubo con 90ml
de diluyente
(10-1)
Tomar 10ml
del tubo
anterior y
transferirlo a
uno con 90ml
de diluyente
Repetir el
mismo
proceso hasta
10 -6
Mezclarlo mediante 6 movimientos de
derecha a izquierda, 6 en el sentido de las
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario
y 6 de atrás a adelante, hasta lograr una
completa incorporación del inóculo en el
medio. Dejar solidificar.
NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994,
Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
Preparación del
medio de cultivo
Extracto de
levadura
Triptosa, Agar
Medio
deshidratado
preparar
según indica
el fabricante
Inocular las soluciones de
muestras preparadas
Carne Salsa
Agregar de 12 a 15
ml del medio
Carne Sals
a
Incubar por el tiempo y temperatura que se requiera.
Lectura seleccionar
aquellas placas donde
aparezcan entre 25 a
250 UFC, para
disminuir el error en la
cuenta.
Negativo Positivo
NOTA: cada muestra se realiza
por duplicado
09-13-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994
Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
Esta Norma Oficial Mexicana establece el método general para determinar el
número de mohos y levaduras viables presentes en productos destinados al
consumo humano por medio de la cuenta en placa a 25 ± 1°C.
10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994
Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número
más probable.
Medios
de
cultivo
Caldo lauril
sulfato triptosa
(medio de
enriquecimient
o selectivo).
Composición de medio de cultivo
Disolver los componentes
en 1 l de agua, ajustar pH
6.8
Distribuir en volúmenes de
10 ml en tubos con
dimensiones de 16 x 160
mm. Cada tubo debe tener
campana de fermentación.
Esterilizar a 121 °C
durante 15 min y
luego conservar en
refrigeración
Dejar a prueba
de esterilidad a
24 horas.
INOCULACION Agitar la muestra
Tomar tres tubos de medio
de enriquecimiento de
mayor concentración
Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por
24 ± 2 horas y observar si hay
formación de gas, en caso
contrario prolongar la incubación
hasta 48 ± 2 horas
Transferir a cada tubo 10
ml de la muestra si es
líquida o 10 ml de la
dilución primaria inicial,
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994,
BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE SALMONELLA
EN ALIMENTOS
Medios de pre-
enriquecimiento
Agua de peptona
tamponada
Ingredientes Cantidades
Cloruro sodico 5,0 g
Peptona 10,0 g
Fosfato Sodico D. 3,5 g
Fosfato potásico M. 1,5 g
Agua 1 L
Disolver todos los
ingredientes en agua
Esterilizar durante 20 min a 121°
Esterilizar durante 15 mnts. 121°
Preparación de la muestra
1.- Preparación de la muestra en caldo de pre-enriquecimiento (Caldo lacto sado).
2.- Después de preparar la muestra en caldo de pre-enriquecimiento, se prepera para eel medio de
enriquecimiento.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994,
BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE
STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS.
Preparar la solución primaria y
de, y a partir de ésta las
diluciones decimales (10-1
, 10-2
,
10-3
, etc)
Inoculación de 0.1 ml de cada
dilución en cajas Petri con agar
Baird Parker
Distribuir la muestra con
una varilla de vidrio
estéril
Incubación a 35°C por 24-48 hrs
Contar las
colonias
negras con
hidrólisis de
lecitina
NMX-F-308-1992,
ALIMENTOS- CUENTA DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES
Preparación del
Caldo Lauril
Sulfato Triptosa
C
S
Inocular 1 ml de cada
dilución en los tubos con
Caldo Lauril Sulfato
Triptosa
Incubar a 35°C durante 24-48
hrs
Leer a las 24 hrs
Prueba (+) = producción
de gas
Prueba (-) = producción de
gas
Si no hay tubos positivos,
incubar durante otras 24 hrs
RESULTADOS
En cuanto a la metodología que se utilizó para la determinación de
microrganismos patógenos en alimentos elaborados en el establecimiento
denominado “el taconazo” se obtuvieron los siguientes resultados.
Para la determinación de mesofílicos aerobios según la NOM-092-SSA1-1994,
Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Se
observaron los siguientes resultados.
No se observó crecimiento microbiano, excepto en una caja (dilución 10-6
carne).
También
se evaluaron en cuanto a intervalos de temperatura para determinar
microrganismos patógenos en base a su temperatura óptima de crecimiento.
Grupo bacteriano Temperatura Tiempo de incubación crecimiento
Termofílicos aerobios 55 ± 2 °C 48 ± 2 horas ×
Mesofílicos aerobios 35 ± 2 °C 48 ± 2 horas ×
Psicotróficos 20 ± 2 °C 3- 5 días ×
Psicotrófilos 5 ± 2 °C 7 – 10 días ×
Para la determinación de mohos y levaduras según la NOM-111-SSA1-1994,
Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en
alimentos. Se observaron los siguientes resultados.
Fig. 3. Inoculación en agar papa dextrosa en salsa
Fig. 4. Inoculación en agar papa dextrosa en salsa
.
Fig.2. Inoculación en Agar Triptona – Extracto de levadura en carne y salsa a diversas
temperaturas
Fig. 5. Inoculación en agar papa dextrosa en carne
Fig. 6. Inoculación en agar papa dextrosa en carne.
Se evidenció la presencia de levadura en la caja 10 -2
en carne y también
colonias en crecimiento en la caja 10 -2.
Para la determinación de coliformes fecales según la NMX-F-308-1992
ALIMENTOS – CUENTA DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES. Se
observaron los siguientes resultados.
Fig. 7. Inoculación en agar Lauril sulfato Triptosa en salsa
Fig. 8. Inoculación en Agar Lauril sulfato triptosa en carne
En las figuras 7 y 8 no se pudo confirmar la presencia de coliformes fecales en
carnes ni en salsa, debido a las diferencias en la producción de gas como
indicador de crecimiento.
En cuanto a los resultados sobre coliformes totales según la NOM-112-SSA1-
1994, Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del
número más probable. Se compartió la primera prueba presuntiva debido a la
similitud en la metodología y el mismo medio para esta primera prueba, por lo cual
arrojaron los mismos resultados.
Fig. 9. Inoculación en Agar Lauril SulfatoTriptosa en carne y salsa para
determinación de coliformes totales
Para determinar presencia de Staphylococcus aureus según la NOM-115-SSA1-
1994, Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus
aureus en alimentos. Se obtuvieron los siguientes resultados.
Figura. 10. Inoculación en agar Baird- Parker en salsa.
Fig. 11. Inoculación en agar Baird- Parker en carne para determinación de
Staphylococcus aureus .
En las figuras 10 y 11 se puede observar la presencia de Stapylococcus aureus
en el medio Baird- Parker en todas las cajas hasta la dilución 10-6
.
Los resultados para la determinación de Salmonella según la NOM- 114-SSA1-
1994, BIENES Y SERVICIOS. METODO PARA LA DETERMINACION DE
SALMONELLA EN ALIMENTOS. Arrojaron los siguientes resultados
Fig. 11. Inoculación en caldo Tetrationato en salsa para determinación de
Salmonella
Fig. 12. Inoculación en caldo tetrationato en carne para determinación de
Salmonella
En las cajas en las cuales se inoculó el caldo tetrationato para determinar
crecimiento de Salmonella no se pudo evidenciar la presencia de esta misma
DISCUSIÓN
Sobre los resultados que se encontraron a través de las observaciones que se
hicieron según lo marcan las normas establecidas para la determinación de
microrganismos presentes en las alimentos , estos fueron congruentes entre sí ya
que en los experimentos para determinar hongos y levaduras dieron positivo, lo
cual comparándolo con el experimento de coliformes fecales y coliformes totales,
si bien no dieron positivo para esta prueba se determinó por observaciones
posteriores en la producción excesiva de gas que había presencia de levadura.
Por otra parte en la determinación de Salmonella dio negativo para la prueba, sin
embargo si se encontró crecimiento de Enterobacter lo cual se comprobó de
acuerdo con la morfología y características consultada en la bibliografía. Al hacer
las pruebas para mesofílicos aerobios no se encontró crecimiento de estos, esto
puede ser debido a factores tales como una mala técnica de inoculación,
contaminación del medio o bien pudiera destacarse la inocuidad del alimento, lo
cual es poco probable debido a las observaciones hechas anteriormente.
CONCLUSIÓN
De acuerdo con los experimentos realizados, se confirmaron 2 de los 6 realizados,
los cuales fueron hongos y levaduras, Staphylococcus aureus. En cuanto a los
demás experimentos realizados no se pudo pasar de la prueba presuntiva a la
confirmatoria, ya que en las primeras no se podían sospechar crecimiento del
microrganismo estudiado, dadas estas circunstancias se destacó que la carne era
confiable para el consumo humano, y la salsa estaba dentro de los límites de
microrganismos permisibles.
BIBLIOGRAFÍA
http://www.slideshare.net/lucasburchard/coliformes
http://es.wikipedia.org/wiki/Coliforme
http://www.revbiomed.uady.mx/pdf/rb061721.pdf “Coliformes fecales y mesofilos aerobios en
alimentos, superficies y manos”
http://salmonelosis.net/
http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonelosis
http://www.slideshare.net/nikelout/staphylococcus
http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus
http://www.bvsops.org.uy/pdf/aureus.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Organismo_aerobio
http://www.analizacalidad.com/docftp/fi189arm2004-4(2).pdf
http://www.anmat.gov.ar/alimentos/Guia_de_interpretacion_resultados_microbiologicos.pdf
(PDF) Leonor Carrillo. LOS HONGOS DE LOS ALIMENTOS Y FORRAJES “LEVADURAS”
(PDF)Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 1 Microorganismos
TEMAS DE HIGIENE DE LOS ALIMENTOS, Ángel E. Caballero Torres, editorial ciencias medicas,
2008
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ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

  • 1. INGENIERIA BIOQUIMICA REPORTE DE PRÁCTICA ANALISIS DE ALIMENTOS SANIDAD ALIMENTARIA CATEDRÁTICO QBP. AURA FLORES INTEGRANTES DE EQUIPO Alvarez Gonzalez Obed Cruz Cruz Jose Manuel Cruz Enriques Maria Gpe. Espinoza Maza Fatima Del C. Nangusé Orantes Alejandra Reyes Ovando Chrystel Gpe. TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS 22 DE OCTUBRE DE 2012
  • 2. OBJETIVO Analizar las muestras alimenticias hechas en el restaurant “El Taconazo” e identificar los microorganismos presentes bajo el régimen de las Normas alimenticias (NOM).
  • 3. MARCO TEÓRICO .  COLIFORMES FECALES. Las bacterias coliformes fecales forman parte del total del grupo coliforme. Son definidas como bacilos Gram-negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44.5 °C +/- 0.2 °C dentro de las 24 +/- 2 horas. La mayor especie en el grupo de coliforme fecal es el Escherichia coli. Escherichia coli, forma parte importante de la microbiota intestinal del hombre y de los animales de sangre caliente, sin embargo, algunas cepas han desarrollado capacidad para provocar enfermedad en el hombre, como son las infecciones gastrointestinales. Estas cepas patógenas representan la principal causa de diarrea infantil en el mundo. La capacidad de E. coli patógena para producir enfermedad está determinada por factores de virulencia que le permitan sobrevivir en condiciones ambientales adversas. Actualmente se reconocen 6 grupos de E. coli patógenas que dan lugar a diversos padecimientos, entre estos existen diferencias clínicas y epidemiológicas, así como en la estructura antigénica y mecanismos de patogenicidad de los diferentes grupos. Cepas patógenas de E. Coli:  Enteropatógena (ECEP).  Enterotoxigénica (ECET).  Enteroinvasiva (ECEI).  Enterohemorrágica (ECEH).  Enteroadherente (ECEA).  Enteroagregativa (ECEG). La presencia de coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposición. Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Los niveles recomendados de bacterias coliformes fecales son: Agua potable: menos de 0 colonias por 100 ml de la muestra de agua. Natación: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra de agua.
  • 4. La E. coli se usa en el análisis de quesos frescos, quesillos, cereales, masas con rellenos, pescado congelado, frutas y verduras frescas. Los límites varían entre 0 a 1.000 UFC/gr.  COLIFORMES TOTALES: Los coliformes son bacterias que tienen forma de bastoncillos, que no forman esporas, y son Gram negativos aerobias y anaerobias facultativas, su característica principal es que fermenta la lactosa con formación de gases al cabo de 48 horas a una temperatura de 35° a 37°C, donde los Coliformes fecales se diferencian de estar por ser termo tolerantes a temperaturas de 44°-46°C. El grupo de microorganismos Coliformes es adecuado como indicador de contaminacion bacteriana, ya que es el grupo de mas rápida y fácil deteccion. Los microorganismos indicadores son aquellos que tienen un comportamiento similar a los patógenos pero son más rápidos, económicos y fáciles de identificar. Una vez se ha evidenciado la presencia de grupos indicadores, se puede inferir que los patógenos se encuentran presentes en la misma concentracion y que su comportamiento frente a diferentes factores como pH, temperatura, presencia de nutrientes o sistemas de desinfeccion es similar a la del indicador. Los coliformes para ser utilizados como indicadores deben poseer las siguientes propiedades: 1.- Especificidad: solo se deben encontrar en el medio intestinal 2.- Se hallaran en grandes cantidades de tal manera qued puedan ser detectadas en altas dilusiones. 3.- Ser muy resistentes a las condiciones ambientales, extra intestinales. El grupo coliformes, por ende agrupa a todas las especies bacterianas que son bioquímicamente similares a E. coli, tales como Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. No todas estas bacterias se encuentran en el intestino por lo que se desarrolló el concepto de coliformes fecales, a diferencia de coliformes totales. Los coliformes totales se usan para evaluar leche pasteurizada y en polvo, helados, pastas frescas, fideos, cereales y formulas para lactantes. El lÍmite varía entre 10 a 100 UFC/gm.  Salmonella. Es una bacteria patógena para el hombre y muchos animales, produce una enfermedad de origen alimentario conocida como salmonelosis, que se presenta en formas esporádica y de brotes. Es la causa más común de ETA en diversos países. Es uno de los géneros más estudiados entre los patógenos que pueden ser aislados de los alimentos. Cuba es el primer agente causal de brotes de origen alimentario. El primer
  • 5. brote de salmonelosis se describió en Alemania en 1888, entre 50 personas que habían ingerido carne cruda molida proveniente de una vaca moribunda. Los integrantes de este género son bacilos gramnegativos no esporulados oxidasa negativa, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. La mayoría no fermentan la lactosa y son móviles, son aerobios o anaerobios facultativos, contienen endotoxinas, generalmente son termolábiles, resisten la congelación y algunos agentes químicos, poseen una rica composición antigénetica que se emplea como base para la identificación de sus miembros en serotipos, recientemente designados como serovares. Es un agente zoonótico de distribución universal. Puede transmitirse por contacto directo a través de fómites, pero la vía más frecuente contaminación cruzada durante la manipulación, en el procesador de alimentos, o por aguas contaminadas con aguas residuales. Crece con facilidad en la sangre formando colonias de 2 a 3 milímetros. En laboratorios de microbiología clínica puede aislarse en heces con medios selectivos para inhibir el crecimiento de otras bacterias patógenas y de la flora intestinal. Clásicamente se distinguían tres únicas especies patógenas primarias: S. typhy, S. cholerae-suis y S. enteritidis. A su vez, según la serotipificación de Kauffman y White, eran clasificadas en más de 2000 serotipos con base en los antígenos flagelares H (proteicos) y antígenos somáticos O (fracción polisacárida del lipopolisacárido bacilar). S. typhi posee además un antígeno de virulencia. El género Salmonella es de taxonomía difícil, modificada en estos últimos años por el aporte de estudios moleculares de homología de ADN que han clarificado el panorama taxonómico de las enterobacterias. Para la bacteriología clínica, Salmonella es un bacilo patógeno primario (como Shigella, Yersinia y ciertas cepas de E. Coli), anaerobio facultativo, algunos móviles y no fermentan la lactosa. S. typhi es la única serovariedad que no produce gas en la fermentación de los azúcares. La salmonelosis, es una enfermedad infectocontagiosa producida por enterobacterias del género Salmonella. Comprende un conjunto de cuadros clínicos cuya principal manifestación es la gastroenteritis aguda, una de las intoxicaciones alimentarias más comunes causadas por agua y alimentos contaminados, especialmente carnes. Se clasifica como enfermedad de origen alimentario, pues los alimentos contaminados constituyen el modo predominante de transmisión. Se puede transmitir durante toda la evolución de la infección, usualmente de unos días a varias semanas. A veces el estado de portador temporal continúa durante meses, especialmente en los lactantes. Cerca del 1% de los adultos infectados y del 5% de los niños menores de 5 años excretan el microorganismo por más de un año. La bacteria de la salmonella vive en los intestinos de las personas, animales y aves. La mayoría de personas están infectadas con salmonella por comer alimentos que han sido contaminados por las heces. Alimentos comúnmente infectados son:
  • 6.  La carne cruda, aves y mariscos. Las heces pueden obtener en carnes y aves crudas durante el proceso de matanza. Mariscos pueden estar contaminados si se cosecha a partir de agua contaminada.  Los huevos crudos. Mientras que la cáscara del huevo puede parecer una barrera perfecta a la contaminación, algunas gallinas infectadas producen huevos que contienen Salmonella antes de la concha es aún formado. Los huevos crudos se usan en las versiones caseras de la mayonesa y la salsa holandesa.  Las frutas y verduras. Algunos productos frescos, particularmente las variedades importadas, puede ser hidratada en el campo o lavado durante el procesamiento con agua contaminada con salmonela. La contaminación también puede ocurrir en la cocina, cuando los jugos de carnes y aves crudas entren en contacto con alimentos crudos, como ensaladas. Muchos alimentos se contaminan cuando preparado por la gente que no se lavan bien las manos después de ir al baño o cambiar un pañal. La infección también puede ocurrir si una persona toca algo que está contaminado, incluyendo los animales domésticos, especialmente las aves y los reptiles, a continuación, poner los dedos en la boca. Los manipuladores de alimentos que vuelven a trabajar antes de la infección desaparece por completo se puede seguir propagando la enfermedad. Algunas personas que contraen la infección por Salmonella se convierten en portadores crónicos, lo que significa que continuará para excretar la bacteria en sus heces o, en raras ocasiones, la orina durante un año o más después de que sus signos y síntomas desaparecen. Algunos portadores pueden pasar la infección por Salmonella, sin tener signos ni síntomas de la enfermedad.  Staphyloccocus aureus: El Staphylococcus aureus es un microorganismo que soporta condiciones ambientales extremas pero se puede inactivar con la congelación y se puede eliminar con la cocción adecuada. El Staphylococcus aureus genera una intoxicación aguda, la cual se hace presente después de pasadas de 2 a 12 horas de la ingesta del alimento contaminado. Los síntomas son vómitos intensos imposibles de controlar, los que desaparecen después de horas. El malestar se genera porque el Staphylococcus aureus desprende una toxina termoestable en los alimentos contaminados, por lo que en los que fueron cocinados la toxina prevalece aun cuando no esté presente el agente patógeno.
  • 7. El Staphylococcus aureus se encuentra en la piel de animales y humanos, así como también en la garganta y fosas nasales; se estima que casi todas las personas son portadoras del microorganismo; por lo que existe un alto riesgo de contaminación de alimentos durante la manipulación de los mismos. Afortunadamente, el frío impide que el Staphylococcus aureus desarrolle la toxina que genera la infección, por tanto mientras no se rompa la cadena de frío el alimento será seguro para el consumo humano. La enfermedad estafilocócica trasmitida por alimentos, resulta de la Ingestión de enterotoxinas termoestables preformadas por una cepa toxigénica de Staphylococcus aureus que contaminó y desarrolló en el alimento. Generalmente ocurre en brotes, predominantemente en verano, y el organismo responsable es generalmente aislado de personas involucradas en la preparación del alimento. La incidencia es desconocida pero es probablemente una de las causas de enfermedad trasmitida por alimentos más frecuentes. Entre los alimentos implicados contaminados más frecuentemente se encuentran: ensaladas de papas y huevos, pastelería, jamón, pollo, helados. Los integrantes del género Staphylococcus, son cocos gram positivos, de 0.5-1.5 µm de diámetro, catalasa positivos, que se encuentran microscópicamente aislados, en pares, tétradas o formando racimos irregulares, Son inmóviles, facultativamente anaerobios, no formadores de esporas, generalmente no capsulados o con limitada formación de cápsula. La contaminación de alimentos por S. aureus, está asociada con una forma de gastroenteritis que se manifiesta clínicamente por un cuadro caracterizado por vómitos (76% de casos) y diarrea (77% de casos). El corto período de incubación de 1-6 horas orienta a la sospecha de enfermedad producida por ingestión de una o mas enterotoxinas preformadas en el alimento que ha sido contaminado con cepas de S. aureus productor de la misma. Son raramente observados signos de toxicidad sistémica, tales como fiebre e hipotensión En general, es un cuadro autolimitado que típicamente se resuelve en 24- 48 horas desde el inicio.  MESOFILOS AEROBIOS Un mesófilo es un organismo cuya temperatura de crecimiento óptima está entre los 15 y los 35ºC. Son microorganismos que necesitan oxigeno para desarrollar sus funciones vitales, adicionalmente no viven en temperaturas extremas, a eso se refiere el término mesófilo. En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Se denominan aerobios o aeróbicos a los organismos que pueden vivir o desarrollarse en presencia de oxígeno diatómico, mientras que si lo necesitan se denominan aerobios estrictos. El adjetivo "aerobio" se aplica no sólo a organismos sino también a los procesos implicados ("metabolismo aerobio") y a los ambientes donde se realizan. Un "ambiente aerobio" es aquel rico en oxígeno, a diferencia de uno anaerobio, donde el oxígeno está ausente, o
  • 8. uno microaerofílico, donde el oxígeno se encuentra a muy baja concentración Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: - Excesiva contaminación de la materia prima - Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración - La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos - La inmediata alteración del producto El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos. El recuento refleja contenido microbiano de materiales crudos e ingredientes, la eficiencia del procedimiento de elaboración / proceso, la condición de higiene del equipo y utensilios y la relación tiempo- temperatura de almacenamiento y distribución. En el uso o la interpretación del recuento de aerobios mesófilos hay ciertos factores que deben ser tenidos en cuenta: Este recuento es sólo de células bacterianas vivas. Los procedimientos que sufre el alimento en su elaboración, por ejemplo proceso térmico, pueden enmascarar productos con altos recuentos o condiciones deficientes de higiene. Además, el almacenamiento prolongado en congelación o con pH bajo resulta en la disminución del recuento, este recuento no diferencia tipos de bacterias.  MOHOS Y LEVADURAS Los mohos pertenecen al mundo de los hongos. Debido a su tamaño pequeño, ellos pueden ser clasificados como micromycetes (hongos microscópicos) junto con las levaduras distinguiéndose por su aspecto físico y desarrollo (fibroso para los hongos, unicelular para las levaduras) aunque la distinción no siempre sea exacta. Los mohos se encuentran por todas partes (suelo, agua, plantas...) y son transportados por el aire, materiales, envases, animales, seres humanos,. La mayoría de las industrias alimenticias proporcionan las condiciones ambientales y las materias orgánicas necesarias para su desarrollo. Estos hongos microscópicos tienen gran capacidad de adaptación y síntesis bioquímica como así también un potencial enzimático importante pudiendo ser agentes de la transformación tanto útil como perjudicial. Ellos son útiles como auxiliares en los procesos industriales:  maduración de quesos, de algunos productos cárnicos  producción biotecnológica de enzimas, componentes químicos o aromáticos, antibióticos, etc.  biodegradación de algunos residuos industriales o agrícolas o subproductos.
  • 9. Ellos son dañinos para los productos alimenticios, llevando a menudo a costosas pérdidas económicas. Los mohos pertenecen al mundo de los hongos, los cuales son como plantas sin clorofila, determinando esto su forma de vida. También, contrariamente a las plantas superiores que son autótrofas por medio de la fotosíntesis, los mohos se alimentan absorbiendo directamente las materias orgánicas necesarias para su crecimiento (heterótrofos). La mayoría de ellos son saprófitos. La proliferación de los mohos depende de su interacción con las variables fisico- químicas del medio ambiente (oxígeno, temperatura, humedad, actividad de agua, pH...). La mayoría de los mohos son aerobios, aunque algunas especies pueden desarrollarse en ambientes con escaso contenido de oxígeno (ej. Penicillium Roqueforti). La temperatura óptima para su desarrollo va de 20 a 30 ºC. En temperaturas más bajas, su crecimiento se inhibe, aunque no son destruidos por el frío. Algunas cepas de Cladosporium o Penicillium pueden desarrollarse alrededor de 0 ºC, y aún menos (Cladosporium Herbarum desarrolla en carnes a -6 ºC). La presencia de agua también es un elemento importante para el desarrollo del moho. El agua está presente en dos formas: • En la atmósfera, donde la humedad debe estar encima de 70%. Sin embargo algunas especies más exigentes que requieren 90-95% de humedad. • En el producto alimenticio el agua disponible para el microorganismo es designado por Aw, (actividad del agua). Contrariamente a las bacterias, los mohos se adaptan a valores bajos de Aw explicando por qué un número grande de productos comestibles no afectados por bacterias puede contaminarse por mohos durante el almacenamiento (fruta seca, leche de polvo, semillas...). Los mohos generan varias clases de esporas asexuales, mono o pluricelulares. Las esporas se desarrollan en los esporóforos, estructuras especializadas que se extienden en el aire a partir del micelio vegetativo, y las esporas se acumulan en el extremo superior de los mismos. Si las esporas están encerradas en un esporangio (en forma de bolsa) se las llama esporangiosporas. Los conidios son esporas externas o sea no están encerradas. Al madurar, estas esporas son esparcidas por el viento. Muchos mohos pueden reproducirse también a través de esporas sexuales, generadas por meiosis, o división reductora, de un núcleo diploide (meiosporas). En la meiosis, el número de cromosomas se divide por la mitad. Las esporas sexuales contienen sólo un cromosoma de cada par homólogo. La condición diploide se restablece cuando dos estructuras haploides se unen, completando el ciclo vital. Los mohos a los que no se les conoce ciclo sexual, se consideran hongos imperfectos. Los mohos con estructuras reproductoras sexuales (teleomorfos) corresponden a tres grupos: ascomicetos, basidiomicetos y zigomicetos. Los ascomicetos producen sus esporas en ascos, que generalmente se forman dentro de un
  • 10. complejo cuerpo fructífero, el ascoma. De forma similar, los basidiomicetos desarrollan sus esporas sexuales externamente, en los basidios que se hallan en un complejo cuerpo fructífero: el basidioma. Pero este grupo también comprende a los carbones y las royas, organismos de interés agronómico por ser parásitos vegetales. Los zigomicetos producen zigosporas a veces visibles a ojo desnudo. En condiciones naturales, los mohos se reproducen en la mayoría de los casos asexualmente, las estructuras reproductoras sexuales sólo aparecen ocasionalmente en circunstancias favorables LEVADURAS La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, con una temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48ºC. Solo unas pocas (2%) son psicrófilas con una temperatura máxima de crecimiento por debajo de 24ºC, pero mayor es el número de las levaduras que tienen la temperatura óptima de crecimiento por debajo de 20ºC. No hay levaduras que puedan crecer a 50ºC y solamente unas pocas pueden desarrollar cerca de 0ºC, entre las que se encuentran Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii y Pichia membranaefaciens. Por otra parte, Kluyveromyces marxianus crece a 48ºC, mientras que otras de los molinos azucareros son capaces de proliferar por sobre los 40ºC, entre ellas Pichia polymorpha, Geotrichum capitatum, Saccharomyces cerevisiae y especies de Candida y Debaryomyces. En general, la presencia de etanol o bicarbonato aumenta la temperatura mínima de crecimiento. La mayoría de las levaduras que causan deterioro de alimentos crece a una actividad de agua mínima de 0,90-0,95. Sin embargo Zygosaccharomyces rouxii puede crecer sobre substratos azucarados a una actividad de agua igual a 0,62, pero son pocas las levaduras que desarrollan en presencia de altas concentraciones de azúicar o sal. Alrededor de treinta especies se multiplican en el rango de actividad de agua entre 0,912 y 0,876, correspondientes a los géneros Zygosaccharomyces, Candida, Debaryomyces, Pichia, Schizosaccharomyces y Torulaspora. La mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren un medio ligeramente ácido con un pH de 4,5 a 6,5. Sin embargo Issatchenkia orientalis, P. membranaefaciens, Dekkera intermedia y Saccharomyces exiguus pueden crecer a 1.3-1,7 si el acidulante es un ácido inorgánico. Sin embargo, las levaduras basidiomicéticas Rhodotorula y Crytococcus son especia lmente tolerantes a los medios alcalinos, mientras que Saccharomycodes, Schizosaccharomyces y Dekkera no crecen a pH mayor que 8. La mayoría de las numerosas especies de levaduras se han clasificado desde el punto de vista de la reproducción, que puede ser sexual o asexual. En la reproducción vegetativa, generalmente, una célula madre da lugar a diversas células hijas por la formación repetida de yemas en la superficie celular; en unas pocas levaduras la división asexual se hace por escisión celular luego de la duplicación del núcleo. Tres grupos de hongos acogen a las levaduras: los
  • 11. ascomicetos, los basidiomicetos y los hongos imperfectos. El primer grupo incluye las levaduras cuyas estructuras reproductoras sexuales son los ascos sencillos que contienen ascosporas. Una célula diploide de levadura sufre meiosis y forma de cuatro a ocho ascosporas, encerradas en el asco. Una ascospora es una célula haploide que al germinar genera una progenie de células haploides por mitosis (reproducción asexual). Las células de diferente polaridad sexual se combinan para formar un nuevo organismo diploide. Entre las levaduras que pertenecen a los ascomicetos se encuentra Saccharomyces cerevisiae empleada para la fabricación del pan y la fermentación alcohólica. Las levaduras están ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se hallan sobre hojas, flores, frutos, piel, cuero, plumas y tracto digestivo de animales herbívoros y omnívoros. Algunas están asociadas con insectos pero el suelo es el mayor reservorio. Algunos géneros son típicos del suelo, por ejemplo Schwanniomyces y Lipomyces (Déak & Beuchat 1996). Las levaduras constituyen la causa más probable de alteración de productos tales como frutas y bebidas sin alcohol, las cuales contienen azúcares fermentables, y de aquel los substratos donde la elevada acidez, la baja actividad del agua o la presencia de etanol, reducen el desarrollo bacteriano. Las levaduras comúnmente asociadas con el deterioro de las frutas secas incluyen Z. rouxii y especies de Hanseniaspora, Candida, Debaryomyces y Pichia
  • 12. DESARROLLO EXPERIMENTAL A continuación se describe el procedimiento que se siguió para realizar las determinaciones de microorganismos presentes en la muestra alimentaria. Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994 Bienes y servicios. Preparación y dilución de Muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Esta Norma Oficial Mexicana establece el procedimiento para la preparación de diluciones para el análisis microbiológico de productos alimenticios. PREPARACION DE REACTIVOS Solución de hidróxido de sodio 1.0 N Pesar 4 g. de NaOH Aforar a 100 ml de agua Solución de hidróxido de sodio 1.0 N
  • 13. A partir de la SC se prepara la ST Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solucion de trabajo) Distribuir en porciones 99, 90 y 9 ml según se requiera Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales Preparación de Solución Reguladora de Fosfatos (SC y ST) Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) Pesar 43.0 g de Fosfato de sodio monobásico Disolverlo en 500 ml de agua Ajustar a pH 7.2 con la solución de NaOH 1 N Llevar a 1 L de agua Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C. Conservar en refrigeración (solución concentrada). NOTA: se prepararon 14 frascos con 90 ml cada uno de solución reguladora de fosfatos y se esterilizaron, para su posterior inoculación.
  • 14. DILUCIÓN PRIMARIA A partir de muestras sólidas o semisólidas. Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. DILUCIONES DECIMALES ADICIONALES Pesar aprox. 10 gr de muestra en recipientes esteriles Adicionar a un volumen de 90 a 99 ml del diluyente, a temp. similares Homogenizar en licuadora de 1 a 2 min(si le mezcla es muy viscosa,adicionar diluyente) Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada Transferir 10ml de muestra a un tubo con 90ml de diluyente (10-1) Tomar 10ml del tubo anterior y transferirlo a uno con 90ml de diluyente Repetir el mismo proceso hasta 10 -6
  • 15. Mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio. Dejar solidificar. NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Preparación del medio de cultivo Extracto de levadura Triptosa, Agar Medio deshidratado preparar según indica el fabricante Inocular las soluciones de muestras preparadas Carne Salsa Agregar de 12 a 15 ml del medio Carne Sals a Incubar por el tiempo y temperatura que se requiera. Lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta. Negativo Positivo NOTA: cada muestra se realiza por duplicado
  • 16. 09-13-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994 Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Esta Norma Oficial Mexicana establece el método general para determinar el número de mohos y levaduras viables presentes en productos destinados al consumo humano por medio de la cuenta en placa a 25 ± 1°C.
  • 17. 10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994 Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. Medios de cultivo Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimient o selectivo). Composición de medio de cultivo Disolver los componentes en 1 l de agua, ajustar pH 6.8 Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm. Cada tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar a 121 °C durante 15 min y luego conservar en refrigeración Dejar a prueba de esterilidad a 24 horas. INOCULACION Agitar la muestra Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas Transferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria inicial,
  • 18. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS Medios de pre- enriquecimiento Agua de peptona tamponada Ingredientes Cantidades Cloruro sodico 5,0 g Peptona 10,0 g Fosfato Sodico D. 3,5 g Fosfato potásico M. 1,5 g Agua 1 L Disolver todos los ingredientes en agua Esterilizar durante 20 min a 121° Esterilizar durante 15 mnts. 121°
  • 19.
  • 20. Preparación de la muestra 1.- Preparación de la muestra en caldo de pre-enriquecimiento (Caldo lacto sado).
  • 21. 2.- Después de preparar la muestra en caldo de pre-enriquecimiento, se prepera para eel medio de enriquecimiento.
  • 22. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS. Preparar la solución primaria y de, y a partir de ésta las diluciones decimales (10-1 , 10-2 , 10-3 , etc) Inoculación de 0.1 ml de cada dilución en cajas Petri con agar Baird Parker Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estéril Incubación a 35°C por 24-48 hrs Contar las colonias negras con hidrólisis de lecitina
  • 23. NMX-F-308-1992, ALIMENTOS- CUENTA DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES Preparación del Caldo Lauril Sulfato Triptosa C S Inocular 1 ml de cada dilución en los tubos con Caldo Lauril Sulfato Triptosa Incubar a 35°C durante 24-48 hrs Leer a las 24 hrs Prueba (+) = producción de gas Prueba (-) = producción de gas Si no hay tubos positivos, incubar durante otras 24 hrs
  • 24. RESULTADOS En cuanto a la metodología que se utilizó para la determinación de microrganismos patógenos en alimentos elaborados en el establecimiento denominado “el taconazo” se obtuvieron los siguientes resultados. Para la determinación de mesofílicos aerobios según la NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Se observaron los siguientes resultados. No se observó crecimiento microbiano, excepto en una caja (dilución 10-6 carne). También se evaluaron en cuanto a intervalos de temperatura para determinar microrganismos patógenos en base a su temperatura óptima de crecimiento. Grupo bacteriano Temperatura Tiempo de incubación crecimiento Termofílicos aerobios 55 ± 2 °C 48 ± 2 horas × Mesofílicos aerobios 35 ± 2 °C 48 ± 2 horas × Psicotróficos 20 ± 2 °C 3- 5 días × Psicotrófilos 5 ± 2 °C 7 – 10 días ×
  • 25. Para la determinación de mohos y levaduras según la NOM-111-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Se observaron los siguientes resultados. Fig. 3. Inoculación en agar papa dextrosa en salsa Fig. 4. Inoculación en agar papa dextrosa en salsa . Fig.2. Inoculación en Agar Triptona – Extracto de levadura en carne y salsa a diversas temperaturas
  • 26. Fig. 5. Inoculación en agar papa dextrosa en carne Fig. 6. Inoculación en agar papa dextrosa en carne. Se evidenció la presencia de levadura en la caja 10 -2 en carne y también colonias en crecimiento en la caja 10 -2. Para la determinación de coliformes fecales según la NMX-F-308-1992 ALIMENTOS – CUENTA DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES. Se observaron los siguientes resultados.
  • 27. Fig. 7. Inoculación en agar Lauril sulfato Triptosa en salsa Fig. 8. Inoculación en Agar Lauril sulfato triptosa en carne En las figuras 7 y 8 no se pudo confirmar la presencia de coliformes fecales en carnes ni en salsa, debido a las diferencias en la producción de gas como indicador de crecimiento.
  • 28. En cuanto a los resultados sobre coliformes totales según la NOM-112-SSA1- 1994, Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. Se compartió la primera prueba presuntiva debido a la similitud en la metodología y el mismo medio para esta primera prueba, por lo cual arrojaron los mismos resultados. Fig. 9. Inoculación en Agar Lauril SulfatoTriptosa en carne y salsa para determinación de coliformes totales Para determinar presencia de Staphylococcus aureus según la NOM-115-SSA1- 1994, Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. Se obtuvieron los siguientes resultados. Figura. 10. Inoculación en agar Baird- Parker en salsa.
  • 29. Fig. 11. Inoculación en agar Baird- Parker en carne para determinación de Staphylococcus aureus . En las figuras 10 y 11 se puede observar la presencia de Stapylococcus aureus en el medio Baird- Parker en todas las cajas hasta la dilución 10-6 . Los resultados para la determinación de Salmonella según la NOM- 114-SSA1- 1994, BIENES Y SERVICIOS. METODO PARA LA DETERMINACION DE SALMONELLA EN ALIMENTOS. Arrojaron los siguientes resultados
  • 30. Fig. 11. Inoculación en caldo Tetrationato en salsa para determinación de Salmonella Fig. 12. Inoculación en caldo tetrationato en carne para determinación de Salmonella En las cajas en las cuales se inoculó el caldo tetrationato para determinar crecimiento de Salmonella no se pudo evidenciar la presencia de esta misma
  • 31. DISCUSIÓN Sobre los resultados que se encontraron a través de las observaciones que se hicieron según lo marcan las normas establecidas para la determinación de microrganismos presentes en las alimentos , estos fueron congruentes entre sí ya que en los experimentos para determinar hongos y levaduras dieron positivo, lo cual comparándolo con el experimento de coliformes fecales y coliformes totales, si bien no dieron positivo para esta prueba se determinó por observaciones posteriores en la producción excesiva de gas que había presencia de levadura. Por otra parte en la determinación de Salmonella dio negativo para la prueba, sin embargo si se encontró crecimiento de Enterobacter lo cual se comprobó de acuerdo con la morfología y características consultada en la bibliografía. Al hacer las pruebas para mesofílicos aerobios no se encontró crecimiento de estos, esto puede ser debido a factores tales como una mala técnica de inoculación, contaminación del medio o bien pudiera destacarse la inocuidad del alimento, lo cual es poco probable debido a las observaciones hechas anteriormente.
  • 32. CONCLUSIÓN De acuerdo con los experimentos realizados, se confirmaron 2 de los 6 realizados, los cuales fueron hongos y levaduras, Staphylococcus aureus. En cuanto a los demás experimentos realizados no se pudo pasar de la prueba presuntiva a la confirmatoria, ya que en las primeras no se podían sospechar crecimiento del microrganismo estudiado, dadas estas circunstancias se destacó que la carne era confiable para el consumo humano, y la salsa estaba dentro de los límites de microrganismos permisibles.
  • 33. BIBLIOGRAFÍA http://www.slideshare.net/lucasburchard/coliformes http://es.wikipedia.org/wiki/Coliforme http://www.revbiomed.uady.mx/pdf/rb061721.pdf “Coliformes fecales y mesofilos aerobios en alimentos, superficies y manos” http://salmonelosis.net/ http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonelosis http://www.slideshare.net/nikelout/staphylococcus http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus http://www.bvsops.org.uy/pdf/aureus.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Organismo_aerobio http://www.analizacalidad.com/docftp/fi189arm2004-4(2).pdf http://www.anmat.gov.ar/alimentos/Guia_de_interpretacion_resultados_microbiologicos.pdf (PDF) Leonor Carrillo. LOS HONGOS DE LOS ALIMENTOS Y FORRAJES “LEVADURAS” (PDF)Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 1 Microorganismos TEMAS DE HIGIENE DE LOS ALIMENTOS, Ángel E. Caballero Torres, editorial ciencias medicas, 2008