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Fase estacionaria

                    2   Fase móvil
                                     º




                               1

                                         º



                                                 º



                                             1
Descubridor
• El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail
  Semenovich Tsvett, 1872-1919)
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

• En este caso se utiliza una placa recubierta con fase
  estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante
  a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por
  capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo
  largo de ésta produciendo “manchas” de los
  componentes.
• Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente,
  plástico (ej: acetato) ó metálicos (ej: aluminio). Los
  tamaños de la placa para CCf convencional son: 20 x 20;
  10 x 20 y 5 x 2.
• Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia,
  para facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa
  indicador y los componentes no son coloridos se
  requerirán técnicas de revelado.
M é to d o s C ro m a to g rá fic o s


        F u n d a m e n to :


* S o n m é to d o s e n lo s q u e lo s c o m p o n e n te s d e u n a
 m e z c la s e v a n re p a rtie n d o d e fo rm a d ife re n c ia d a
 e n tre d o s fa s e s : u n a m ó v il y o tra e s ta c io n a ria .
* L a fa s e m ó v il p u e d e s e r u n g a s (c ro m a to g ra fía d e
 g a s e s ) o u n líq u id o (c ro m a to g ra fíalíquida) ).
                                (cromatografía líq u id a
* L a fa s e e s ta c io n a ria e s g e n e ra lm e n te u n líq u id o , q u e
 re c u b re la s u p e rfic ie d e p a rtíc u la s s ó lid a s , o e n o c a s io n e s
 e l m is m o s ó lid o .

     L a fa s e e s ta c io n a ria , p u e d e s e r u n le c h o p la n o
        (C ro m a to g ra fía capa finaao fin a opapel) p a p e l)
         (cromatografía de d e c a p          sobre s o b re
          o d e s a rro lla rs e s o b re u n a c o lu m n a
         CROMATOGRAFIAg ra fía c o lu m n a r )
                (C ro m a to SOBRE COLUMNA
Clasificaciones de cromatografía
• Según el tipo de fase móvil y de fase estacionaria
• Según el formato y la geometría de la fase
  estacionaria
• Según el tipo de interacción entre la fase estacionaria
  y los solutos
• Según el tipo de flujo empleado
• Según el tipo de modificaciones en la fase móvil
• Según el método de detección
• Según la finalidad del experimento


                                                        5
Según el tipo de fase móvil y de fase
            estacionaria



 Fase estacionaria   Fase móvil
                     Líquido
 Sólido
                     Gas
                     Líquido
 Líquido adsorbido
                     Gas


                                        6
Según el formato y la geometría de la fase
              estacionaria



   Fase estacionaria   Formato
   Por ejemplo:        Placa fina
           Sílice      Columna
                       HPLC-NP



                                             7
Según el tipo de interacción entre la fase
       estacionaria y los solutos
  Interacción          Cromatografía
  Carga – carga        Intercambio iónico
                       Fase Normal
  Dipolos
                       Fase Reversa
  Hidrofóbica          Efecto hidrofóbico
  Diversa pero         Afinidad
  específica
  Enlaces covalentes   IMAC

                                             8
Según el tipo de flujo empleado
 Flujo por          Cromatografía
 Gravedad           En columna
 Capilaridad        En papel
                    Capa fina
 Fluido a presión   HPLC
                    Gases




                                    9
Según el tipo de modificaciones en la fase
                  móvil


  Gradiente de:   Polaridad
                  Concentración
                  pH
                  Temperatura




                                         10
Según el método de detección
Detección por
Espectroscopías       IR, UV-Vis,
diversas              Fluorescencia, MS
Propiedades físicas   Índice de refracción
                      Conductividad
                      Ionización
Reactividad           Revelado y
                      derivatización

A tiempo fijo         Rf
A distancia fija      Tiempo de retención
                      Volumen de elución
                                             11
Según la finalidad del experimento

Separación y       Preparativa
purificación
Separación,        Analítica
cuantificación y
caracterización




                                     12
Métodos cromatográficos
 •   De gases
 •   En capa fina
 •   En líquidos inmovilizados
 •   De exclusión molecular
 •   Intercambio iónico
 •   Hidroxiapatita
 •   Hidrofóbica
 •   Afinidad
 •   HPLC
T IP O S D E C R O M A T O G R A F ÍA


      1 A D S O R C IÓ N
        E l re p a rto s e e s ta b le c e d e a c u e rd o c o n e l d ife re n te
        g ra d o d e a d s o rc ió n d e lo s c o m p o n e n te s d e la fa s e
        líq u id a o g a s s o b re u n s ó lid o (fa s e e s ta c io n a ria ).


     2 REPARTO
       L a s e p a ra c ió n tie n e lu g a r p o r re p a rto d e s o lu b ilid a d e s d e
       lo s c o m p o n e n te s d e la fa s e g a s o líq u id a a l a tra v e s a r
       o tra fa s e líq u id a e s ta c io n a ria .

     3 C A M B IO IÓ N IC O
        L o s c o m p o n e n te s d e la fa s e líq u id a e x p e rim e n ta n in te rc a m b io
        ió n ic o c o n la fa s e e s ta c io n a ria ( re s in a s ó lid a )


      4 E X C L U S IÓ N M O L E C U L A R
        L o s c o m p o n e n te s d e la fa s e g a s o líq u id a s e s e p a ra n p o r
        ta m a ñ o m o le c u la r a s u p a s o p o r u n g e l (fa s e e s ta c io n a ria ),
        d e fo rm a q u e lo s s o lu to s d e m a y o r ta m a ñ o p a s a n m a s rá p id a m e n te .


54                                         CROMATOGRAFÍA
¿En qué son distintas las sustancias que deseo
  separar?
1.- Carga eléctrica
2.- Hidrofobicidad superficial
3.- Afinidad por iones metálicos
4.- Afinidad por ligandos específicos
5.- Radio hidrodinámico (tamaño)



                                                 15
A n á lis is C ro m a to g rá fic o


     * L a c ro m a to g ra fía , p e rm ite n o s ó lo s e p a ra r lo s c o m p o n e n te s
      d e u n a m u e s tra , s in ó ta m b ie n s u id e n tific a c ió n y c u a n tific a c ió n .

       A n á lis is c u a lita tiv o

       E s ta b a s a d o e n la m e d id a d e p a rá m e tro s c ro m a to g rá fic o s
            ( tie m p o s y v o lú m e n e s d e re te n c ió n )

        A n á lis is c u a n tita tiv o

        E s tá b a s a d o e n la m e d id a d e a ltu ra s u á re a s d e p ic o s
        c ro m a to g rá fic o s q u e s e re la c io n a n c o n la c o n c e n tra c ió n .


       L a c o lu m n a c ro m a to g rá fic a y la fo rm a c o n la q u e
       s e d is e ñ a , c o n s titu y e e l c o ra z ó n d e la s e p a ra c ió n .

         E l d e te c to r s itu a d o a l fin a l d e la c o lu m n a e s e l
         q u e g a ra n tiz a la re s p u e s ta d e lo s c o m p o n e n te s
         q u e s e s e p a ra n ( lo s h a y d e m u y d iv e rs o s tip o s )

55                                           CROMATOGRAFÍA
T E R M IN O L O G ÍA Y P A R Á M E T R O S C R O M A T O G R Á F IC O S


      E lu y e n te : A s í s e d e n o m in a a la fa s e m ó v il p o rta d o ra d e la m u e s tra


       E lu a to : e s e l té rm in o c o n e l q u e s e d e fin e la s a lid a d e l e lu y e n te



                    ELU YEN TE                                          ELU ATO
                                                 c o lu m n a
                         (e n tra )                                       (s a le )

                                      (p ro c e s o d e E L U C IÓ N


     F lu jo : m id e la v e lo c id a d d e la fa s e m ó v il, s e e x p re s a c o m o g a s to
     e n v o lu m e n ( m l d is o lv e n te /m in u to d e re c o rrid o d e la c o lu m n a )
     o g a s to lin e a l (c m d e re c o rrid o /m in u to )


     C R O M A T O G R A M A : G rá fic a q u e e x p re s a la re s p u e s ta d e l d e te c to r
     e n fu n c ió n d e l tie m p o d e e lu c ió n



56                                           CROMATOGRAFÍA
Análisis cualitativo cromatográfico
Los parámetros cromatográficos que se utilizan en el análisis cualitativo
son dos: tiempo de retención(tR) y volumen de retención (vR)

Procedimiento: ambos parámetros han de ser comparados con los de una
sustancia patrón

Inconvenientes: No se tiene siempre certeza de que ambos parámetros
sean reproducibles, ni aún manteniendo condiciones de trabajo constantes.
Es preferible utilizar valores relativos, en vez de absolutos.


                                                         Bajo condiciones de flujo
                                                         de fase móvil Fc constante:




                                  CROMATOGRAFÍA
62   CROMATOGRAFÍA
63   CROMATOGRAFÍA
64   CROMATOGRAFÍA
65   CROMATOGRAFÍA
INSTRUMENTACIÓN




66      CROMATOGRAFÍA
INSTRUMENTACIÓN




67       CROMATOGRAFÍA
en los dos
       tipos de cromatografía

68   CROMATOGRAFÍA
69   CROMATOGRAFÍA
(CG)




Ejemplos:
        Conductividad térmica ( general-no destructivo)
        Ionización en llama (destructivo)
        Captura electrónica (específico-no destructivo)

70                      CROMATOGRAFÍA
EJEMPLO CG




73   CROMATOGRAFÍA
HPLC




     (Detector de índice de refracción)




74        CROMATOGRAFÍA
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA vs CROMATOGRAFIA DE GASES


     Son al día de hoy dos poderosísimas herramientas de análisis

     Ambas admiten acoplamiento con otras técnicas de detección
     (hibridación de técnicas, por ejemplo con espectrometría de
     masas o plasmas..etc)

     La cromatografía de gases, requiere muestras gaseosas o
     fácilmente volatilizables.

     El resto de muestras que no poseen esas características pueden
     ser analizadas por HPLC.




 Ambas técnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades que
 ofrece la selección de la columna cromatográfica, permiten abordar
 análisis de multicomponentes en muestras de diversa procedencia, con
 elevada precisión y sensibilidad (dependiendo del detector).



76                            CROMATOGRAFÍA

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Cromatografía

  • 1. Fase estacionaria 2 Fase móvil º 1 º º 1
  • 2. Descubridor • El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919)
  • 3. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA. • En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” de los componentes. • Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plástico (ej: acetato) ó metálicos (ej: aluminio). Los tamaños de la placa para CCf convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2. • Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloridos se requerirán técnicas de revelado.
  • 4. M é to d o s C ro m a to g rá fic o s F u n d a m e n to : * S o n m é to d o s e n lo s q u e lo s c o m p o n e n te s d e u n a m e z c la s e v a n re p a rtie n d o d e fo rm a d ife re n c ia d a e n tre d o s fa s e s : u n a m ó v il y o tra e s ta c io n a ria . * L a fa s e m ó v il p u e d e s e r u n g a s (c ro m a to g ra fía d e g a s e s ) o u n líq u id o (c ro m a to g ra fíalíquida) ). (cromatografía líq u id a * L a fa s e e s ta c io n a ria e s g e n e ra lm e n te u n líq u id o , q u e re c u b re la s u p e rfic ie d e p a rtíc u la s s ó lid a s , o e n o c a s io n e s e l m is m o s ó lid o . L a fa s e e s ta c io n a ria , p u e d e s e r u n le c h o p la n o (C ro m a to g ra fía capa finaao fin a opapel) p a p e l) (cromatografía de d e c a p sobre s o b re o d e s a rro lla rs e s o b re u n a c o lu m n a CROMATOGRAFIAg ra fía c o lu m n a r ) (C ro m a to SOBRE COLUMNA
  • 5. Clasificaciones de cromatografía • Según el tipo de fase móvil y de fase estacionaria • Según el formato y la geometría de la fase estacionaria • Según el tipo de interacción entre la fase estacionaria y los solutos • Según el tipo de flujo empleado • Según el tipo de modificaciones en la fase móvil • Según el método de detección • Según la finalidad del experimento 5
  • 6. Según el tipo de fase móvil y de fase estacionaria Fase estacionaria Fase móvil Líquido Sólido Gas Líquido Líquido adsorbido Gas 6
  • 7. Según el formato y la geometría de la fase estacionaria Fase estacionaria Formato Por ejemplo: Placa fina Sílice Columna HPLC-NP 7
  • 8. Según el tipo de interacción entre la fase estacionaria y los solutos Interacción Cromatografía Carga – carga Intercambio iónico Fase Normal Dipolos Fase Reversa Hidrofóbica Efecto hidrofóbico Diversa pero Afinidad específica Enlaces covalentes IMAC 8
  • 9. Según el tipo de flujo empleado Flujo por Cromatografía Gravedad En columna Capilaridad En papel Capa fina Fluido a presión HPLC Gases 9
  • 10. Según el tipo de modificaciones en la fase móvil Gradiente de: Polaridad Concentración pH Temperatura 10
  • 11. Según el método de detección Detección por Espectroscopías IR, UV-Vis, diversas Fluorescencia, MS Propiedades físicas Índice de refracción Conductividad Ionización Reactividad Revelado y derivatización A tiempo fijo Rf A distancia fija Tiempo de retención Volumen de elución 11
  • 12. Según la finalidad del experimento Separación y Preparativa purificación Separación, Analítica cuantificación y caracterización 12
  • 13. Métodos cromatográficos • De gases • En capa fina • En líquidos inmovilizados • De exclusión molecular • Intercambio iónico • Hidroxiapatita • Hidrofóbica • Afinidad • HPLC
  • 14. T IP O S D E C R O M A T O G R A F ÍA 1 A D S O R C IÓ N E l re p a rto s e e s ta b le c e d e a c u e rd o c o n e l d ife re n te g ra d o d e a d s o rc ió n d e lo s c o m p o n e n te s d e la fa s e líq u id a o g a s s o b re u n s ó lid o (fa s e e s ta c io n a ria ). 2 REPARTO L a s e p a ra c ió n tie n e lu g a r p o r re p a rto d e s o lu b ilid a d e s d e lo s c o m p o n e n te s d e la fa s e g a s o líq u id a a l a tra v e s a r o tra fa s e líq u id a e s ta c io n a ria . 3 C A M B IO IÓ N IC O L o s c o m p o n e n te s d e la fa s e líq u id a e x p e rim e n ta n in te rc a m b io ió n ic o c o n la fa s e e s ta c io n a ria ( re s in a s ó lid a ) 4 E X C L U S IÓ N M O L E C U L A R L o s c o m p o n e n te s d e la fa s e g a s o líq u id a s e s e p a ra n p o r ta m a ñ o m o le c u la r a s u p a s o p o r u n g e l (fa s e e s ta c io n a ria ), d e fo rm a q u e lo s s o lu to s d e m a y o r ta m a ñ o p a s a n m a s rá p id a m e n te . 54 CROMATOGRAFÍA
  • 15. ¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar? 1.- Carga eléctrica 2.- Hidrofobicidad superficial 3.- Afinidad por iones metálicos 4.- Afinidad por ligandos específicos 5.- Radio hidrodinámico (tamaño) 15
  • 16. A n á lis is C ro m a to g rá fic o * L a c ro m a to g ra fía , p e rm ite n o s ó lo s e p a ra r lo s c o m p o n e n te s d e u n a m u e s tra , s in ó ta m b ie n s u id e n tific a c ió n y c u a n tific a c ió n . A n á lis is c u a lita tiv o E s ta b a s a d o e n la m e d id a d e p a rá m e tro s c ro m a to g rá fic o s ( tie m p o s y v o lú m e n e s d e re te n c ió n ) A n á lis is c u a n tita tiv o E s tá b a s a d o e n la m e d id a d e a ltu ra s u á re a s d e p ic o s c ro m a to g rá fic o s q u e s e re la c io n a n c o n la c o n c e n tra c ió n . L a c o lu m n a c ro m a to g rá fic a y la fo rm a c o n la q u e s e d is e ñ a , c o n s titu y e e l c o ra z ó n d e la s e p a ra c ió n . E l d e te c to r s itu a d o a l fin a l d e la c o lu m n a e s e l q u e g a ra n tiz a la re s p u e s ta d e lo s c o m p o n e n te s q u e s e s e p a ra n ( lo s h a y d e m u y d iv e rs o s tip o s ) 55 CROMATOGRAFÍA
  • 17. T E R M IN O L O G ÍA Y P A R Á M E T R O S C R O M A T O G R Á F IC O S E lu y e n te : A s í s e d e n o m in a a la fa s e m ó v il p o rta d o ra d e la m u e s tra E lu a to : e s e l té rm in o c o n e l q u e s e d e fin e la s a lid a d e l e lu y e n te ELU YEN TE ELU ATO c o lu m n a (e n tra ) (s a le ) (p ro c e s o d e E L U C IÓ N F lu jo : m id e la v e lo c id a d d e la fa s e m ó v il, s e e x p re s a c o m o g a s to e n v o lu m e n ( m l d is o lv e n te /m in u to d e re c o rrid o d e la c o lu m n a ) o g a s to lin e a l (c m d e re c o rrid o /m in u to ) C R O M A T O G R A M A : G rá fic a q u e e x p re s a la re s p u e s ta d e l d e te c to r e n fu n c ió n d e l tie m p o d e e lu c ió n 56 CROMATOGRAFÍA
  • 18. Análisis cualitativo cromatográfico Los parámetros cromatográficos que se utilizan en el análisis cualitativo son dos: tiempo de retención(tR) y volumen de retención (vR) Procedimiento: ambos parámetros han de ser comparados con los de una sustancia patrón Inconvenientes: No se tiene siempre certeza de que ambos parámetros sean reproducibles, ni aún manteniendo condiciones de trabajo constantes. Es preferible utilizar valores relativos, en vez de absolutos. Bajo condiciones de flujo de fase móvil Fc constante: CROMATOGRAFÍA
  • 19. 62 CROMATOGRAFÍA
  • 20. 63 CROMATOGRAFÍA
  • 21. 64 CROMATOGRAFÍA
  • 22. 65 CROMATOGRAFÍA
  • 23. INSTRUMENTACIÓN 66 CROMATOGRAFÍA
  • 24. INSTRUMENTACIÓN 67 CROMATOGRAFÍA
  • 25. en los dos tipos de cromatografía 68 CROMATOGRAFÍA
  • 26. 69 CROMATOGRAFÍA
  • 27. (CG) Ejemplos: Conductividad térmica ( general-no destructivo) Ionización en llama (destructivo) Captura electrónica (específico-no destructivo) 70 CROMATOGRAFÍA
  • 28. EJEMPLO CG 73 CROMATOGRAFÍA
  • 29. HPLC (Detector de índice de refracción) 74 CROMATOGRAFÍA
  • 30. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA vs CROMATOGRAFIA DE GASES Son al día de hoy dos poderosísimas herramientas de análisis Ambas admiten acoplamiento con otras técnicas de detección (hibridación de técnicas, por ejemplo con espectrometría de masas o plasmas..etc) La cromatografía de gases, requiere muestras gaseosas o fácilmente volatilizables. El resto de muestras que no poseen esas características pueden ser analizadas por HPLC. Ambas técnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades que ofrece la selección de la columna cromatográfica, permiten abordar análisis de multicomponentes en muestras de diversa procedencia, con elevada precisión y sensibilidad (dependiendo del detector). 76 CROMATOGRAFÍA