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Área de Biotecnología de la
                     Reproducción Animal
                    Facultad de Veterinaria
                              2011


Área Biotecnología de la Reproducción – Departamento de Reproducción Animal
Fertilización In Vitro en bovinos
Fertilización In Vitro en bovinos
   1989: primeros terneros nacidos por FIV en
    Latinoamérica… (amplia difusión)
Fertilización In Vitro en bovinos
Pronúcleos masculino y femenino
Día         Etapas
Semana      Preparación del laboratorio           Desinfección de superficies;
previa al                                         esterilización de materiales; preparación
trabajo                                           de soluciones stock
0           Colecta de ovarios                    Transporte en solución salina a 37ºC
            Aspiración de los COC (Complejos      Medio de aspiración: Solución m-PBS
            ovocito cúmulus)                      (Buffer Fosfato Salino modificado: D-PBS
                                                  (+) + SFb + Atb)

            Recuperación y clasificación de los   Bajo lupa estereoscópica
            COC
            Maduración In Vitro                   Medio de maduración: TCM-199 + SFb +
                                                  LFb + Atb
1           Capacitación del semen y dilución     Medio BO de capacitación y lavado de
                                                  semen; medio BO de dilución de semen
                                                  (ajuste a concentración deseada)
            Fecundación In Vitro                  Gotas en placas de Petri pequeñas
            Desarrollo In Vitro                   Medio de desarrollo: CR1aa
3           Clivaje                               Evaluación de división celular a las 48 hs
4 - 10      Evaluación de desarrollo y cambio     Cada 48 horas
            de medio
   De animales muertos: material de matadero o
    hembras recién muertas
       Aspiración del líquido folicular (folículos de 2 a 8 mm
        de diámetro)
       Desmenuzamiento del ovario (slicing)
   De hembras vivas
       OPU, aspiración con aguja guiada por ultrasonografía
       Aspiración con aguja y endoscopía
       Laparotomía (usada sólo en casos especiales)
Folículo
            primordial

                         Folículo   Folículo           Folículo
            Folículo
                         Secundario Terciario          de Graaf
            primario



Túnica
albugínea


Epitelio
                                                                  Corpus
germinal
                                                                  albicans

                                                                  Folículo
                                                                  atrésico


                            Hilio
            Cuerpo                              Células
            lúteo                               intersticiales
P   PM   S       T   T   PO




P        PM       S       T
PO
   m-PBS: Buffer Fosfato Salino modificado
       Consiste en:
         D-PBS (+) – solución stock
         Penicilina – Estreptomicina
         SFb (suero fetal bovino)




COMPOSICIÓN DEL MEDIO PBS:
NaCl             8,00    g/l
KCl              0,20    g/l
KH2PO4           0,20    g/l
Na2HPO4          1,15    g/l
MgCl26H2O        0,10    g/l
CaCl2            0,10    g/l
Fertilización In Vitro en bovinos
Fertilización In Vitro en bovinos
Fertilización In Vitro en bovinos
Fertilización In Vitro en bovinos
Fertilización In Vitro en bovinos
Calidad      Características a evaluar


A   Bueno        Completamente rodeado por más de 3 capas de
                 células del cúmulus y citoplasma homogéneo


B   Regular      Rodeado parcialmente por células del cúmulus


C   Malo         Desnudo y citoplasma irregular


D   Degenerado   Rodeado por fibrina (con aspecto de tela de araña)


                               (Liebfried L and First N L, 1979; Sato E y col, 1990)
Fertilización In Vitro en bovinos
   Medio de maduración: M-TCM-199
                     (TCM-199 de maduración)
        Consiste en:
          TCM-199 (solución stock)
          Penicilina – Estretomicina
          SFb (suero fetal bovino)
          LFb (licor folicular bovino)



LFb: se obtiene de folículos preovulatorios, de más de 8 mm de diámetro, y se
transfiere a tubos de centrifuga. Se centrifuga a 800 G (2.500 rpm) durante 30
minutos. Se decanta. El liquido sobrenadante se inactiva en baño Maria a 56 ºC
durante 30 minutos; se fracciona en tubos pequeños o crioviales y se almacena
congelado.
m-PBS   m-PBS              M-TCM-199    M-TCM-199
                                                      GOTAS DE
                                                     MADURACIÓN
                                                      M-TCM-199
                                                    CUBIERTAS CON
                                                        ACEITE
                                                       MINERAL


                                22 hs
                                cultivo

                Caja de Petri numerada con gotas de maduración,
                 cubiertas con aceite mineral (3 gotas de 100 µ)
Fertilización In Vitro en bovinos
   Preparación citoplasmática
   Preparación nuclear
       Retoma la meiosis. Desde Profase I (estado de
        latencia, Dictioteno), se detiene nuevamente en la
        Metafase II.
       Formación del primer cuerpo polar
   Expansión de las células del cúmulus
Ovocito Primario  Profase de la Meiosis I
              (pausa = dictioteno)

     Maduración citoplasmática y nuclear

Ovocito Secundario  Metafase de la Meiosis II

                 Fertilización

             Completa la Meiosis
Ovocitos inmaduros




                     •OVOCITOS MADUROS
                     •Expansión de células del
                     cúmulus
                     • 1º cuerpo polar
                     • Metafase II
Fertilización In Vitro en bovinos
   La capacitación permite:
       Adquirir hipermotilidad para avanzar por el mucus
        oviductal
       Penetrar el cúmulus
       Prepararse para la reacción acrosómica
   Bioquímica de la capacitación:
     Aumento del pH
     Aumento de la permeabilidad al calcio
     Fusión de membranas
     Interacciones con glucosaminoglicanos
     Cambio en la relación colesterol/fosfolíidos
   Ornitina-decarboxilasa
   Fosfolipasa A
   Fosfolipasa C
   L-Fucosidasa
   -Galactosidasa
   -Glucoronidasa
   Hialuronidasa
   Peptil-peptidasa
   -N-acetilhexosaminidasa
   Acrosina
   Arilaminidasa
   Colagenasa
   Proacrosina
   Neuroaminidasa
   Estearasas
   Fosfatasas
Fertilización In Vitro en bovinos
Fertilización In Vitro en bovinos
COMPOSICIÓN DE SOLUCIÓN BÁSICA BO (Bracket and Oliphant):

   Solución A
   NaCl               2,1546 g     Solución B
   KCl                0,0987 g     NaHCO3         1,2937 g
   Na2PO42H2O         0,0420 g     Rojo Fenol     20 µl
   MgCl26H2O          0,03485 g    Agua ultrapura hasta 100 ml
   CaCl22H2O          0,1085 g
   Rojo Fenol (0,5%) 50 µl         La solución B se burbujea con CO2
   Agua ultrapura hasta 500 ml


COMPOSICIÓN DEL MEDIO BO:
   Solución A          76 ml
   Piruvato de Sodio   0,01375 g
   Penicilina          10.000 UI
   Estreptomicina      10 mg
   Solución B          24 ml
   Lavado de semen
       BO + Cafeína + Heparina


   Lavado de ovocitos
       BO + BSA (albúmina de suero bovino) (10 mg/ml)


   Dilución de semen
       BO + BSA (20 mg/ml)
   Platina caliente (35 ºC) y Baño María (35 ºC)
   Descongelación de la pajuela de semen:
       10 seg. a temp. ambiente
       30 seg. a baño María (35 ºC)
   Colocar el semen en tubo de centrífuga (gota en portaobjetos -sobre la platina-
    para evaluación)
   Se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen
   Centrifugar a 500 G (2000 rpm, dependiendo del diámetro de la centrífuga), 5
    min.
   Aspirar sobrenadante
   Nuevamente se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen
   Centrifugar a 500, 5 min.
   Aspirar sobrenadante
   Diluir el pellet en sol. BO de dilución de semen
    Vol i x [ i ] = Vol f
        [f]
PREPARACIÓN DEL SEMEN
                            Remover la capa superior     Agregar 6 ml de BO de
                                                         lavado de semen y re-
                                                         centrifugar a 500 G, 5 min.




6 ml sol BO
de lavado
de semen
                                                          Luego de 2 lavados
     Semen                                                retirar sobrenadante
     (0,5 ml)                                             y dejar pellet




                                               Capa espermática




    Cámara de Neubauer (calcular concentración)
DILUCIÓN DE SEMEN Y
PREPARACIÓN DE GOTAS DE INSEMINACIÓN

                              Gotas de inseminación
                              100 µl de espermios en BO
                              cubiertas con aceite mineral
        Agregar BO
        de dilución
        de semen
        (Vol.
        calculado)




                                              FECUNDACIÓN

          Vol i x [ i ] = Vol f
              [f]                              Incubación 5 h
1


C                   2
    1

                        2


        3                   3
            4




                                Incubación 5 h
                                   5% CO2
                                    38 ºC
BO 40 ml + BSA 400 mg


            Lavado
                                         Al medio de inseminación
                                         (BO) en las gotas de semen
                          Lavado         cubierto por aceite mineral




               BO + BSA

                              BO + BSA




                                                  5 hs
                                                  cultivo
FECUNDACIÓN
TCM 199 + 5 % SFb + ANTIBIÓTICOS

                                        cultivo

            Lavado



                         Lavado
                                       Al medio de cultivo
BO                                     (TCM-199) cubierto
                                       por aceite mineral

              TCM-199

                             TCM-199
Fertilización In Vitro en bovinos
1 célula             2 células              4 células
                                                                      16 células
 día 0-1                día 2                 día 2-3    1 célula      día 4-5
                                                         día 0-1




 8 células           16 células      Mórula temprana                   Mórula
                                                         2 células    compacta
  día 2-4             día 4-5            día 5-6
                                                           día 2       día 6-7




Mórula compacta   Blastocisto temprano     Blastocisto                Blastocisto
                                                         4 células    temprano
    día 6-7               día 7              día 7-8
                                                          día 2-3        día 7




                                                          8 células   Blastocisto
  Blastocisto       Blastocisto           Blastocisto
                                                           día 2-4      día 7-8
  expandido        eclosionando          eclosionado
    día 8-9            día 9                día 10
Fertilización In Vitro en bovinos
Fertilización In Vitro en bovinos
Fertilización In Vitro en bovinos
¿POR QUÉ?
¿PARA QUÉ?
¿CON QUÉ?
Fertrilización In
Vitro en Bovinos



          Área de Biotecnología de la
             Reproducción Animal
           Facultad de Veterinaria
                     2011


                              Yael Filipiak
                              Clara Larocca

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Fertilización In Vitro en bovinos

  • 1. Área de Biotecnología de la Reproducción Animal Facultad de Veterinaria 2011 Área Biotecnología de la Reproducción – Departamento de Reproducción Animal
  • 4. 1989: primeros terneros nacidos por FIV en Latinoamérica… (amplia difusión)
  • 7. Día Etapas Semana Preparación del laboratorio Desinfección de superficies; previa al esterilización de materiales; preparación trabajo de soluciones stock 0 Colecta de ovarios Transporte en solución salina a 37ºC Aspiración de los COC (Complejos Medio de aspiración: Solución m-PBS ovocito cúmulus) (Buffer Fosfato Salino modificado: D-PBS (+) + SFb + Atb) Recuperación y clasificación de los Bajo lupa estereoscópica COC Maduración In Vitro Medio de maduración: TCM-199 + SFb + LFb + Atb 1 Capacitación del semen y dilución Medio BO de capacitación y lavado de semen; medio BO de dilución de semen (ajuste a concentración deseada) Fecundación In Vitro Gotas en placas de Petri pequeñas Desarrollo In Vitro Medio de desarrollo: CR1aa 3 Clivaje Evaluación de división celular a las 48 hs 4 - 10 Evaluación de desarrollo y cambio Cada 48 horas de medio
  • 8. De animales muertos: material de matadero o hembras recién muertas  Aspiración del líquido folicular (folículos de 2 a 8 mm de diámetro)  Desmenuzamiento del ovario (slicing)  De hembras vivas  OPU, aspiración con aguja guiada por ultrasonografía  Aspiración con aguja y endoscopía  Laparotomía (usada sólo en casos especiales)
  • 9. Folículo primordial Folículo Folículo Folículo Folículo Secundario Terciario de Graaf primario Túnica albugínea Epitelio Corpus germinal albicans Folículo atrésico Hilio Cuerpo Células lúteo intersticiales
  • 10. P PM S T T PO P PM S T PO
  • 11. m-PBS: Buffer Fosfato Salino modificado  Consiste en:  D-PBS (+) – solución stock  Penicilina – Estreptomicina  SFb (suero fetal bovino) COMPOSICIÓN DEL MEDIO PBS: NaCl 8,00 g/l KCl 0,20 g/l KH2PO4 0,20 g/l Na2HPO4 1,15 g/l MgCl26H2O 0,10 g/l CaCl2 0,10 g/l
  • 17. Calidad Características a evaluar A Bueno Completamente rodeado por más de 3 capas de células del cúmulus y citoplasma homogéneo B Regular Rodeado parcialmente por células del cúmulus C Malo Desnudo y citoplasma irregular D Degenerado Rodeado por fibrina (con aspecto de tela de araña) (Liebfried L and First N L, 1979; Sato E y col, 1990)
  • 19. Medio de maduración: M-TCM-199 (TCM-199 de maduración)  Consiste en:  TCM-199 (solución stock)  Penicilina – Estretomicina  SFb (suero fetal bovino)  LFb (licor folicular bovino) LFb: se obtiene de folículos preovulatorios, de más de 8 mm de diámetro, y se transfiere a tubos de centrifuga. Se centrifuga a 800 G (2.500 rpm) durante 30 minutos. Se decanta. El liquido sobrenadante se inactiva en baño Maria a 56 ºC durante 30 minutos; se fracciona en tubos pequeños o crioviales y se almacena congelado.
  • 20. m-PBS m-PBS M-TCM-199 M-TCM-199 GOTAS DE MADURACIÓN M-TCM-199 CUBIERTAS CON ACEITE MINERAL 22 hs cultivo Caja de Petri numerada con gotas de maduración, cubiertas con aceite mineral (3 gotas de 100 µ)
  • 22. Preparación citoplasmática  Preparación nuclear  Retoma la meiosis. Desde Profase I (estado de latencia, Dictioteno), se detiene nuevamente en la Metafase II.  Formación del primer cuerpo polar  Expansión de las células del cúmulus
  • 23. Ovocito Primario  Profase de la Meiosis I (pausa = dictioteno) Maduración citoplasmática y nuclear Ovocito Secundario  Metafase de la Meiosis II Fertilización Completa la Meiosis
  • 24. Ovocitos inmaduros •OVOCITOS MADUROS •Expansión de células del cúmulus • 1º cuerpo polar • Metafase II
  • 26. La capacitación permite:  Adquirir hipermotilidad para avanzar por el mucus oviductal  Penetrar el cúmulus  Prepararse para la reacción acrosómica  Bioquímica de la capacitación:  Aumento del pH  Aumento de la permeabilidad al calcio  Fusión de membranas  Interacciones con glucosaminoglicanos  Cambio en la relación colesterol/fosfolíidos
  • 27. Ornitina-decarboxilasa  Fosfolipasa A  Fosfolipasa C  L-Fucosidasa  -Galactosidasa  -Glucoronidasa  Hialuronidasa  Peptil-peptidasa  -N-acetilhexosaminidasa  Acrosina  Arilaminidasa  Colagenasa  Proacrosina  Neuroaminidasa  Estearasas  Fosfatasas
  • 30. COMPOSICIÓN DE SOLUCIÓN BÁSICA BO (Bracket and Oliphant): Solución A NaCl 2,1546 g Solución B KCl 0,0987 g NaHCO3 1,2937 g Na2PO42H2O 0,0420 g Rojo Fenol 20 µl MgCl26H2O 0,03485 g Agua ultrapura hasta 100 ml CaCl22H2O 0,1085 g Rojo Fenol (0,5%) 50 µl La solución B se burbujea con CO2 Agua ultrapura hasta 500 ml COMPOSICIÓN DEL MEDIO BO: Solución A 76 ml Piruvato de Sodio 0,01375 g Penicilina 10.000 UI Estreptomicina 10 mg Solución B 24 ml
  • 31. Lavado de semen  BO + Cafeína + Heparina  Lavado de ovocitos  BO + BSA (albúmina de suero bovino) (10 mg/ml)  Dilución de semen  BO + BSA (20 mg/ml)
  • 32. Platina caliente (35 ºC) y Baño María (35 ºC)  Descongelación de la pajuela de semen:  10 seg. a temp. ambiente  30 seg. a baño María (35 ºC)  Colocar el semen en tubo de centrífuga (gota en portaobjetos -sobre la platina- para evaluación)  Se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen  Centrifugar a 500 G (2000 rpm, dependiendo del diámetro de la centrífuga), 5 min.  Aspirar sobrenadante  Nuevamente se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen  Centrifugar a 500, 5 min.  Aspirar sobrenadante  Diluir el pellet en sol. BO de dilución de semen Vol i x [ i ] = Vol f [f]
  • 33. PREPARACIÓN DEL SEMEN Remover la capa superior Agregar 6 ml de BO de lavado de semen y re- centrifugar a 500 G, 5 min. 6 ml sol BO de lavado de semen Luego de 2 lavados Semen retirar sobrenadante (0,5 ml) y dejar pellet Capa espermática Cámara de Neubauer (calcular concentración)
  • 34. DILUCIÓN DE SEMEN Y PREPARACIÓN DE GOTAS DE INSEMINACIÓN Gotas de inseminación 100 µl de espermios en BO cubiertas con aceite mineral Agregar BO de dilución de semen (Vol. calculado) FECUNDACIÓN Vol i x [ i ] = Vol f [f] Incubación 5 h
  • 35. 1 C 2 1 2 3 3 4 Incubación 5 h 5% CO2 38 ºC
  • 36. BO 40 ml + BSA 400 mg Lavado Al medio de inseminación (BO) en las gotas de semen Lavado cubierto por aceite mineral BO + BSA BO + BSA 5 hs cultivo
  • 38. TCM 199 + 5 % SFb + ANTIBIÓTICOS cultivo Lavado Lavado Al medio de cultivo BO (TCM-199) cubierto por aceite mineral TCM-199 TCM-199
  • 40. 1 célula 2 células 4 células 16 células día 0-1 día 2 día 2-3 1 célula día 4-5 día 0-1 8 células 16 células Mórula temprana Mórula 2 células compacta día 2-4 día 4-5 día 5-6 día 2 día 6-7 Mórula compacta Blastocisto temprano Blastocisto Blastocisto 4 células temprano día 6-7 día 7 día 7-8 día 2-3 día 7 8 células Blastocisto Blastocisto Blastocisto Blastocisto día 2-4 día 7-8 expandido eclosionando eclosionado día 8-9 día 9 día 10
  • 45. Fertrilización In Vitro en Bovinos Área de Biotecnología de la Reproducción Animal Facultad de Veterinaria 2011  Yael Filipiak  Clara Larocca