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  • 1. PRESENTA: K. GEOVANNA ZEVALLOS QUISPE MR1 PATOLOGÍA CLÍNICA Equipo Automatizado de Amplificación de Ácido Nucleico (PCR)
  • 5. La retrotranscripción es una reacción para la conversión del ARN en ADNc y en general se lleva a cabo antes de una PCR, cuando se pretende analizar secuencias de ARN. Transcripción reversa (RT-qPCR)
  • 6. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA Es una prueba molecular de diagnóstico que permite detectar un fragmento del material genético de un patógeno
  • 7. Metodología que se basa en la amplificación e hibridación simultánea del producto amplificado con sondas complementarias marcadas con fluorescencia. Ello permite visualizar el resultado a tiempo real, a través de un grafico donde se observa el grado de fluorescencia emitida, en función de la ausencia/presencia y cantidad de ADN de M. tuberculosis complex existente en la reacción. PCR EN TIEMPO REAL
  • 10. Tecnología de sondas con señales luminosas Secuencia diana Espaciador Fluoróforo Supresor
  • 11. GÉNERO MYCOBACTERIUM ● 165 Especies ● Crecimeinto lento, aerobios 0.2-0.6 um, bacilar recta, no esporulado ○ M. tuberculosis complex ○ M. leprae ● Se tiñe con método Zielh Neelsen Cepa susceptible a todos los medicamentos de primera línea contra la TB Genoma circular que contiene 3924 genes con alto contenido de guanina y citosina (65.6 %)
  • 13. Resistencia a la rifampicina • Mutación relacionada con la R es de 1 x 1.000,000-10,000,000 • La diana ( 95-98% ) de los casos de resistencia es el gen ropB • Sustituciones concentradas en la región core o RRDR (rifampin resistance determining región), constituida por 81 pb (codón 507-533) • La mayoría de cepas resistentes a la R, lo son también a la H • “Marcador de tuberculosis MDR”
  • 14. Las mutaciones en el aminoácido H526P/D/Y y S531L afectan al 60-86% de las cepas resistentes a rifampicina
  • 16. PLATAFORMA Xpert MTB/RIF El ensayo Xpert MTB/RIF, es una plataforma de PCR en tiempo real automatizada, integrada y semicuantitativa, que utiliza la plataforma GeneXpert (Cepheid). Esta prueba identifica el Complejo Mycobacterium tuberculosis y detecta mutaciones más frecuentes en el gen rpoβ asociadas a resistencia a rifampicina (RIF), directo de muestras de pacientes.
  • 21. Fecha caducada Cartucho húmedo Tapa rota o abierta Caída o sacudida Paquete abierto mas de 6 semanas
  • 24. MUESTRA DE ESPUTO ADECUADA MUCO-PURULENTO MUCOIDE SALIVA HEMOPTOÍCA • Frasco estéril, transparente, descartable, boca ancha y tapa rosca • Datos de correspondientes a solicitud • Cantidad minima de muestra: 1 ml Las muestras deben refrigerarse a 2-8°C durante un máximo de 10 días. – Si es necesario, las muestras pueden almacenarse como máximo a 35°C hasta 3 días y después pueden refrigerarse a 2-8°C por una duración combinada de hasta 10 días
  • 31. MTB no detectado Resultado negativo • Cada cartucho incluye un Control de procesamiento de la muestra (SPC) que contiene esporas no infecciosas en la forma de una torta de esporas secas, para verificar el procesamiento adecuado de MTB. • Verifica que ocurrió la lisis de MTB • Verifica si el procesamiento de la muestra fue adecuado • Detecta inhibidores, asociados a la muestra, en la prueba de PCR en tiempo real • SPC debe ser positivo en una muestra en que el resultado es MTB No detectado
  • 32. MTB detectado Resistencia a RIF no detectada
  • 34. MTB detectado Resistencia a RIF indeterminado
  • 35. INFORME DE RESULTADOS No descarta diagnostico, se debe esperar resultado de cultivo “Iniciar tratamiento” Repetir el examen
  • 38. DIARIA Desechar cartuchos usador Limpieza área de trabajo SEMANAL Limpieza del interior del compartimiento del cartucho MENSUAL Limpieza de varilla del émbolo dela jeringa Limpieza de las superficies de los instrumentos Limpieza de óptica dentro del tubo de PCR Limpiar filtros de ventilador
  • 39. ● Retire y deseche los cartuchos de forma adecuada ● Limpiar y desinfectar el área de trabajo ● Garantizar un espacio libre de 10 cm alrededor del equipo ● Colocar una capa protectora cuando no se esté utilizando el equipo MANTENIMIENTO DIARIO
  • 40. MANTENIMIENTO SEMANAL ● Desinfectar el interior del compartimiento de cartuchos ● Reiniciar el instrumento GeneXpert y el computador
  • 42. ● Aflojar los 4 tornillos de la parte gris trasera del equipo GeneXpert
  • 43. MANTENIMIENTO ANUAL ● Calibración cada año o cada 2000 pruebas de cada módulo del equipo
  • 45. CONTROL DE CALIDAD SPC Confirma que la muestra se proceso adecuadamente Contiene esporas no infecciosas en cada cartucho Actúa como control positivo interno PCC, QC1, QC2 Mide señal de fluorescencia de sondas QC1 y QC2 (1°) Sondas rop B y SPC (2°) Monitoriza llenado de tubo de la reacción, integridad de las sondas, estabilidad de los fluorocromos La prueba de Xpert MTB/RIF es un sistema de microfluidos integrado compuesto por el equipo GeneXpert, cartuchos de prueba Xpert MTB / RIF, un protocolo automatizado (amplificación de ADN y la detección simultánea de la fluorescencia) con los controles internos (CPC y SPC)

Notas del editor

  1. Los ácidos nucleicos constituyen el material genético de los organismos y son necesarios para el almacenamiento y la expresión de la información genética. Existen dos tipos de ácidos nucleicos química y estructuralmente distintos: el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) El ADN funciona como el almacén de la información genética . El ARN interviene en la transferencia de la información contenida en el ADN hacia los compartimientos celulares. Pentosa: ribosa y desoxirribosa. Diferencia conformacional: presencia de grupo hidroxilo en el carbono dos. ARN (agtc), ADN(AGCU) Union de nucleótidos : enlaces fosfodiester Union de las dos hebras por enlacen de hidrogeno Cadena doble de polidesoxirribonucleotidos, antiparalela, complementaria forma un giro helicoidal o levogiro
  2. El proceso de replicación necesita, en primera instancia, que las dos cadenas del ADN se separen. Para esto, la helicasa se unirá a la cadena de ADN e hidrolizará los puentes de hidrógeno. La apertura de la doble hélice hace que las cadenas simples adquieran inestabilidad, que se compensa por la unión de proteínas estabilizadoras RPA. La ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis a partir de los desoxirribonucleótidos libres; por lo tanto, necesita que la primasa sintetice un cebador, a partir del cual la ADN polimerasa incorporará los nucleótidos en forma complementaria a las bases de la cadena patrón ADN polimerasa añade nucleótidos uno por uno complementarios a la cadena molde, a medida que avanza la horquilla, ayudada por PCNA. Una vez presente la maquinaria de inicio de la replicación, la horquilla avanza, aumentando la tensión por delante de la cadena. Para evitar que esta tensión impida el avance de la horquilla, las topoisomerasas (I y II) cortarán los enlaces fosfodiéster de la doble hélice y volverán a unirla, lo que permitirá que se desenrolle una vuelta si actúa la topoisomerasa I y dos si lo hace la topoisomerasa II. El final de la replicación se produce cuando la ADN polimerasa δ llega al extremo del fragmento de ADN. Se produce entonces el desacoplamiento de todo el replisoma y la finalización de la replicación. y requiere la eliminación de los cebadores, la elongación del fragmento de ADN adyacente para rellenar el espacio que quedó por la eliminación del cebador y la unión de los extremos resultantes para formar una cadena continua.
  3. 1. ARN molde, el que convertiremos en ADNc 2. Por acción de los primers (hexámeros formados por secuencias aleatorias de 6 nucleoticos. 3. Estos hexámeros hibridaran secuencias complementarias, localizados en los ARN presentes en la muestra 4. Con acción de un inhibidor ARNsas (componente enzimático) impide la acción enzimática Los dNTP (A-G-C-T) sintetizaran cadenas de ADNc
  4. ADN POLIMERASA: enzima encargada de la replicaion una nueva cadena de ADN tomando como molde otra ya existente, ya que el pcr implica cambios de temperatura durante el proceso de replicación . Taq Polimerasa: Proviene de una bacteria Thermus aquaticus, enzima termoestable, necesaria ya que durante la desnaturalización del ADN , ya que sobrevive a la temperatura de desnaturalización de 95 ° C , alineacion (50 °) y extensión a 72 ° PRIMERS o “iniciadores”: Función es proporcionar un extremo 3 libre para poder añadir nucleótidos, a partir de ello la adn polimerasa inicia la polimerizacion El termociclador eleva y baja la temperatura del bloque en tres etapas básicas preprogramadas
  5. Cepa: Son microorganismos del tipo fenotípico que representan una proporción derivada de un organismo mayor, como una muestra de estudio
  6. Mutaciones determinan un cambio conformacional en la subunidad ribosomal y por tanto disminuye la afinidad del fármaco por su diana
  7. Las mutaciones en la región del gen rpoB, llamada RRDR por sus siglas en inglés (RIF-resistance-determining región) contiene 81 pb. Esta región codifica para la secuencia de aminoácidos 507-533
  8. Tiene como principal ventaja resultados en menos de 2 hrs , sin embargo los plazos están determinados por diversos factores ajenos a la prueba (recurso humano, almacenamiento, transporte ) Un examen positivo de una muestra de esputo con resistencia a rifampicina es especialmente relevante, pues la muestra debe repetirse, por lo que implica ubicar rápidamente a ese paciente y enviar la segunda muestra al laboratorio.
  9. Fase inicial: entre los primeros 10-15 ciclos, la fluorescencia es insuficiente para lograr discriminar el ruido basal, esta fase sirve para delimitar la línea base (ver más adelante). En la fase geométrica, los reactivos de la reacción se encuentran de forma abundante por lo que la amplificación por la PCR tiene una eficiencia cercana al 100%. En esta fase de la cinética de amplificación, el comportamiento del ADN es 2n , es decir, a partir de cada molécula del ADN se generan dos, por lo que el producto de la PCR se duplica después de cada uno de los ciclos. La fase lineal comprende el momento en que los reactivos empiezan a ser limitantes en la reacción y se presenta un decaimiento de la actividad enzimática. La eficiencia de la amplificación es inconstante durante esta fase. La fase meseta muestra una señal saturada. La amplificación se detiene debido a que los componentes de la reacción se agotaron. En ésta, la cantidad de producto obtenida es constante aunque se incremente el número de ciclos. El Ct, del inglés cycle threshold, equivale al número de ciclos necesarios para que cada curva alcance un umbral en la señal de fluorescencia. permite calcular la diferencia en la cantidad inicial de las moléculas del ADN o ADNc específico que se desea evaluar, ya que mientras mayor cantidad del ADN blanco haya en una muestra, menor el número de ciclos (Ct) que se requiere para alcanzar este umbral. el Ct es un valor directamente proporcional a la cantidad inicial del ADN blanco y a partir de este valor se puede calcular la cantidad del ARNm o del ADN. El valor de Ct puede ser asignado de manera automática por el Software del equipo mediante diferentes algoritmos o bien se puede asignar de forma manual
  10. Cada prueba Xpert MTB/RIF incluye un control de procesamiento de la muestra (SPC). SPC: confirma que la muestra se procesó correctamente. El SPC contiene esporas no infecciosas desecadas formando una pastilla que se incluye en cada cartucho para comprobar el procesamiento adecuado de MTB. El SPC confirma la lisis de MTB en presencia de microorganismos y comprueba además si el procesamiento de la muestra ha sido correcto. Además, este control también detecta la inhibición asociada a la muestra del ensayo de PCR en tiempo real. El SPC debe ser positivo en una muestra negativa, y puede ser negativo o positivo en una muestra positiva. El resultado de la prueba será «no válido» si el SPC no se detecta en una prueba negativa.
  11. Sonda PCC: Cada prueba Xpert MTB/RIF posee el control de comprobación de la sonda (PCC, por sus siglas en inglés), la cual comprueba la rehidratación de los reactivos, el llenado del tubo de PCR en el cartucho, la integridad de la sonda y la estabilidad del colorante